铅对大鼠不同脑区IEG表达的影响*
作者：李国君 吴德生 肖邦良 李杰平 卢军 王文冬
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：即刻早期基因；铅；神经毒理
卫生研究/990201 摘要 为了研究即刻早期基因(IEG)在铅的神经毒性机制中的作用，本实验应用FOS和JUN蛋白免疫组织化学方法对腹腔注射染铅13mg/kg及130mg/kg的大鼠不同脑区c-fos、c-jun表达水平进行了观察。图像分析及统计检验结果表明，急性染铅2小时后，大鼠脑组织皮层、海马CA3区及小脑的c-fos、c-jun表达的阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度或阳性细胞个数等参数与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，即染铅组IEG表达高于对照组。这一结果提示第三信使IEG作为转录调控因子可能参与了铅对学习记忆损害的神经毒性过程。这对深入阐明铅神经毒性的分子机制提供了一定的实验依据。
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中图分类号 Q593.2 X503.22 O614.433
Effect of lead on the expression of immediate early genes
in different regions of rat brain
Li Guojun, Wu Desheng, Xiao Bangliang, Li Jieping et al.
Department of Environmental Health, School of Public Health, West China
University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China
, 百拇医药
In order to study the role of immediate early genes (IEG) in the neurotoxic mechanism of lead, expression of c-fos and c-jun genes in different regions of rat brain treated with lead (13 and 130 mg/kg) were observed by using immuno-histochemical method. The observation and image analysis showed that after rats treated by lead for 2 hours, the c-fos and c-jun expression in cortex, CA3 area of hippocampus and cerebellum of rats were higher than those of control rats significantly (P<0.05). The results indicated that IEG, as a transcription regular factor, may participate in the neurological toxicity damaging the learning and memory ability induced by lead. The study provided experimental basis for revealing the molecular neurotoxic mechanism of lead.
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Key words: immediate early genes， lead， neurotoxicity
铅是典型的中枢神经系统毒物。由于环境中大气铅污染及生产、生活中长期接触铅所导致的铅毒性脑病尤其是对学习记忆功能的损害，给个人、家庭、社会带来了巨大的损失。
