慢性硒中毒大鼠硒蛋白的变化
作者：张在香 杨晓光 牟维鹏 田园 夏弈明 陈孝曙
单位：张在香 杨晓光 牟维鹏 田园 夏弈明 陈孝曙 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：硒；硒蛋白；慢性硒中毒
卫生研究990308 摘要：在低硒酵母配制的低硒饲料的基础上，加亚硒酸钠配成含硒量为0.2和5.0 mg/kg(适硒和高硒)的两组饲料来喂养雄性断乳Wistar大鼠。在实验20周末处死大鼠，测定组织器官的细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(cGPX)、细胞外谷胱甘肽过氧化物酶(eGPX)、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPX)、Ⅰ型脱碘酶(IDⅠ)和Ⅱ型脱碘酶(IDⅡ)活性、硒蛋白P和硒蛋白W以及组织硒含量，并对所有大鼠的肝脏进行病理学检查。结果发现高硒饲料组大鼠的体重明显低于适硒饲料组。高硒组动物组织中硒含量明显高于适硒组。两组动物肝脏无明显病理学差异，但高硒组大鼠的血浆eGPX活性，肾脏、心脏和睾丸中的cGPX活性，肝、肾和甲状腺的IDⅠ活性，心脏和睾丸中的PHGPX活性以及大鼠体重明显低于适硒饲料组。提示它们可以作为硒中毒的早期生化指标。
, 百拇医药
中图分类号：R599.1 Q593 Q51
Selenoproteins in rats with chronic selenium intoxication
Zhang Zaixiang, Yang Xiaoguang, Mu Weipeng, Tian Yuan, et al.
Institute of Nutrition and Food Hygiene, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100050， China
Weaning male Wistar rats were fed with a Torula-yeast based semisynthetic diet supplemented with Na\-2SeO\-3 to provide selenium (Se) 0.2 or 0.5 mg/kg (adequate Se or high Sediet) respectively for 20 weeks. By the end of experiment, rats were sacrificed and various tissue of rats were collected to determine the activities of Se-containing enzymes and the mRNAs level of selenoprotein P and selenoprotein W and Se concentration. Livers were examined for pathological changes. It was found that the gain of body weight of the high Se group was significantly lower than that of adequate Se group. Much more Se was accumulated in the tissue of high Se group. The activities of eGPX in plasma, cGPX in kidney, heart and testis, IDⅠ in liver, kidney and thyroid and PHGPX in heart and testis in the high Se group were significantly lower than those in the adequate Se group. However, no specific pathological changes have been found in the liver of both groups. The results suggested that these enzymatic changes could be used as early biochemical parameters for chronic selenium intoxication.
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Key words:selenium, selenoprotein, chronic selenium intoxication
我国高硒地区居民每日从膳食中摄取的硒量超过1mg，大大超过我国营养学会推荐的硒供给量标准[1，2]。为探讨能反映早期硒中毒的生化指标，在饲料中补充不同剂量亚硒酸钠20周，观察高硒和适硒组大鼠体内各种硒蛋白的差异。
1 材料与方法
