预热对K562细胞化疗药物体外敏感性的影响*
作者：王 枫 赵法亻及 郭俊生
单位：第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433
关键词：预热应激；药物敏感试验；化疗药物；热应激蛋白70
卫生研究/990207 摘要 目的：研究预热对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响并初步探讨其可能机理。方法：对K562细胞预热应激，用RT-PCR检测细胞热应激蛋白70(HSP70)，并用MTT比色法观察细胞对化疗药物体外敏感性的变化。结果：预热使K562细胞HSP70明显增多，且在预热2h后达到最高；在常规剂量下(临床一次用量的1/250)未预热K562细胞对阿霉素(ADM，0.4mg/L)及环磷酰胺(CTX，0.8mg/L)中度敏感；预热应激后，K562细胞对这两种同剂量药物均轻度敏感或不敏感；并检测了这两种药物的浓度梯度。结论：热应激可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；推测HSP70表达增强可能是肿瘤热疗效果和化疗药物敏感性降低的直接原因。
, 百拇医药
中图分类号 R73-361
Preheating decrease the sensitivity of K562 cell
to chemotheraputic drugs
Wang Feng,Zhao Faji,Guo Junsheng
Department of Military Hygiene,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Hyperthermia is a powerful tool for enhancing the effect of many chemical drugs on killing cells,but too many times of hyperthermia could decrease the effect and increase the ability of tumor cell against chemical drugs.Heat stress protein 70(HSP70)mRNA of K562 cell was analyzed by RT-PCR,and the chemosensitivity of K562 cell was tested by MTT method before and after heat-exposure. The results showed that HSP70 mRNA increased greatly after K562 cells exposed to 40℃ for 30min and then it went to the top after 120 min heat-exposure.The sensitivity of K562 cell to adriamycin(ADM) and cyclophosphamide(CTX)in a usual dosage(1/250 of one dosage in clinical use)was in middle degree before exposed to heat,and the sensitivity dramatically went down after K562 cell being heat-stressed.The sensitivity of heat-stressed tumor cells to chemotheraputic drugs was decreased,which may come from the increased expression of stress proteins in cells.
, 百拇医药
Key words:heat stress，chemosensitivity test,chemotherapy,tumor cell
肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。通过肿瘤局部温度升高，可以使手术未切除的肿瘤细胞死亡，肿瘤热疗是近年来兴起的一种治疗方法，如果将热疗与化疗、放疗联合使用，可以提高化疗和放疗的效果[1]。但是实际应用发现，重复使用热疗后其效果随着治疗次数的增加而下降。说明热疗过程中，肿瘤细胞产生的某些物质降低了肿瘤细胞的热敏感性。研究表明生物体热应激后，最根本的变化是其蛋白质谱的变化，即其正常蛋白质合成被抑制，却合成了一组特殊的蛋白质，这组蛋白质被称为热应激蛋白，其中尤以70kD蛋白质(HSP70)的合成增加最为明显[2]。目前临床所用的化疗药物大都是通过干扰肿瘤细胞的核酸合成或转录来治疗肿瘤的。本文以K562细胞系(人白血病患者胸腔渗出细胞)用预热诱导细胞HSP70高表达，用RT-PCR定量法检测细胞HSP70mRNA；用MTT比色法检测细胞活力的变化，观察预热对K562细胞化疗药物敏感性的影响，推测HSP70与细胞遗传物质的关系，为研究HSP70对DNA的保护作用提供资料。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 基本材料与设备
1.1.1 细胞和主要试剂 K562细胞由第二军医大学中医科实验室提供，RPMI-1640培养基，GIBCO公司；MMLV逆转录酶、RNasin\,TaqDNA聚合酶、dNTP均为MEGAGENE公司产品；PCR引物、逆转录引物均为中国科学院上海生物工程研究所合成；总RNA提取试剂盒为上海华顺公司产品；其它试剂均为国产AR级。