近几年在分子神经生物学研究中，即刻早期基因(immediate-early genes, IEG)在神经系统的生理及病理过程中所起的重要调节作用日渐受到关注。正常情况下，IEG参与神经细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程。当有外界伤害性刺激时，IEG(主要包括c-fos,c-jun)可作为刺激激活神经元的第二信使与目的基因表达间的信息传递中介物而被认为是神经元的一种“第三信使”[1]。通过测定c-fos及c-jun mRNA或其蛋白均可反映出c-fos和c-jun的表达水平。有少量文献报道，铅在不同的调控水平，包括电压启闭通道和第一、二、三信使系统产生广泛的神经毒性效应[2]。本文应用FOS和JUN免疫组织化学方法研究了铅急性中毒时大鼠脑组织中第三信使IEG表达的改变，为深入探讨铅神经毒性的分子机制提供实验依据。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雄性健康大鼠，体重200～240g，由华西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物及试剂 醋酸铅，天津化学试剂三厂；兔抗鼠FOS多克隆抗体，兔抗鼠JUN多克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品；SP-Kit(抗兔)即过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒，含生物素化IgG及S-A/HRP，DAB-Kit，美国Zymed公司产品；小牛血清白蛋白，华美生物工程公司；胰蛋白酶，Difco公司产品；多聚甲醛，德国E. Merck, Darmstadt产品，分析纯；戊巴比妥钠，Union产品。
其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器 石蜡切片机，研究显微镜(供照相用)，Mias-2000图象分析系统(四川大学计算机图象图形研究所研制)，普通光学显微镜。
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1.2 染毒方法及剂量
SD大白鼠实验前适应性喂养3天，在昼夜交换为10/14小时，温度为20℃左右的安静环境中，自由饮水进食。实验时，随机分为三组，每组5～6只，一次性腹腔注射受试物进行染毒：
(1)对照组：0.9%NaCl；(2)低铅组：体重剂量为13mg/kg的醋酸铅溶液；(3)高铅组：体重剂量为130mg/kg的醋酸铅溶液。染毒2小时后取材。
1.3 取材
1.3.1 灌注固定 各组大鼠腹腔注射染毒2小时后，给予戊巴比妥钠(60mg/kg,ip)深麻醉。打开胸腔，夹闭腹主动脉，经左心室插管，剪开右心室，用37℃生理盐水100ml快速冲洗，继之4℃的4%多聚甲醛(用0.1mol/LPBS配制，pH7.4)100ml灌注，持续0.5～1小时。
, http://www.100md.com 1.3.2 取材切片 灌注完毕后断头，迅速钳除颅骨，剥离硬脑膜及软脑膜，取出完整脑组织。沿矢状面方向从正中将脑组织切成左右两半，置4℃的4%多聚甲醛中继续固定12～24小时。修块、脱水、石蜡包埋，矢状方向切片(片厚5μm)。每个大鼠脑组织切片五张，其中一张裱于涂有蛋白胶的载玻片上进行常规HE染色，另四张裱于涂有铬矾-明胶液的载玻片上进行FOS、JUN免疫组化染色(设平行样)。
1.4 FOS及JUN免疫组化反应程序
切片用二甲苯及梯度酒精常规脱蜡及水；
0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤，3×5min；加3%H2O2—甲醇，室温作用30min，阻断内源性过氧化物酶；PBS洗涤3×5min，加0.1%胰蛋白酶(0.1%CaCl2配制)消化，修复抗原，37℃15min；PBS洗涤3×5min，加2%BSA(PBS配制)封闭，37℃1h，吸半干；加FOS(或JUN)一抗(工作浓度1∶200),4℃湿盒内过夜；PBS洗涤3×5min，加生物素化二抗(工作浓度1∶100)，37℃ 20min；PBS洗涤3×5min，加S-A/HRP(工作浓度1∶100)，37℃20 min；PBS洗涤3×5min，加新配制的DAB显色，显微镜下控制染色5～10min，PBS终止反应。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片。
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1.5 结果判断
免疫组化染色切片与相应HE染色切片对照观察，海马等部位参照包新民等著《大鼠脑立体定位图谱》辨认[3]。以FOS、JUN阳性的癫痫大鼠脑组织切片为阳性对照，以正常羊血清代替FOS、JUN一抗作为替代对照，以0.01mol/L PBS(pH7.4)代替FOS、JUN一抗作为空白对照。组织细胞显示棕色或棕色颗粒者为阳性，不显色为阴性反应。
1.6 显微照相及图象分析
1.6.1 显微照相 用日本产OLYMPUS BH1型显微照相系统。选择适当部位，适当倍数照相。底片为柯达彩色胶卷。