1.1 动物饲料 实验基础饲料为低硒酵母(Torular-yeast, Rhinelander Paper Co, WI. USA)配制的半合成饲料，其组成(%)为：低硒酵母30，玉米淀粉60.7，花生油5，混合无机盐3，DL-蛋氨酸0.3[3]，混合维生素1[4]。每千克饲料加维生素A2500IU和维生素D250IU，维生素E60mg/kg。基础饲料的硒含量为0.01 mg/kg，向基础饲料中加亚硒酸钠，使饲料硒含量分别为0.20和5.00 mg/kg。两周配一次饲料，硒测定合格后喂养大鼠。
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1.2 动物分组及饲养和样品处理 雄性断乳Wistar大鼠，平均体重为36.4克，以常备饲料适应3天，然后按体重随机分为若干组，每组6只。适硒和高硒饲料含硒分别为0.2或5.0 mg/kg。自由进食和饮水，每周称体重一次。于实验第20周处死，处死前一天禁食、禁水。乙醚麻醉大鼠，取腹主动脉血，5%EDTA抗凝(每毫升血液20μl)，肝脏用冷生理盐水经门静脉灌流至灰白色后取出，随后取脑、甲状腺、心脏、肾脏、睾丸和肌肉等，用冷生理盐水漂洗后滤纸吸干，称重分装后于液氮中速冻。血液经3000r/min离心20min分离血浆和红细胞，分装后与其它器官一起于-80℃保存备用。
1.3 指标测定及方法
1.3.1 样品和饲料硒测定 采用王光亚等建立的荧光法，以美国NBS牛肝粉(1577b)作质控，用HITACHI650-10S型荧光分光光度计测定[5]。
1.3.2 GPX活力测定 采用夏弈明等改良的偶联法[7]，还原型谷胱甘肽(GSH)，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和谷胱甘肽还原酶(GR)等试剂均为Sigma产品。
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1.3.3 PHGPX底物合成和测定 采用哈鹏程等建立的方法[8～10]
1.3.4 脱碘酶活力T3测定 用放射免疫法[11]，北京北方生物技术研究所生产的三碘甲腺原氨酸T3放射免疫分析测定盒。
1.3.5 总蛋白用双缩脲法测定[12]。血红蛋白用高铁氰化钾法测定[13]。
1.3.6 硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA水平测定 用Northern和狭线杂交[14]
用TRIZOL试剂(Gibco公司产品)提取组织中的总RNA。紫外分光光度计测RNA在260nm和280nm的吸光度(A)。RNA纯度用A260/A280的比值来反映，RNA浓度计算A260值。
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Northern杂交的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳上样量为30μg总RNA，毛细管洗脱法转膜。狭线杂交的上样量为10μg总RNA。用α-32P-dCTP标记的硒蛋白P和硒蛋白W的cDNA探针进行杂交(硒蛋白P和硒蛋白W的探针分别由美国Vanderbilt大学Burk RF教授和Oregon州立大学Whanger教授馈送，硒蛋白P的cDNA探针长度为1.2kb，硒蛋白W的cDNA探针长度为650bp。髓机引物标记试剂盒为Promega产品)。总RNA定量用亚甲蓝染色法来代替常用的β-actin[15]。用Molecular Analyst Software对Northern杂交、狭线杂交条带(硒蛋白P或硒蛋白W的mRNA)以及亚甲蓝染色带(总RNA)进行扫描定量，用杂交带的量除以亚甲蓝染色带量来定量硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA相对量(%)。
1.4 数据处理用SAS统计软件，ANOVA进行显著性检验。
2 结果
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2.1 体重
2组动物的起始体重无差异，到20周时硒中毒组的体重明显降低(表1)。
表1 饲料硒对体重、血浆eGPX活性和
硒水平的影响(
±s,n=6)(1) 饲料硒
水平
(mg/kg)
体重
(g)
血 浆
红 细 胞
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eGPX
〔mmol/
(min.l)〕
Se
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
Se
(mg/kg)
0.2
455±57
, 百拇医药
3333±1114
0.571±0.031
668±263
0.622±0.015
5.0
345±48
1937±484
0.639±0.021
689±266
1.196±0.084
注：(1) 2组比较，除cGPX外，均呈显著差异，P<0.05
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2.2 血浆eGPX活性和硒
表1表明高硒组血浆硒显著高于适硒组，但血浆eGPX的活性则正好相反(P<0.05)。