1.1.2 化疗药物 阿霉素(ADM)，海门制药厂；环磷酰胺(CTX)，华联制药公司。药物浓度以临床一次用量的1/250为中剂量，(中剂量的1/10为)低剂量，(中剂量的10倍为)高剂量；ADM的剂量分别为0.04、0.4、4mg/L；CTX的剂量分别为0.08、0.8、8mg/L。
1.1.3 主要仪器 酶联检测仪(Bio-Rad Model 550,Beckman);CO2孵箱(Heraeus,德国)；高速台式离心机(TDL80-2，上海)；PCR仪(PE2400，PE公司)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 RPMI-1640培养液、37℃、5%湿化CO2中孵育；当细胞呈对数生长时，苔盼兰染色计算活力，当细胞活力≥90%时，重悬于完全培养液中，即得细胞悬液。
1.2.2 细胞HSP70的诱导及测定 将对数生长的细胞，在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导细胞HSP70高表达；HSP70的检测采用定量RT-PCR法。
1.2.3 药物敏感实验 取浓度为1.5×105～2.5×105个活细胞/ml的细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，对照组直接加入不同量的化疗药物，使其浓度达到要求；实验组先在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导HSP70高表达，然后加入化疗药物，每种药物、每个时间点、每个药物浓度设6个试验孔；正常对照组的3个孔加0.01mol pH7.2 PBS，37℃、5%湿化CO2中孵育72小时，加入5mg/L的MTT液10μl/孔，37℃、5%湿化CO2中孵育4小时，加入酸化异丙醇(0.04mol/L)50μl/孔，室温下振荡10分钟，用酶联检测仪测OD值(λ=570 nm)。计算抑制率：抑制率=(1-药敏组OD值/对照组OD值)×100%。根据沈靖南等的标准判断敏感性[2]。抑制率>50%为重度敏感，在30%～50%为中度敏感，在10%～29%为轻度敏感，<10%为不敏感。
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1.3 统计分析
结果以x±s表示，用STAT软件进行结果分析。
2 结果
2.1 预热时间对细胞HSP70mRNA的影响
预热30min后，细胞HSP70mRNA水平已明显增高；随着时间延长而不断增加；预热120min后达到最高，以后略有下降，但下降不明显，并可在高水平维持较长的一段时间(附图)。
附图 预热时间对细胞HSP70mRNA的影响
2.2 预热对细胞化疗药物敏感性的影响
表1中，未预热时，细胞对中剂量ADR、CTX是中度敏感；药物种类和剂量，均随着预热时间的延长，细胞对化疗药物的敏感性降低，在预热120min时最低；未预热细胞对同剂
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表1 化疗药物ADR和CTX对K562细胞的抑制率(x±s，n=6) 预热时间
(min)
ADR(mg/L) CTX(mg/L)
0.04
0.4
4
0.08
0.8
8
0
10.47±5.05(1)
, 百拇医药
34.42±7.54(1)
53.39±14.72(1)
12.81±4.42(1)
37.83±10.13(1)
56.23±12.66(1)
30
7.94±3.26
30.13±6.58
44.29±10.39
10.26±4.14
, http://www.100md.com
30.64±7.92
51.29±10.07
60
4.58±2.17
21.70±9.76
29.35±10.69
5.33±2.28
20.72±9.99
30.74±13.87
120
2.17±0.98(2)
, 百拇医药
10.21±3.54(2)
13.65±6.11(2)
2.09±1.13(2)
11.28±6.54(2)
16.57± 5.19
180
2.10±0.79(2)
11.79±4.99(2)
11.16±5.03(2)
, http://www.100md.com 2.43±1.28(2)
10.32±5.51(2)
15.63± 4.36(2)
注：(1) 与预热时间60、120、180min相比，P<0.05 (2) 与预热时间30、60min相比，P<0.05量的ADR、CTX均较预热细胞敏感(P<0.05)；预热120min和180min后细胞对同剂量的ADR、CTX较预热30min和60min细胞敏感性低(P<0.05)。
3 讨论
肿瘤治疗是一个世界性的难题，现在治疗肿瘤的方法很多。近几年来，有人根据肿瘤细胞对温度升高特别敏感的特点，用热疗方法治疗肿瘤，采取升高肿瘤病灶局部温度的方法杀死肿瘤细胞。但是，临床实践发现，如果不能一次杀灭全部肿瘤细胞，那么再次热疗的效果就大大降低。由此可以推测，热疗引起肿瘤细胞产生了某种抗热疗的物质。研究这些物质对其它治疗方法的影响是十分重要的。