1.6.2 图象分析 用Mias—2000图象分析系统，对免疫组化反应切片进行定量分析。所有切片放大倍数均为400×。每组5～6只动物，每只动物FOS及JUN染色各取2张切片。每张切片分别对大脑皮层、海马CA3区锥体细胞层和小脑观察2个视野。视场面积为46151.81117μm2，分别测定阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度及阳性细胞个数(n)等参数。
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1.7 统计学处理
对每组动物所测试的所有切片得出的数据取平均值，然后采用《中国医学百科全书*医学统计学》统计软件包PEMS Ver. 2. 1(华西医科大学统计学教研室研制，1996)进行方差分析(F检验及q检验)，比较实验组与对照组，及各实验组之间各参数有无显著性差异。
2 结果与分析
2.1 铅对大鼠不同脑区FOS蛋白表达的影响
光镜下观察，染铅组大鼠脑组织中FOS蛋白免疫组织化学反应物质呈棕黄色颗粒状，位于神经细胞及部分胶质细胞核内，胞浆亦有部分表达。海马CA3区FOS染色阳性的锥体细胞分布密集，胞体大，呈多角形，阳性着色的核呈圆形或椭圆形，着色深；小脑FOS染色阳性的蒲肯野氏细胞呈单层排列，胞体大，着色较深；皮层阳性神经细胞呈散在分布，皮层的不同层阳性细胞形态各异(见图片1～3)。
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正常对照组相应部位仅见少数细胞FOS阳性表达，着色浅(见图片2，4)。替代对照及空白对照均未见阳性表达。
在图象分析系统下，测定各组FOS表达的阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度及阳性细胞个数(n)等参数，见表1。经统计学检验，在大脑皮层，低铅组Aa(%)高于对照组(P<0.05)，高铅组Aa(%)和n也高于对照组(P<0.01)。在海马CA3区，低铅组Aa(%)及高铅组Aa(%)和平均灰度与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。在小脑蒲细胞区，低铅组和高铅组的平均灰度均低于对照组(P<0.01)，同时低铅组的阳性细胞数n高于对照组(P<0.05)(见表1)。以上结果表明染铅组FOS表达在数量及强度上均高于对照组。
2.2 铅对大鼠不同脑区JUN蛋白表达的影响
光镜下观察，各组JUN的表达特点同FOS(见照片)。
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经统计学检验，在大脑皮层，低铅组与高铅组的Aa(%)、平均灰度及n三个参数与对照组相比，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其它部位JUN的表达规律基本同FOS(见表2)。以上结果表明染铅组JUN的表达在数量及强度上均高于对照组。
图1 高铅组海马CA3区锥体细胞层FOS表达(400×)
图2 对照组海马CA3区锥体细胞层FOS表达(400×)
图3 高铅组小脑蒲肯野细胞FOS表达(400×)
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图4 对照组小脑蒲肯野细胞FOS表达(400×)表1 铅对大鼠不同脑区FOS蛋白表达的影响(
±s，n=20) 组 别
大脑皮层
海马CA3区锥体细胞层
小脑蒲细胞
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
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阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
对照组
, 百拇医药
1.84±1.03(1)
174±22
29±3
3.68±0.93(1)
178±15
36±5
2.15±0.49
208± 5(2)
5±1
低铅组
5.95±3.10
, 百拇医药
137± 5
37±7(2)
11.00±0.71
151±26
37±8
1.98±0.33
155±11
9±1
高铅组
5.68±3.08(2)
139±32
61±8(2)
, 百拇医药
9.99±2.48(1)
112±20(1)
37±6
1.88±0.85
111±20
7±2
注：(1)P<0.05 (2)P<0.01 对照组栏的P值是低铅组与对照组相比，低铅组栏的P值是高铅组与低铅组相比，高铅组栏的P值是高铅组与对照组相比
图5 高铅组皮层JUN表达(400×)
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图6 对照组皮层JUN表达(400×)
图7 高铅组海马CA3区锥体细胞层JUN表达(400×)