2.3 红细胞cGPX活性和硒
从表1可以看出红细胞的cGPX活性和硒水平都随着饲料硒水平的增加而增加。高硒与适硒组红细胞硒有显著性差异。cGPX活性在高硒组虽有升高的趋势(P<0.05)，但与适硒组的差别无显著统计学意义。
2.4 肝脏重量、cGPX活性、IDⅠ活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
肝体比重、cGPX活性和硒蛋白P的mRNA在两组中无差异。高硒组的肝硒高于适硒组，P<0.05。而IDⅠ活性则相反，见表2。
表2 饲料硒对肝脏酶活性、硒蛋白P
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和硒的影响(±s,n=6)(1) 饲料硒
水 平
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
IDⅠ
〔nmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
, 百拇医药
%
Se
(mg/kg)
0.2
952±259
1.97±0.33
116.3±19.2(2)
0.746±0.120
5.0
1032±139
1.41±0.48
79.2±46.3(2)
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2.447±0.323
注：( )内为样本数
2.5 肾脏重量、cGPX活性、IDⅠ活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
饲料硒对肾/体重比无影响。高硒组的cGPX活性明显低于适硒组，而高硒组的肾硒则明显高于适硒组，P<0.05。硒蛋白P的mRNA水平和IDⅠ活性在两组中无显著性差异，见表3。
表3 饲料硒对肾脏酶活性、硒蛋白P和硒的影响(±s,n=6) 饲料硒
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
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(min.g)〕
IDⅠ
〔nmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
347±65
4.54±0.77
96.2±27.7(2)
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1.359±0.254
5.0
230±45
3.61±0.52
106.6±27.4(2)
2.714±0.371
2.6 大脑重量、cGPX活性、PHGPX活性、IDⅡ活性、硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA以及硒的变化
脑中各项指标的变化与其它器官有所不同。高硒组的脑硒明显高于适硒组(P<0.05)。而cGPX活性、PHGPX活性、IDⅡ活性、硒蛋白P、硒蛋白W的mRNA水平以及脑体比重在2个组中无统计学差异，见表4。
表4 不同饲料硒水平对大脑cGPX、PHGPX、硒蛋白P、硒蛋白W和硒的变化(±s,n=6) 饲料硒(mg/kg)
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cGPX
〔μmol/(min.g)〕
PHGPX
〔μmol/(min.g)〕
IDⅡ
〔nmol/(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
硒蛋白W
(%)
Se
(mg/kg)
, 百拇医药
0.2
25.4±6.1
3.6±0.97
4.13±0.59
103.0±17.02(2)
99.7±3.3(2)
0.117±0.002
5.0
25.3±6.1
3.0±1.05
4.49±2.48
82.0±2.8(2)
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104.5±9.9(2)
0.160±0.008
2.7 心脏重量、cGPX活性、PHGPX活性和硒的变化
心脏与体重比两组无显著差异。适硒组中cGPX活性、PHGPX活性都明显高于高硒组，而高硒组心脏硒则显著升高，P<0.05，见表5。
2.8 睾丸重量、cGPX活性、PHGPX活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
睾丸cGPX活性和PHGPX活性在适硒组都明显高于高硒组，P<0.05。硒蛋白P的mRNA水平和睾丸重量与体重比两组无差异。
表5 饲料硒对心脏重量、cGPX活性、PHGPX活性
和硒的影响(±s,n=6) 饲料硒(mg/kg)
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cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
PHGPX
〔μmol/
(min.g)〕
Se
mg/kg
0.2