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研究的结果显示，在常规剂量下，K562细胞对阿霉素、环磷酰胺中度敏感(抑制率分别为34.72%、37.83%)，此结果显然不同于一般的恶性肿瘤(通常恶性肿瘤敏感药物的抑制率在50%以上)。本实验选用的化疗药物均是白血病临床治疗的常用药物，对白血病细胞均比较敏感。体内外结果的差异可能是因为K562细胞是一种细胞系，其对抗外界影响的作用强于原代培养细胞。冯传汉等曾在琼脂上进行骨巨细胞瘤的克隆形成培养及药物敏感试验，认为ADR、CTX在体外对骨巨细胞瘤的克隆增殖有明显的抑制作用，其敏感反应率分别为50%和42%[3]。显然我们的结果与其结果基本一致。
生物体热暴露后最明显的反应就是体内应激蛋白量的异常增加。任何应激因素均可刺激其大量合成，应激蛋白的大量产生可以对抗不利于细胞生存的因素，阻止应激原对生物体进一步损害，所以热应激蛋白被称为细胞的“救援系统”[4]。细胞脱离应激环境后，应激蛋白还会保持一段时间的高水平。本文结果表明，预热后K562细胞HSP70水平明显增高，随着预热时间的延长，药物对细胞的抑制率显著下降，在预热120min后，细胞对化疗药物的敏感性最低；与预热后细胞HSP70的水平正好相反。提示预热引起的细胞HSP70表达水平增高可能是引起细胞药物敏感度降低的原因之一。
, 百拇医药
预热使肿瘤细胞产生大量应激蛋白。脱离热环境后，应激蛋白还在细胞内存在一定时期，这时加入化疗药物应激蛋白就会对抗药物的作用，保护细胞，影响化疗药物的效果。Mizumo等曾发现[5]，肿瘤细胞预热可以降低细胞对丝裂霉素的敏感性，Rice等也发现[6]，预热可降低肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。Oesterreich实验发现[7]，预热对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响只是一个现象，其根本原因是细胞HSP70水平与细胞的阿霉素抗性之间有很好的相关性。
预热引起肿瘤细胞对化疗药物抗性的机理是什么呢?现在用于化疗的药物大多是作用于细胞的DNA复制阶段，可以影响肿瘤细胞的遗传信息的传递。Wang等认为[8], 化疗药物大多作用于细胞的DNA拓扑酶Ⅱ，影响拓扑酶的活性。Kampinga通过实验发现[9]，预热后，细胞内合成大量的HSP70，可以保护细胞由化疗药物引起的DNA断裂，降低化疗药物的细胞毒作用，降低化疗药物与拓扑酶的结合能力，HSP70在此过程中起到了一定的作用。由此可见，预热引起肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低的部分原因可能是：HSP70高表达影响了化疗药物与细胞DNA拓扑酶的结合而引起的，HSP70高表达可以保护化疗药物对细胞遗传物质的损害。
, http://www.100md.com
* “九五”军队重点科研项目
作者简介：王枫，男，现为第四军医大学博士后，联系地址：第四军医大学军队卫生教研室 西安 710032
参考文献
[1] Engelhardt R.Recent results in cancer research:hyperthermia and the therapy of malignant tumors.Berlin：Spingler,1987.136—203
[2] 沈靖南，黄承达.人骨肉瘤的体外药敏试验及其临床应用.中华实验外科杂志，1992，1：36
[3] 冯传汉，周 磊，孙德青，等.骨巨细胞瘤一些概念的发展与更新.中华骨科杂志，1991，3：165
, 百拇医药
[4] Parsell DA,Lindquist S.Heat shock proteins and stress tolerance.In:Morimoto RI,Tissieres A and Georgopoulos C eds.The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1994.457—494
[5] Mizumo S,Amagai M,Ishida A.Synergistic cell killing by autitumor agents by hyperthermia in cultured cells.Gann,1980,71:471—478
[6] Rice GC,Hahn GM.Modulation of adriamycin transport by hyperthermia as measured by fluorescence-activated cells sorting.Cancer Chem Pharmacol,1987,20:183—187
, 百拇医药
[7] Oesterreich S,Weng CN,Qiu M,et al.The small heat shock proteins in correlated with growth and drug resistance in human brest cancer cell lines.Cancer Res,1993,53:443—4448
[8] Wang JC.DNA topoisomerases.Ann Rev Biochem,1985,54:665～697
[9] Kampinga HH.Hyperthermia,thermotolerance and toposiomerase inhibitors.Br J Can,1995,72:333—338
(1998-09-16收稿), 百拇医药
单位：第二军医大学军队卫生教研室，上海 200433
关键词：预热应激；药物敏感试验；化疗药物；热应激蛋白70