图8 对照组海马CA3区锥体细胞层JUN表达(400×)
图9 高铅组小脑蒲肯野细胞JUN表达(400×)
图10 对照组小脑蒲肯野细胞JUN表达(400×)表2 铅对大鼠不同脑区JUN蛋白表达的影响(x±s，n=20) 组 别
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大脑皮层
海马CA3区锥体细胞层
小脑蒲细胞
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
, 百拇医药
阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
对照组
2.92±1.98(1)
198±12(2)
26±8(2)
, 百拇医药
4.42±1.02(2)
174±11(1)
36±8
2.28±0.14
202± 2
6±1
低铅组
8.74±1.21
137±6(1)
48±5
12.21±1.39(2)
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160± 9
29±4
3.22±0.79
189±10(2)
8±1
高铅组
8.69±3.25(1)
119±4(2)
59±6(2)
8.37±1.99(2)
147±6(2)
, 百拇医药
29±6
1.78±0.11
155±13(2)
6±1
注：同表1
3 讨论
c-fos和c-jun是原癌基因中的两种即刻早期基因(IEG)。在正常情况下，神经细胞中有低水平表达，表达产物FOS和JUN蛋白是真核细胞的主要转录因子，二者通过亮氨酸拉链形成异源二聚体激活蛋白-1(AP-1)，后者作为转录因子与许多基因的AP-1结合位点或佛波脂(TPA)反应序列结合，影响晚期靶基因的表达。因而，c-fos、c-jun的激活和表达可作为神经活动和基因活动的功能标志[4]。在病理状态下，多种刺激因素如疼痛、禁水、癫痫或脑损伤等伤害性刺激均可引起中枢神经元c-fos、c-jun基因的表达。c-fos mRNA表达高峰在1小时，FOS蛋白免疫组化反应最大值在2小时[5]。目前对创伤性脑损伤的分子生物学研究表明，兴奋性氨基酸的释放能诱导c-fos mRNA表达[6]。FOS/JUN作为第三信使，通过激活AP-1结合位点完成了从第二信使到晚期基因表达的信号转导。而更多的研究者们也同意c-fos和c-jun在外源性病理刺激中是通过以下途径发挥其第三信使作用的[1，7]：
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刺激→激活NMDA受体或使兴奋性氨基酸等第一信使增高→激活第二信使如Ca2+—CaM、cAMP、IP3等→(第二信使进入胞核)诱导c-fos、c-jun基因转录mRNA→mRNA在胞浆中翻译合成FOS和JUN→FOS和JUN在胞核中形成复合物并与蛋白基因内的AP-1调节位点结合→进一步激活目的基因的表达而最终对刺激作出反应。
铅影响中枢神经系统学习记忆功能的机制十分复杂。既往研究已经证实，铅可模拟或取代钙的作用而在第二信使代谢过程中起作用，从而激活蛋白激酶C(PKC)系统；在海马部位，铅通过降低GABA介导的抑制作用来增加CA3区锥体细胞的兴奋性从而使CA3的LTP(突触后长时程增强效应)幅度增高[8]。铅这种对第一、二信使系统的作用可能是其影响第三信使系统的基础。
本实验观察到染铅组大鼠大脑皮层、海马、小脑部位的神经细胞中FOS、JUN的表达在数量及强度上高于对照组，说明铅可诱导大鼠脑组织中c-fos和c-jun基因的表达。海马、皮层及小脑的功能均与认知活动、学习和记忆过程密切相关[9]。染铅条件下第三信使c-fos和c-jun的高水平表达提示，IEG可能作为转录调控因子参与了铅对中枢神经系统学习记忆损害的毒性过程。
, 百拇医药
国外所做的有关实验也证实了这一点。Pennypacker以分子生物学技术发现饲铅组大鼠在出生后3天即有AP-1 DNA结合物活性的显著增高[10]。Kim所做体外实验表明，醋酸铅可使PC12副神经节瘤细胞的c-fos增高，且具有量效关系和时效关系[10]。
诚然，铅的神经毒性作用尤其是对学习记忆影响的机制相当复杂，铅对核内第三信使c-fos和c-jun表达的作用，仅仅是其分子机制的一个环节，完全阐明铅神经毒性机制尚需解决许多问题：不同脑区是否存在不同的信号转导途径；如何将信号转导到核内；c-fos和c-fun表达又如何调控靶基因导致最终的神经损害等，都需进一步深入研究。但铅对c-fos、c-jun表达的影响至少说明其作用机制与转录因子的调控有关。这方面的研究值得再深入探讨。
(本研究承蒙四川大学计算机系李毅老师、钱老师及华西医科大学法医病理教研室的覃质彬老师的大力支持和协助，特致以衷心的感谢!)