645±141
6.4±1.1
0.298±0.005
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5.0
300±177
3.9±1.5
0.355±0.019
表6 硒对睾丸重量、酶活性、硒蛋白P和硒的影响(±s) 饲料硒
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
PHGPX
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〔μmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
60.5±21.1
61.9±10.5
80.2±41.4(2)
0.891±0.065
5.0
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45.5±7.5
44.8±4.2
98.7±24.9(2)
0.996±0.056
注：( )内为样本数
2.9 甲状腺cGPX和IDⅠ活性的变化 甲状腺cGPX两组间无统计学差异。IDⅠ活性在0.2mg/kg饲料硒组明显高于5.0 mg/kg饲料硒组，P<0.05。
表7 饲料硒对甲状腺cGPX和IDⅠ活性的影响(±s,n=6) 饲料硒(mg/kg)
cGPX
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〔μmol/(min.g)〕
IDⅠ
nmol/(min.g)
0.2
51.9±16.6
3.56±0.15
5.0
49.8±8.0
2.84±0.52
2.10 肌肉硒蛋白W的mRNA、硒蛋白P的mRNA和硒的变化 从表8中可以看出，高硒组肌肉硒明显高于适硒组，P<0.05，而硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA水平在两组中无差异。
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表8 饲料硒对肌肉硒蛋白P、硒蛋白W和硒的影响(±s) 饲料硒
(mg/kg)
硒蛋白P
(%)
硒蛋白W
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
101.3±34.9(2)
106.1±22.8(2)
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116.0±9.9(6)
5.0
93.7±18.2(2)
95.5±16.5(2)
171.3±10.0(6)
注：( )内为样本数
2.11 病理学结果
2.11.1 肉眼变化 适硒和高硒组大鼠肝脏色泽红润，质韧，缘钝，表面光滑，未见结节、充血和肿大。
2.11.2 光镜变化 适硒组6只大鼠肝小叶结构正常，偶见双核肝细胞。少数肝细胞胞浆内见细小空泡(脂滴)，个别肝细胞核空泡变性。未见肝细胞坏死，亦未见纤维母细胞增生。肝窦内未见明显细胞聚集，汇管区亦未见显著病变。
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高硒组6只大鼠肝小叶结构正常。肝细胞内充满细小脂滴，在小叶内弥漫性分布，部分肝细胞内见比上组为大的脂滴及核内空泡。但未见肝细胞坏死及炎性浸润灶。只有一例中少数部分中央静脉、小叶内静脉及肝窦扩张，内含少许粉染液。
两组大鼠的肝脏小叶结构均正常，均未见肝细胞坏死性变化，亦未见明显结缔组织增生纤维化现象。两组均见有肝细胞内细小空泡，所不同的只是脂肪化程度的不同。
3 讨论
关于大鼠慢性硒中毒的最低剂量，一般认为在正常饲料中，添加硒的量达到4～5 mg/kg时，动物长期食用后即会出现硒中毒[16]。硒中毒的最灵敏指标是动物生长受到抑制，并伴有肝损伤，脾肿大，贫血及血清胆红素水平升高等变化。本实验室以往两个实验也发现大鼠饲料硒水平达到5 mg/kg时，动物生长缓慢。个别动物未到实验期限(3个月)而中途死亡，其肝脏有明显硒中毒病变。本实验中喂5 mg Se/kg饲料组的动物体重显著低于适宜硒水平组，显然是由硒中毒引起的。
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肝脏是代谢最活跃的器官，也被认为是硒中毒的主要靶器官。Hafeman等曾报道大鼠食用 5mg Se/kg饲料25日后即出现肝cGPX活力下降[17]。张晓燕等曾发现大鼠食用5mg Se/kg饲料7周后多数动物肝脏表面粗糙，少数动物肝脏萎缩质地变硬等改变[25]。但本组实验动物食用同样水平的高硒饲料20周后未发现其肝脏形态有显著异常。分析其原因：①可能与饲料中蛋氨酸和维生素E含量不同有关。已知补充蛋氨酸和维生素E对高硒有解毒作用[18]。张晓燕等的实验饲料中的含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)只及本实验的2/3。维生素E总量两者虽相差无几，但他们所用的主要为d-γ-型生育酚，而我们用的主要为dl-α-生育酚乙酸酯，前者在体内的活性只有后者的15%左右[19]。