卫生研究/990207 摘要 目的：研究预热对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响并初步探讨其可能机理。方法：对K562细胞预热应激，用RT-PCR检测细胞热应激蛋白70(HSP70)，并用MTT比色法观察细胞对化疗药物体外敏感性的变化。结果：预热使K562细胞HSP70明显增多，且在预热2h后达到最高；在常规剂量下(临床一次用量的1/250)未预热K562细胞对阿霉素(ADM，0.4mg/L)及环磷酰胺(CTX，0.8mg/L)中度敏感；预热应激后，K562细胞对这两种同剂量药物均轻度敏感或不敏感；并检测了这两种药物的浓度梯度。结论：热应激可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性；推测HSP70表达增强可能是肿瘤热疗效果和化疗药物敏感性降低的直接原因。
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中图分类号 R73-361
Preheating decrease the sensitivity of K562 cell
to chemotheraputic drugs
Wang Feng,Zhao Faji,Guo Junsheng
Department of Military Hygiene,Second Military Medical University, Shanghai 200433, China
Hyperthermia is a powerful tool for enhancing the effect of many chemical drugs on killing cells,but too many times of hyperthermia could decrease the effect and increase the ability of tumor cell against chemical drugs.Heat stress protein 70(HSP70)mRNA of K562 cell was analyzed by RT-PCR,and the chemosensitivity of K562 cell was tested by MTT method before and after heat-exposure. The results showed that HSP70 mRNA increased greatly after K562 cells exposed to 40℃ for 30min and then it went to the top after 120 min heat-exposure.The sensitivity of K562 cell to adriamycin(ADM) and cyclophosphamide(CTX)in a usual dosage(1/250 of one dosage in clinical use)was in middle degree before exposed to heat,and the sensitivity dramatically went down after K562 cell being heat-stressed.The sensitivity of heat-stressed tumor cells to chemotheraputic drugs was decreased,which may come from the increased expression of stress proteins in cells.
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Key words:heat stress，chemosensitivity test,chemotherapy,tumor cell
肿瘤细胞对于高温的敏感性明显高于正常细胞。通过肿瘤局部温度升高，可以使手术未切除的肿瘤细胞死亡，肿瘤热疗是近年来兴起的一种治疗方法，如果将热疗与化疗、放疗联合使用，可以提高化疗和放疗的效果[1]。但是实际应用发现，重复使用热疗后其效果随着治疗次数的增加而下降。说明热疗过程中，肿瘤细胞产生的某些物质降低了肿瘤细胞的热敏感性。研究表明生物体热应激后，最根本的变化是其蛋白质谱的变化，即其正常蛋白质合成被抑制，却合成了一组特殊的蛋白质，这组蛋白质被称为热应激蛋白，其中尤以70kD蛋白质(HSP70)的合成增加最为明显[2]。目前临床所用的化疗药物大都是通过干扰肿瘤细胞的核酸合成或转录来治疗肿瘤的。本文以K562细胞系(人白血病患者胸腔渗出细胞)用预热诱导细胞HSP70高表达，用RT-PCR定量法检测细胞HSP70mRNA；用MTT比色法检测细胞活力的变化，观察预热对K562细胞化疗药物敏感性的影响，推测HSP70与细胞遗传物质的关系，为研究HSP70对DNA的保护作用提供资料。
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1 材料与方法
1.1 基本材料与设备
1.1.1 细胞和主要试剂 K562细胞由第二军医大学中医科实验室提供，RPMI-1640培养基，GIBCO公司；MMLV逆转录酶、RNasin\,TaqDNA聚合酶、dNTP均为MEGAGENE公司产品；PCR引物、逆转录引物均为中国科学院上海生物工程研究所合成；总RNA提取试剂盒为上海华顺公司产品；其它试剂均为国产AR级。