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* 卫生部科研基金资助项目
作者简介：李国君，女，博士研究生
李杰平 卢军 93级本科实习生
参考文献
[1] Morgan S, Greenberg ME. The regulation and function of c-fos and other immediate early genes in the nervous system. Neuron, 1990, 4: 477—485
[2] Finkelstein Y.铅的神经毒性机制.何稼敏译.国外学者来访报告1997，17(2)：22—26
[3] 包新民，舒斯云著.大鼠脑立体定位图谱.北京：人民卫生出版社，1991.40—61
, 百拇医药
[4] 陈宜张主编.分子神经生物学.北京：人民军医出版社，1995.43—44
[5] MacDonald MC, Robertson HA, Wilkinson M. Age and dose-related NMDA induction of FOS-like immunoreactivity and c-fos mRNA in the arcuate mucleus of immature female rats. Dev Brain Res, 1993, 73: 193—198
[6] Rea MA, Buckley B, Lut ton LM. Local administration of EAA antagonist blocks light-induced phase shift and c-fos expression in hamster SCN. Ann J Physiol, 1993, 265: R1191—1198
, 百拇医药
[7] 韩济生主编.神经科学纲要.北京：中国医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.272—275
[8] 阮迪云.铅对儿童学习记忆的影响及其细胞和分子机理.中国药理学与毒理学杂志，1997，11(2)：97—98
[9] 韩太真，吴馥梅主编.学习和记忆的神经生物学.北京：中国医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998.90—100
[10] Pennypacker-KR, Xiao Y, Xu RH, et al. Lead-induced developmental changes in AP-1 DNA binding in rat brain. Int J Dev Neurosci, 1997, 15(3): 321—328
[11] Kim K, Annadata M, Goldstein GW, et al. Induction of c_fos mRNA by lead in PC 12 cells. Int J Dev Neurosci, 1997，15(2): 175—182
(1998-09-18收稿), 百拇医药
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：即刻早期基因；铅；神经毒理
卫生研究/990201 摘要 为了研究即刻早期基因(IEG)在铅的神经毒性机制中的作用，本实验应用FOS和JUN蛋白免疫组织化学方法对腹腔注射染铅13mg/kg及130mg/kg的大鼠不同脑区c-fos、c-jun表达水平进行了观察。图像分析及统计检验结果表明，急性染铅2小时后，大鼠脑组织皮层、海马CA3区及小脑的c-fos、c-jun表达的阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度或阳性细胞个数等参数与对照组相比有显著性差异(P<0.05)，即染铅组IEG表达高于对照组。这一结果提示第三信使IEG作为转录调控因子可能参与了铅对学习记忆损害的神经毒性过程。这对深入阐明铅神经毒性的分子机制提供了一定的实验依据。
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中图分类号 Q593.2 X503.22 O614.433
Effect of lead on the expression of immediate early genes
in different regions of rat brain
Li Guojun, Wu Desheng, Xiao Bangliang, Li Jieping et al.
Department of Environmental Health, School of Public Health, West China
University of Medical Sciences, Chengdu 610041, China
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In order to study the role of immediate early genes (IEG) in the neurotoxic mechanism of lead, expression of c-fos and c-jun genes in different regions of rat brain treated with lead (13 and 130 mg/kg) were observed by using immuno-histochemical method. The observation and image analysis showed that after rats treated by lead for 2 hours, the