本实验中高硒之所以未引起肝脏损伤，很可能是由于所用饲料中含硫氨基酸含量比较充足，所用维生素E的活性又比较高。②与观察时动物年龄不同有关。早在1966年Halverson等曾报道刚断乳的大鼠对高硒的耐受性较成年鼠差。Hafeman等曾发现以5mg Se/kg的高硒饲料饲养动物，其肝脏cGPX活力在第25日时下降，但到第134日上升，与喂适硒饲料组动物的cGPX活力相近。张晓燕等实验发现喂高硒饲料的动物的肝脏病变在第14周时远比第7周时轻。这种随摄入高硒饲料时间的延长肝脏损伤反而减轻的现象反映动物肝脏对硒的解毒能力随年龄增长而增强。周瑞华等曾发现肝脏解毒产物三甲基硒的排出量在22周时是7周时的2倍[20]。本实验高硒动物肝脏未出现硒中毒的形态变化可能与上述两个因素有关。
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硒中毒的机制至今还不完全清楚。不少报道认为过量的亚硒酸盐在体内从Se+4被还原成Se-2的过程中，大量还原型谷胱甘肽(GSH)被氧化并产生自由基，从而使机体受到氧化损伤[21]。从本实验结果可见动物出现硒中毒后，在各种硒蛋白中受影响最大的是广泛分布于全身的谷胱甘肽过氧化物酶。如血浆eGPX、各组织的cGPX和PHGPX等活力都显著下降(唯肝脏例外，其原因如上述)。其下降原因可能是组织受损，GPX合成的能力下降，也很可能是组织中还原型GSH含量不足，导致这些酶的活力下降，因为还原型GSH是GPX的特异底物。红细胞是GPX活性最高的组织，在本实验内未见高硒对其有影响。在Hafeman等实验中也有同样发现，其原因目前还不清楚。
本实验的结果显示大鼠的体重，血浆eGPX,肾脏、心脏和睾丸中的cGPX可以作为发现硒中毒的早期指标，尤其是血浆eGPX应用最为方便，这为人体硒中毒研究中长期缺乏生化指标提供了有价值的参考。
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国家自然科学基金和卫生部基金资助课题
作者简介：张在香，女，博士
参考文献
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(1998-09-27收稿), 百拇医药
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关键词：硒；硒蛋白；慢性硒中毒
卫生研究990308 摘要：在低硒酵母配制的低硒饲料的基础上，加亚硒酸钠配成含硒量为0.2和5.0 mg/kg(适硒和高硒)的两组饲料来喂养雄性断乳Wistar大鼠。在实验20周末处死大鼠，测定组织器官的细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(cGPX)、细胞外谷胱甘肽过氧化物酶(eGPX)、磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPX)、Ⅰ型脱碘酶(IDⅠ)和Ⅱ型脱碘酶(IDⅡ)活性、硒蛋白P和硒蛋白W以及组织硒含量，并对所有大鼠的肝脏进行病理学检查。结果发现高硒饲料组大鼠的体重明显低于适硒饲料组。高硒组动物组织中硒含量明显高于适硒组。两组动物肝脏无明显病理学差异，但高硒组大鼠的血浆eGPX活性，肾脏、心脏和睾丸中的cGPX活性，肝、肾和甲状腺的IDⅠ活性，心脏和睾丸中的PHGPX活性以及大鼠体重明显低于适硒饲料组。提示它们可以作为硒中毒的早期生化指标。
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Selenoproteins in rats with chronic selenium intoxication
Zhang Zaixiang, Yang Xiaoguang, Mu Weipeng, Tian Yuan, et al.
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Key words:selenium, selenoprotein, chronic selenium intoxication
我国高硒地区居民每日从膳食中摄取的硒量超过1mg，大大超过我国营养学会推荐的硒供给量标准[1，2]。为探讨能反映早期硒中毒的生化指标，在饲料中补充不同剂量亚硒酸钠20周，观察高硒和适硒组大鼠体内各种硒蛋白的差异。
1 材料与方法
1.1 动物饲料 实验基础饲料为低硒酵母(Torular-yeast, Rhinelander Paper Co, WI. USA)配制的半合成饲料，其组成(%)为：低硒酵母30，玉米淀粉60.7，花生油5，混合无机盐3，DL-蛋氨酸0.3[3]，混合维生素1[4]。每千克饲料加维生素A2500IU和维生素D250IU，维生素E60mg/kg。基础饲料的硒含量为0.01 mg/kg，向基础饲料中加亚硒酸钠，使饲料硒含量分别为0.20和5.00 mg/kg。两周配一次饲料，硒测定合格后喂养大鼠。