1.1.2 化疗药物 阿霉素(ADM)，海门制药厂；环磷酰胺(CTX)，华联制药公司。药物浓度以临床一次用量的1/250为中剂量，(中剂量的1/10为)低剂量，(中剂量的10倍为)高剂量；ADM的剂量分别为0.04、0.4、4mg/L；CTX的剂量分别为0.08、0.8、8mg/L。
1.1.3 主要仪器 酶联检测仪(Bio-Rad Model 550,Beckman);CO2孵箱(Heraeus,德国)；高速台式离心机(TDL80-2，上海)；PCR仪(PE2400，PE公司)。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 RPMI-1640培养液、37℃、5%湿化CO2中孵育；当细胞呈对数生长时，苔盼兰染色计算活力，当细胞活力≥90%时，重悬于完全培养液中，即得细胞悬液。
1.2.2 细胞HSP70的诱导及测定 将对数生长的细胞，在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导细胞HSP70高表达；HSP70的检测采用定量RT-PCR法。
1.2.3 药物敏感实验 取浓度为1.5×105～2.5×105个活细胞/ml的细胞悬液接种于96孔微量培养板中(100μl/孔)，对照组直接加入不同量的化疗药物，使其浓度达到要求；实验组先在(40±0.05)℃水浴不同时间以诱导HSP70高表达，然后加入化疗药物，每种药物、每个时间点、每个药物浓度设6个试验孔；正常对照组的3个孔加0.01mol pH7.2 PBS，37℃、5%湿化CO2中孵育72小时，加入5mg/L的MTT液10μl/孔，37℃、5%湿化CO2中孵育4小时，加入酸化异丙醇(0.04mol/L)50μl/孔，室温下振荡10分钟，用酶联检测仪测OD值(λ=570 nm)。计算抑制率：抑制率=(1-药敏组OD值/对照组OD值)×100%。根据沈靖南等的标准判断敏感性[2]。抑制率>50%为重度敏感，在30%～50%为中度敏感，在10%～29%为轻度敏感，<10%为不敏感。
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1.3 统计分析
结果以x±s表示，用STAT软件进行结果分析。
2 结果
2.1 预热时间对细胞HSP70mRNA的影响
预热30min后，细胞HSP70mRNA水平已明显增高；随着时间延长而不断增加；预热120min后达到最高，以后略有下降，但下降不明显，并可在高水平维持较长的一段时间(附图)。
附图 预热时间对细胞HSP70mRNA的影响
2.2 预热对细胞化疗药物敏感性的影响
表1中，未预热时，细胞对中剂量ADR、CTX是中度敏感；药物种类和剂量，均随着预热时间的延长，细胞对化疗药物的敏感性降低，在预热120min时最低；未预热细胞对同剂
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表1 化疗药物ADR和CTX对K562细胞的抑制率(x±s，n=6) 预热时间
(min)
ADR(mg/L) CTX(mg/L)
0.04
0.4
4
0.08
0.8
8
0
10.47±5.05(1)
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34.42±7.54(1)
53.39±14.72(1)
12.81±4.42(1)
37.83±10.13(1)
56.23±12.66(1)
30
7.94±3.26
30.13±6.58
44.29±10.39
10.26±4.14
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30.64±7.92
51.29±10.07
60
4.58±2.17
21.70±9.76
29.35±10.69
5.33±2.28
20.72±9.99
30.74±13.87
120
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10.21±3.54(2)
13.65±6.11(2)
2.09±1.13(2)
11.28±6.54(2)
16.57± 5.19
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2.10±0.79(2)
11.79±4.99(2)
11.16±5.03(2)
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10.32±5.51(2)
15.63± 4.36(2)
注：(1) 与预热时间60、120、180min相比，P<0.05 (2) 与预热时间30、60min相比，P<0.05量的ADR、CTX均较预热细胞敏感(P<0.05)；预热120min和180min后细胞对同剂量的ADR、CTX较预热30min和60min细胞敏感性低(P<0.05)。
3 讨论
肿瘤治疗是一个世界性的难题，现在治疗肿瘤的方法很多。近几年来，有人根据肿瘤细胞对温度升高特别敏感的特点，用热疗方法治疗肿瘤，采取升高肿瘤病灶局部温度的方法杀死肿瘤细胞。但是，临床实践发现，如果不能一次杀灭全部肿瘤细胞，那么再次热疗的效果就大大降低。由此可以推测，热疗引起肿瘤细胞产生了某种抗热疗的物质。研究这些物质对其它治疗方法的影响是十分重要的。