c-fos and c-jun expression in cortex, CA3 area of hippocampus and cerebellum of rats were higher than those of control rats significantly (P<0.05). The results indicated that IEG, as a transcription regular factor, may participate in the neurological toxicity damaging the learning and memory ability induced by lead. The study provided experimental basis for revealing the molecular neurotoxic mechanism of lead.
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Key words: immediate early genes， lead， neurotoxicity
铅是典型的中枢神经系统毒物。由于环境中大气铅污染及生产、生活中长期接触铅所导致的铅毒性脑病尤其是对学习记忆功能的损害，给个人、家庭、社会带来了巨大的损失。
近几年在分子神经生物学研究中，即刻早期基因(immediate-early genes, IEG)在神经系统的生理及病理过程中所起的重要调节作用日渐受到关注。正常情况下，IEG参与神经细胞的生长、分化、信息传递、学习和记忆等生理过程。当有外界伤害性刺激时，IEG(主要包括c-fos,c-jun)可作为刺激激活神经元的第二信使与目的基因表达间的信息传递中介物而被认为是神经元的一种“第三信使”[1]。通过测定c-fos及c-jun mRNA或其蛋白均可反映出c-fos和c-jun的表达水平。有少量文献报道，铅在不同的调控水平，包括电压启闭通道和第一、二、三信使系统产生广泛的神经毒性效应[2]。本文应用FOS和JUN免疫组织化学方法研究了铅急性中毒时大鼠脑组织中第三信使IEG表达的改变，为深入探讨铅神经毒性的分子机制提供实验依据。
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物 Sprague-Dawley(SD)雄性健康大鼠，体重200～240g，由华西医科大学实验动物中心提供。
1.1.2 药物及试剂 醋酸铅，天津化学试剂三厂；兔抗鼠FOS多克隆抗体，兔抗鼠JUN多克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品；SP-Kit(抗兔)即过氧化物酶标记的链霉卵白素染色试剂盒，含生物素化IgG及S-A/HRP，DAB-Kit，美国Zymed公司产品；小牛血清白蛋白，华美生物工程公司；胰蛋白酶，Difco公司产品；多聚甲醛，德国E. Merck, Darmstadt产品，分析纯；戊巴比妥钠，Union产品。
其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器 石蜡切片机，研究显微镜(供照相用)，Mias-2000图象分析系统(四川大学计算机图象图形研究所研制)，普通光学显微镜。
, http://www.100md.com
1.2 染毒方法及剂量
SD大白鼠实验前适应性喂养3天，在昼夜交换为10/14小时，温度为20℃左右的安静环境中，自由饮水进食。实验时，随机分为三组，每组5～6只，一次性腹腔注射受试物进行染毒：
(1)对照组：0.9%NaCl；(2)低铅组：体重剂量为13mg/kg的醋酸铅溶液；(3)高铅组：体重剂量为130mg/kg的醋酸铅溶液。染毒2小时后取材。
1.3 取材
1.3.1 灌注固定 各组大鼠腹腔注射染毒2小时后，给予戊巴比妥钠(60mg/kg,ip)深麻醉。打开胸腔，夹闭腹主动脉，经左心室插管，剪开右心室，用37℃生理盐水100ml快速冲洗，继之4℃的4%多聚甲醛(用0.1mol/LPBS配制，pH7.4)100ml灌注，持续0.5～1小时。
, http://www.100md.com 1.3.2 取材切片 灌注完毕后断头，迅速钳除颅骨，剥离硬脑膜及软脑膜，取出完整脑组织。沿矢状面方向从正中将脑组织切成左右两半，置4℃的4%多聚甲醛中继续固定12～24小时。修块、脱水、石蜡包埋，矢状方向切片(片厚5μm)。每个大鼠脑组织切片五张，其中一张裱于涂有蛋白胶的载玻片上进行常规HE染色，另四张裱于涂有铬矾-明胶液的载玻片上进行FOS、JUN免疫组化染色(设平行样)。
1.4 FOS及JUN免疫组化反应程序
切片用二甲苯及梯度酒精常规脱蜡及水；
0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤，3×5min；加3%H2O2—甲醇，室温作用30min，阻断内源性过氧化物酶；PBS洗涤3×5min，加0.1%胰蛋白酶(0.1%CaCl2配制)消化，修复抗原，37℃15min；PBS洗涤3×5min，加2%BSA(PBS配制)封闭，37℃1h，吸半干；加FOS(或JUN)一抗(工作浓度1∶200),4℃湿盒内过夜；PBS洗涤3×5min，加生物素化二抗(工作浓度1∶100)，37℃ 20min；PBS洗涤3×5min，加S-A/HRP(工作浓度1∶100)，37℃20 min；PBS洗涤3×5min，加新配制的DAB显色，显微镜下控制染色5～10min，PBS终止反应。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，DPX封片。
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1.5 结果判断