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1.2 动物分组及饲养和样品处理 雄性断乳Wistar大鼠，平均体重为36.4克，以常备饲料适应3天，然后按体重随机分为若干组，每组6只。适硒和高硒饲料含硒分别为0.2或5.0 mg/kg。自由进食和饮水，每周称体重一次。于实验第20周处死，处死前一天禁食、禁水。乙醚麻醉大鼠，取腹主动脉血，5%EDTA抗凝(每毫升血液20μl)，肝脏用冷生理盐水经门静脉灌流至灰白色后取出，随后取脑、甲状腺、心脏、肾脏、睾丸和肌肉等，用冷生理盐水漂洗后滤纸吸干，称重分装后于液氮中速冻。血液经3000r/min离心20min分离血浆和红细胞，分装后与其它器官一起于-80℃保存备用。
1.3 指标测定及方法
1.3.1 样品和饲料硒测定 采用王光亚等建立的荧光法，以美国NBS牛肝粉(1577b)作质控，用HITACHI650-10S型荧光分光光度计测定[5]。
1.3.2 GPX活力测定 采用夏弈明等改良的偶联法[7]，还原型谷胱甘肽(GSH)，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和谷胱甘肽还原酶(GR)等试剂均为Sigma产品。
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1.3.3 PHGPX底物合成和测定 采用哈鹏程等建立的方法[8～10]
1.3.4 脱碘酶活力T3测定 用放射免疫法[11]，北京北方生物技术研究所生产的三碘甲腺原氨酸T3放射免疫分析测定盒。
1.3.5 总蛋白用双缩脲法测定[12]。血红蛋白用高铁氰化钾法测定[13]。
1.3.6 硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA水平测定 用Northern和狭线杂交[14]
用TRIZOL试剂(Gibco公司产品)提取组织中的总RNA。紫外分光光度计测RNA在260nm和280nm的吸光度(A)。RNA纯度用A260/A280的比值来反映，RNA浓度计算A260值。
, 百拇医药
Northern杂交的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳上样量为30μg总RNA，毛细管洗脱法转膜。狭线杂交的上样量为10μg总RNA。用α-32P-dCTP标记的硒蛋白P和硒蛋白W的cDNA探针进行杂交(硒蛋白P和硒蛋白W的探针分别由美国Vanderbilt大学Burk RF教授和Oregon州立大学Whanger教授馈送，硒蛋白P的cDNA探针长度为1.2kb，硒蛋白W的cDNA探针长度为650bp。髓机引物标记试剂盒为Promega产品)。总RNA定量用亚甲蓝染色法来代替常用的β-actin[15]。用Molecular Analyst Software对Northern杂交、狭线杂交条带(硒蛋白P或硒蛋白W的mRNA)以及亚甲蓝染色带(总RNA)进行扫描定量，用杂交带的量除以亚甲蓝染色带量来定量硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA相对量(%)。
1.4 数据处理用SAS统计软件，ANOVA进行显著性检验。
2 结果
, 百拇医药
2.1 体重
2组动物的起始体重无差异，到20周时硒中毒组的体重明显降低(表1)。
表1 饲料硒对体重、血浆eGPX活性和
硒水平的影响(
±s,n=6)(1) 饲料硒水平
(mg/kg)
体重
(g)
血 浆
红 细 胞
, 百拇医药
eGPX
〔mmol/
(min.l)〕
Se
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
Se
(mg/kg)
0.2
455±57
, 百拇医药
3333±1114
0.571±0.031
668±263
0.622±0.015
5.0
345±48
1937±484
0.639±0.021
689±266
1.196±0.084
注：(1) 2组比较，除cGPX外，均呈显著差异，P<0.05
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2.2 血浆eGPX活性和硒
表1表明高硒组血浆硒显著高于适硒组，但血浆eGPX的活性则正好相反(P<0.05)。
2.3 红细胞cGPX活性和硒
从表1可以看出红细胞的cGPX活性和硒水平都随着饲料硒水平的增加而增加。高硒与适硒组红细胞硒有显著性差异。cGPX活性在高硒组虽有升高的趋势(P<0.05)，但与适硒组的差别无显著统计学意义。
2.4 肝脏重量、cGPX活性、IDⅠ活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
肝体比重、cGPX活性和硒蛋白P的mRNA在两组中无差异。高硒组的肝硒高于适硒组，P<0.05。而IDⅠ活性则相反，见表2。
表2 饲料硒对肝脏酶活性、硒蛋白P
, http://www.100md.com
和硒的影响(
±s,n=6)(1) 饲料硒水 平
(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
IDⅠ