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研究的结果显示，在常规剂量下，K562细胞对阿霉素、环磷酰胺中度敏感(抑制率分别为34.72%、37.83%)，此结果显然不同于一般的恶性肿瘤(通常恶性肿瘤敏感药物的抑制率在50%以上)。本实验选用的化疗药物均是白血病临床治疗的常用药物，对白血病细胞均比较敏感。体内外结果的差异可能是因为K562细胞是一种细胞系，其对抗外界影响的作用强于原代培养细胞。冯传汉等曾在琼脂上进行骨巨细胞瘤的克隆形成培养及药物敏感试验，认为ADR、CTX在体外对骨巨细胞瘤的克隆增殖有明显的抑制作用，其敏感反应率分别为50%和42%[3]。显然我们的结果与其结果基本一致。
生物体热暴露后最明显的反应就是体内应激蛋白量的异常增加。任何应激因素均可刺激其大量合成，应激蛋白的大量产生可以对抗不利于细胞生存的因素，阻止应激原对生物体进一步损害，所以热应激蛋白被称为细胞的“救援系统”[4]。细胞脱离应激环境后，应激蛋白还会保持一段时间的高水平。本文结果表明，预热后K562细胞HSP70水平明显增高，随着预热时间的延长，药物对细胞的抑制率显著下降，在预热120min后，细胞对化疗药物的敏感性最低；与预热后细胞HSP70的水平正好相反。提示预热引起的细胞HSP70表达水平增高可能是引起细胞药物敏感度降低的原因之一。
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预热使肿瘤细胞产生大量应激蛋白。脱离热环境后，应激蛋白还在细胞内存在一定时期，这时加入化疗药物应激蛋白就会对抗药物的作用，保护细胞，影响化疗药物的效果。Mizumo等曾发现[5]，肿瘤细胞预热可以降低细胞对丝裂霉素的敏感性，Rice等也发现[6]，预热可降低肿瘤细胞对阿霉素的敏感性。Oesterreich实验发现[7]，预热对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响只是一个现象，其根本原因是细胞HSP70水平与细胞的阿霉素抗性之间有很好的相关性。
预热引起肿瘤细胞对化疗药物抗性的机理是什么呢?现在用于化疗的药物大多是作用于细胞的DNA复制阶段，可以影响肿瘤细胞的遗传信息的传递。Wang等认为[8], 化疗药物大多作用于细胞的DNA拓扑酶Ⅱ，影响拓扑酶的活性。Kampinga通过实验发现[9]，预热后，细胞内合成大量的HSP70，可以保护细胞由化疗药物引起的DNA断裂，降低化疗药物的细胞毒作用，降低化疗药物与拓扑酶的结合能力，HSP70在此过程中起到了一定的作用。由此可见，预热引起肿瘤细胞对化疗药物敏感性降低的部分原因可能是：HSP70高表达影响了化疗药物与细胞DNA拓扑酶的结合而引起的，HSP70高表达可以保护化疗药物对细胞遗传物质的损害。
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* “九五”军队重点科研项目
作者简介：王枫，男，现为第四军医大学博士后，联系地址：第四军医大学军队卫生教研室 西安 710032
参考文献
[1] Engelhardt R.Recent results in cancer research:hyperthermia and the therapy of malignant tumors.Berlin：Spingler,1987.136—203
[2] 沈靖南，黄承达.人骨肉瘤的体外药敏试验及其临床应用.中华实验外科杂志，1992，1：36
[3] 冯传汉，周 磊，孙德青，等.骨巨细胞瘤一些概念的发展与更新.中华骨科杂志，1991，3：165
, 百拇医药
[4] Parsell DA,Lindquist S.Heat shock proteins and stress tolerance.In:Morimoto RI,Tissieres A and Georgopoulos C eds.The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones.New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1994.457—494
[5] Mizumo S,Amagai M,Ishida A.Synergistic cell killing by autitumor agents by hyperthermia in cultured cells.Gann,1980,71:471—478
[6] Rice GC,Hahn GM.Modulation of adriamycin transport by hyperthermia as measured by fluorescence-activated cells sorting.Cancer Chem Pharmacol,1987,20:183—187
, 百拇医药
[7] Oesterreich S,Weng CN,Qiu M,et al.The small heat shock proteins in correlated with growth and drug resistance in human brest cancer cell lines.Cancer Res,1993,53:443—4448
[8] Wang JC.DNA topoisomerases.Ann Rev Biochem,1985,54:665～697
[9] Kampinga HH.Hyperthermia,thermotolerance and toposiomerase inhibitors.Br J Can,1995,72:333—338
(1998-09-16收稿), 百拇医药