免疫组化染色切片与相应HE染色切片对照观察，海马等部位参照包新民等著《大鼠脑立体定位图谱》辨认[3]。以FOS、JUN阳性的癫痫大鼠脑组织切片为阳性对照，以正常羊血清代替FOS、JUN一抗作为替代对照，以0.01mol/L PBS(pH7.4)代替FOS、JUN一抗作为空白对照。组织细胞显示棕色或棕色颗粒者为阳性，不显色为阴性反应。
1.6 显微照相及图象分析
1.6.1 显微照相 用日本产OLYMPUS BH1型显微照相系统。选择适当部位，适当倍数照相。底片为柯达彩色胶卷。
1.6.2 图象分析 用Mias—2000图象分析系统，对免疫组化反应切片进行定量分析。所有切片放大倍数均为400×。每组5～6只动物，每只动物FOS及JUN染色各取2张切片。每张切片分别对大脑皮层、海马CA3区锥体细胞层和小脑观察2个视野。视场面积为46151.81117μm2，分别测定阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度及阳性细胞个数(n)等参数。
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1.7 统计学处理
对每组动物所测试的所有切片得出的数据取平均值，然后采用《中国医学百科全书*医学统计学》统计软件包PEMS Ver. 2. 1(华西医科大学统计学教研室研制，1996)进行方差分析(F检验及q检验)，比较实验组与对照组，及各实验组之间各参数有无显著性差异。
2 结果与分析
2.1 铅对大鼠不同脑区FOS蛋白表达的影响
光镜下观察，染铅组大鼠脑组织中FOS蛋白免疫组织化学反应物质呈棕黄色颗粒状，位于神经细胞及部分胶质细胞核内，胞浆亦有部分表达。海马CA3区FOS染色阳性的锥体细胞分布密集，胞体大，呈多角形，阳性着色的核呈圆形或椭圆形，着色深；小脑FOS染色阳性的蒲肯野氏细胞呈单层排列，胞体大，着色较深；皮层阳性神经细胞呈散在分布，皮层的不同层阳性细胞形态各异(见图片1～3)。
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正常对照组相应部位仅见少数细胞FOS阳性表达，着色浅(见图片2，4)。替代对照及空白对照均未见阳性表达。
在图象分析系统下，测定各组FOS表达的阳性面积比[Aa(%)]、平均灰度及阳性细胞个数(n)等参数，见表1。经统计学检验，在大脑皮层，低铅组Aa(%)高于对照组(P<0.05)，高铅组Aa(%)和n也高于对照组(P<0.01)。在海马CA3区，低铅组Aa(%)及高铅组Aa(%)和平均灰度与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。在小脑蒲细胞区，低铅组和高铅组的平均灰度均低于对照组(P<0.01)，同时低铅组的阳性细胞数n高于对照组(P<0.05)(见表1)。以上结果表明染铅组FOS表达在数量及强度上均高于对照组。
2.2 铅对大鼠不同脑区JUN蛋白表达的影响
光镜下观察，各组JUN的表达特点同FOS(见照片)。
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经统计学检验，在大脑皮层，低铅组与高铅组的Aa(%)、平均灰度及n三个参数与对照组相比，均有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。其它部位JUN的表达规律基本同FOS(见表2)。以上结果表明染铅组JUN的表达在数量及强度上均高于对照组。
图1 高铅组海马CA3区锥体细胞层FOS表达(400×)
图2 对照组海马CA3区锥体细胞层FOS表达(400×)
图3 高铅组小脑蒲肯野细胞FOS表达(400×)
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图4 对照组小脑蒲肯野细胞FOS表达(400×)表1 铅对大鼠不同脑区FOS蛋白表达的影响(
±s，n=20) 组 别大脑皮层
海马CA3区锥体细胞层
小脑蒲细胞
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
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阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
对照组
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1.84±1.03(1)
174±22
29±3
3.68±0.93(1)
178±15
36±5
2.15±0.49
208± 5(2)
5±1
低铅组
5.95±3.10
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137± 5
37±7(2)
11.00±0.71
151±26
37±8
1.98±0.33
155±11
9±1
高铅组
5.68±3.08(2)
139±32
61±8(2)
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9.99±2.48(1)
112±20(1)
37±6
1.88±0.85
111±20
7±2
注：(1)P<0.05 (2)P<0.01 对照组栏的P值是低铅组与对照组相比，低铅组栏的P值是高铅组与低铅组相比，高铅组栏的P值是高铅组与对照组相比
图5 高铅组皮层JUN表达(400×)
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图6 对照组皮层JUN表达(400×)
图7 高铅组海马CA3区锥体细胞层JUN表达(400×)
图8 对照组海马CA3区锥体细胞层JUN表达(400×)