〔nmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
, 百拇医药
%
Se
(mg/kg)
0.2
952±259
1.97±0.33
116.3±19.2(2)
0.746±0.120
5.0
1032±139
1.41±0.48
79.2±46.3(2)
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2.447±0.323
注：( )内为样本数
2.5 肾脏重量、cGPX活性、IDⅠ活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
饲料硒对肾/体重比无影响。高硒组的cGPX活性明显低于适硒组，而高硒组的肾硒则明显高于适硒组，P<0.05。硒蛋白P的mRNA水平和IDⅠ活性在两组中无显著性差异，见表3。
表3 饲料硒对肾脏酶活性、硒蛋白P和硒的影响(
±s,n=6) 饲料硒(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
, http://www.100md.com
(min.g)〕
IDⅠ
〔nmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
347±65
4.54±0.77
96.2±27.7(2)
, http://www.100md.com
1.359±0.254
5.0
230±45
3.61±0.52
106.6±27.4(2)
2.714±0.371
2.6 大脑重量、cGPX活性、PHGPX活性、IDⅡ活性、硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA以及硒的变化
脑中各项指标的变化与其它器官有所不同。高硒组的脑硒明显高于适硒组(P<0.05)。而cGPX活性、PHGPX活性、IDⅡ活性、硒蛋白P、硒蛋白W的mRNA水平以及脑体比重在2个组中无统计学差异，见表4。
表4 不同饲料硒水平对大脑cGPX、PHGPX、硒蛋白P、硒蛋白W和硒的变化(
±s,n=6) 饲料硒(mg/kg), http://www.100md.com
cGPX
〔μmol/(min.g)〕
PHGPX
〔μmol/(min.g)〕
IDⅡ
〔nmol/(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
硒蛋白W
(%)
Se
(mg/kg)
, 百拇医药
0.2
25.4±6.1
3.6±0.97
4.13±0.59
103.0±17.02(2)
99.7±3.3(2)
0.117±0.002
5.0
25.3±6.1
3.0±1.05
4.49±2.48
82.0±2.8(2)
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104.5±9.9(2)
0.160±0.008
2.7 心脏重量、cGPX活性、PHGPX活性和硒的变化
心脏与体重比两组无显著差异。适硒组中cGPX活性、PHGPX活性都明显高于高硒组，而高硒组心脏硒则显著升高，P<0.05，见表5。
2.8 睾丸重量、cGPX活性、PHGPX活性、硒蛋白P的mRNA和硒的变化
睾丸cGPX活性和PHGPX活性在适硒组都明显高于高硒组，P<0.05。硒蛋白P的mRNA水平和睾丸重量与体重比两组无差异。
表5 饲料硒对心脏重量、cGPX活性、PHGPX活性
和硒的影响(
±s,n=6) 饲料硒(mg/kg), 百拇医药
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
PHGPX
〔μmol/
(min.g)〕
Se
mg/kg
0.2
645±141
6.4±1.1
0.298±0.005
, http://www.100md.com
5.0
300±177
3.9±1.5
0.355±0.019
表6 硒对睾丸重量、酶活性、硒蛋白P和硒的影响(
±s) 饲料硒(mg/kg)
cGPX
〔μmol/
(min.g)〕
PHGPX
, 百拇医药
〔μmol/
(min.g)〕
硒蛋白P
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
60.5±21.1
61.9±10.5
80.2±41.4(2)
0.891±0.065
5.0
, http://www.100md.com
45.5±7.5
44.8±4.2
98.7±24.9(2)
0.996±0.056
注：( )内为样本数
2.9 甲状腺cGPX和IDⅠ活性的变化 甲状腺cGPX两组间无统计学差异。IDⅠ活性在0.2mg/kg饲料硒组明显高于5.0 mg/kg饲料硒组，P<0.05。
表7 饲料硒对甲状腺cGPX和IDⅠ活性的影响(
±s,n=6) 饲料硒(mg/kg)cGPX
, 百拇医药
〔μmol/(min.g)〕
IDⅠ
nmol/(min.g)
0.2
51.9±16.6
3.56±0.15
5.0
49.8±8.0
2.84±0.52
2.10 肌肉硒蛋白W的mRNA、硒蛋白P的mRNA和硒的变化 从表8中可以看出，高硒组肌肉硒明显高于适硒组，P<0.05，而硒蛋白P和硒蛋白W的mRNA水平在两组中无差异。
, 百拇医药
表8 饲料硒对肌肉硒蛋白P、硒蛋白W和硒的影响(
±s) 饲料硒(mg/kg)
硒蛋白P
(%)
硒蛋白W
(%)
Se
(mg/kg)
0.2
101.3±34.9(2)
106.1±22.8(2)
, 百拇医药
116.0±9.9(6)
5.0
93.7±18.2(2)
95.5±16.5(2)
171.3±10.0(6)
注：( )内为样本数
2.11 病理学结果
2.11.1 肉眼变化 适硒和高硒组大鼠肝脏色泽红润，质韧，缘钝，表面光滑，未见结节、充血和肿大。
2.11.2 光镜变化 适硒组6只大鼠肝小叶结构正常，偶见双核肝细胞。少数肝细胞胞浆内见细小空泡(脂滴)，个别肝细胞核空泡变性。未见肝细胞坏死，亦未见纤维母细胞增生。肝窦内未见明显细胞聚集，汇管区亦未见显著病变。
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高硒组6只大鼠肝小叶结构正常。肝细胞内充满细小脂滴，在小叶内弥漫性分布，部分肝细胞内见比上组为大的脂滴及核内空泡。但未见肝细胞坏死及炎性浸润灶。只有一例中少数部分中央静脉、小叶内静脉及肝窦扩张，内含少许粉染液。
两组大鼠的肝脏小叶结构均正常，均未见肝细胞坏死性变化，亦未见明显结缔组织增生纤维化现象。两组均见有肝细胞内细小空泡，所不同的只是脂肪化程度的不同。
3 讨论
关于大鼠慢性硒中毒的最低剂量，一般认为在正常饲料中，添加硒的量达到4～5 mg/kg时，动物长期食用后即会出现硒中毒[16]。硒中毒的最灵敏指标是动物生长受到抑制，并伴有肝损伤，脾肿大，贫血及血清胆红素水平升高等变化。本实验室以往两个实验也发现大鼠饲料硒水平达到5 mg/kg时，动物生长缓慢。个别动物未到实验期限(3个月)而中途死亡，其肝脏有明显硒中毒病变。本实验中喂5 mg Se/kg饲料组的动物体重显著低于适宜硒水平组，显然是由硒中毒引起的。
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肝脏是代谢最活跃的器官，也被认为是硒中毒的主要靶器官。Hafeman等曾报道大鼠食用 5mg Se/kg饲料25日后即出现肝cGPX活力下降[17]。张晓燕等曾发现大鼠食用5mg Se/kg饲料7周后多数动物肝脏表面粗糙，少数动物肝脏萎缩质地变硬等改变[25]。但本组实验动物食用同样水平的高硒饲料20周后未发现其肝脏形态有显著异常。分析其原因：①可能与饲料中蛋氨酸和维生素E含量不同有关。已知补充蛋氨酸和维生素E对高硒有解毒作用[18]。张晓燕等的实验饲料中的含硫氨基酸(蛋氨酸+胱氨酸)只及本实验的2/3。维生素E总量两者虽相差无几，但他们所用的主要为d-γ-型生育酚，而我们用的主要为dl-α-生育酚乙酸酯，前者在体内的活性只有后者的15%左右[19]。本实验中高硒之所以未引起肝脏损伤，很可能是由于所用饲料中含硫氨基酸含量比较充足，所用维生素E的活性又比较高。②与观察时动物年龄不同有关。早在1966年Halverson等曾报道刚断乳的大鼠对高硒的耐受性较成年鼠差。Hafeman等曾发现以5mg Se/kg的高硒饲料饲养动物，其肝脏cGPX活力在第25日时下降，但到第134日上升，与喂适硒饲料组动物的cGPX活力相近。张晓燕等实验发现喂高硒饲料的动物的肝脏病变在第14周时远比第7周时轻。这种随摄入高硒饲料时间的延长肝脏损伤反而减轻的现象反映动物肝脏对硒的解毒能力随年龄增长而增强。周瑞华等曾发现肝脏解毒产物三甲基硒的排出量在22周时是7周时的2倍[20]。本实验高硒动物肝脏未出现硒中毒的形态变化可能与上述两个因素有关。
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硒中毒的机制至今还不完全清楚。不少报道认为过量的亚硒酸盐在体内从Se+4被还原成Se-2的过程中，大量还原型谷胱甘肽(GSH)被氧化并产生自由基，从而使机体受到氧化损伤[21]。从本实验结果可见动物出现硒中毒后，在各种硒蛋白中受影响最大的是广泛分布于全身的谷胱甘肽过氧化物酶。如血浆eGPX、各组织的cGPX和PHGPX等活力都显著下降(唯肝脏例外，其原因如上述)。其下降原因可能是组织受损，GPX合成的能力下降，也很可能是组织中还原型GSH含量不足，导致这些酶的活力下降，因为还原型GSH是GPX的特异底物。红细胞是GPX活性最高的组织，在本实验内未见高硒对其有影响。在Hafeman等实验中也有同样发现，其原因目前还不清楚。
本实验的结果显示大鼠的体重，血浆eGPX,肾脏、心脏和睾丸中的cGPX可以作为发现硒中毒的早期指标，尤其是血浆eGPX应用最为方便，这为人体硒中毒研究中长期缺乏生化指标提供了有价值的参考。
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国家自然科学基金和卫生部基金资助课题
作者简介：张在香，女，博士
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(1998-09-27收稿), 百拇医药