图9 高铅组小脑蒲肯野细胞JUN表达(400×)
图10 对照组小脑蒲肯野细胞JUN表达(400×)表2 铅对大鼠不同脑区JUN蛋白表达的影响(x±s，n=20) 组 别
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大脑皮层
海马CA3区锥体细胞层
小脑蒲细胞
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
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阳性
细胞数
阳性面积比
(%)
平均
灰度
阳性
细胞数
对照组
2.92±1.98(1)
198±12(2)
26±8(2)
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4.42±1.02(2)
174±11(1)
36±8
2.28±0.14
202± 2
6±1
低铅组
8.74±1.21
137±6(1)
48±5
12.21±1.39(2)
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160± 9
29±4
3.22±0.79
189±10(2)
8±1
高铅组
8.69±3.25(1)
119±4(2)
59±6(2)
8.37±1.99(2)
147±6(2)
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29±6
1.78±0.11
155±13(2)
6±1
注：同表1
3 讨论
c-fos和c-jun是原癌基因中的两种即刻早期基因(IEG)。在正常情况下，神经细胞中有低水平表达，表达产物FOS和JUN蛋白是真核细胞的主要转录因子，二者通过亮氨酸拉链形成异源二聚体激活蛋白-1(AP-1)，后者作为转录因子与许多基因的AP-1结合位点或佛波脂(TPA)反应序列结合，影响晚期靶基因的表达。因而，c-fos、c-jun的激活和表达可作为神经活动和基因活动的功能标志[4]。在病理状态下，多种刺激因素如疼痛、禁水、癫痫或脑损伤等伤害性刺激均可引起中枢神经元c-fos、c-jun基因的表达。c-fos mRNA表达高峰在1小时，FOS蛋白免疫组化反应最大值在2小时[5]。目前对创伤性脑损伤的分子生物学研究表明，兴奋性氨基酸的释放能诱导c-fos mRNA表达[6]。FOS/JUN作为第三信使，通过激活AP-1结合位点完成了从第二信使到晚期基因表达的信号转导。而更多的研究者们也同意c-fos和c-jun在外源性病理刺激中是通过以下途径发挥其第三信使作用的[1，7]：
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刺激→激活NMDA受体或使兴奋性氨基酸等第一信使增高→激活第二信使如Ca2+—CaM、cAMP、IP3等→(第二信使进入胞核)诱导c-fos、c-jun基因转录mRNA→mRNA在胞浆中翻译合成FOS和JUN→FOS和JUN在胞核中形成复合物并与蛋白基因内的AP-1调节位点结合→进一步激活目的基因的表达而最终对刺激作出反应。
铅影响中枢神经系统学习记忆功能的机制十分复杂。既往研究已经证实，铅可模拟或取代钙的作用而在第二信使代谢过程中起作用，从而激活蛋白激酶C(PKC)系统；在海马部位，铅通过降低GABA介导的抑制作用来增加CA3区锥体细胞的兴奋性从而使CA3的LTP(突触后长时程增强效应)幅度增高[8]。铅这种对第一、二信使系统的作用可能是其影响第三信使系统的基础。
本实验观察到染铅组大鼠大脑皮层、海马、小脑部位的神经细胞中FOS、JUN的表达在数量及强度上高于对照组，说明铅可诱导大鼠脑组织中c-fos和c-jun基因的表达。海马、皮层及小脑的功能均与认知活动、学习和记忆过程密切相关[9]。染铅条件下第三信使c-fos和c-jun的高水平表达提示，IEG可能作为转录调控因子参与了铅对中枢神经系统学习记忆损害的毒性过程。
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国外所做的有关实验也证实了这一点。Pennypacker以分子生物学技术发现饲铅组大鼠在出生后3天即有AP-1 DNA结合物活性的显著增高[10]。Kim所做体外实验表明，醋酸铅可使PC12副神经节瘤细胞的c-fos增高，且具有量效关系和时效关系[10]。
诚然，铅的神经毒性作用尤其是对学习记忆影响的机制相当复杂，铅对核内第三信使c-fos和c-jun表达的作用，仅仅是其分子机制的一个环节，完全阐明铅神经毒性机制尚需解决许多问题：不同脑区是否存在不同的信号转导途径；如何将信号转导到核内；c-fos和c-fun表达又如何调控靶基因导致最终的神经损害等，都需进一步深入研究。但铅对c-fos、c-jun表达的影响至少说明其作用机制与转录因子的调控有关。这方面的研究值得再深入探讨。
(本研究承蒙四川大学计算机系李毅老师、钱老师及华西医科大学法医病理教研室的覃质彬老师的大力支持和协助，特致以衷心的感谢!)
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* 卫生部科研基金资助项目
作者简介：李国君，女，博士研究生
李杰平 卢军 93级本科实习生
参考文献
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[11] Kim K, Annadata M, Goldstein GW, et al. Induction of c_fos mRNA by lead in PC 12 cells. Int J Dev Neurosci, 1997，15(2): 175—182
(1998-09-18收稿), 百拇医药