茶色素防癌作用的实验研究
作者：韩驰 宫芸芸
单位：韩驰(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050)；宫芸芸(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050)
关键词：茶多酚；茶色素；癌症短筛试验
卫生研究 JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH 1999 Vol 摘要 作者用一组体外短期检测试验，检验了茶色素在肿瘤的起动、促进、增殖阶段的作用并与茶多酚进行比较。选用基因正向突变和周期阻断法微核实验作为起动阶段指标，选用代谢协作和小鼠耳炎性水肿实验作为促癌阶段指标，选用Hela细胞存活率和软琼脂生长及小鼠S180实体瘤实验，检测对肿瘤细胞存活和增殖的影响。结果发现茶色素与茶多酚在肿瘤发生的起动、促进和增殖各阶段均显示出明显的保护作用；体外给予茶多酚、茶色素处理Hep G2肝肿瘤细胞，发现茶色素及其单体成分及茶多酚可诱导醌还原酶(QR)活性和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性；在用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低；饮用0.1%茶多酚、茶色素可显著诱导大鼠肝GST活性，茶多酚的诱导率为25%，茶色素的诱导率为18%，而且GST1-1、1-2、3-3蛋白表达均有明显升高。结果表明茶色素与茶多酚同样具有抗肿瘤作用，茶色素对具有抗氧化作用和解毒作用的Ⅱ相代谢酶QR和GST具有诱导作用，这可能是茶色素防癌作用的重要机制。
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分类号 R730.1 TS272
Experimental studies on the cancer chemoprevention of tea pigments
Han Chi, Gong Yunyun
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
A batch of short-term tests were used to examine the effects of tea pigments on three stages of carcinogenesis, i.e.initiation, promotion and progression. Forward gene mutation test and micronuclei test were used to study the initiation stage of carcinogenesis;metabolic cooperation test and mice ear test to study the promotion stage. Viability and growth ability of Hela cells in soft agar and S180 solid tumor test in mice were used to examine the effect of tea pigments on the third stage of carcinogenesis. The results showed that both tea pigments and tea polyphenols had significantly protective effects on initiation, promotion and progression stages in carcinogenesis. In vitro study showed that tea pigments and tea polyphenols could induce QR and GST activity in Hep G2 cells. Oral administration of 0.1% tea polyphenols and 0.1% tea pigments could increase GST activity in rat liver by 25% and 18% respectively,and this increase was accompanied by the significant increase of GST 1-1,1-2 and 3-3 protein expression level in rat liver. Our results suggested that the antrcancer effect of tea pigments was the same as that of tea polyphenols, and the anticancer properties of tea pigments might be mediated by activating the enzymes such as QR and GST,which play important roles in the detoxification and exclusion of carcinogen.
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Key words: tea polyphenols,tea pigments,short-term screen test for cancer
近年来国内外科学家运用现代科学技术研究茶的防癌作用，取得大量有意义的结果，许多动物试验证实饮茶对化学物质引起的食道、前胃、肝、大肠、口腔等多处肿瘤的发生具有明显预防作用[1，2]。当前，寻找茶中的防癌有效成分已成为进一步研究的焦点之一。这方面，国内外学者大都认为茶多酚是茶的主要有效成分，因为茶多酚具有抗氧化、诱导解毒酶、调节机体免疫等作用。然而，我们最近的研究结果表明茶叶中另一类主要成分茶色素对实验性肿瘤也具有不亚于茶多酚的预防作用。茶色素是茶多酚的氧化产物，是红茶的主要成分，其主要成分是茶红素和茶黄素。已有报道，茶色素也具有很强的抗氧化作用。为了进一步研究茶色素的作用及其机理，本研究选择一组体外短期检测试验，对茶色素在致癌过程的起动、促进、增殖阶段的作用进行检测，并与茶多酚的作用进行比较[3，4]。此外，本研究还对茶色素对实验性肝肿瘤发生的抑制作用、肝细胞抗氧化防御系统、以及对谷胱甘肽硫转移酶多种亚型的表达的影响等进行了一系列探讨。
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1 材料和方法
1.1 仪器设备
超净工作台：Environ Air Control Inc 10319(美国)；CO2培养箱：(SHEL-LAB 1825TC，美国)；倒置显微镜：(01ympusAT-Ⅱ，日本)；光学显微镜：(Nikon AFX-Ⅱ 日本)；高速电动匀浆器(Tekmar公司，西德)；高速离心机(Beckman GS-15R，美国)；超速离心机(Beckman L7-65,美国)；。电泳仪、电转槽(北京东方特立科贸中心)；台式多用恒温振荡器(江苏省太仓鹿河生化仪器厂)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；电热恒温干燥箱(南通)；薄层扫描分析仪(Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-900,日本)。
1.2 材料
, 百拇医药 1.2.1 细胞 中国地鼠V79细胞(6TG敏感型)、M细胞(6TG耐受型)、BALB/C3T3细胞株均购自中国医学科学院肿瘤医学研究所，HeLa细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，人肝癌细胞株Hep G2细胞购自北大医院病毒室。
1.2.2 主要试剂及其配制 CDNB、GSH、二乙基亚硝胺(DEN)、双丙烯酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT)、氮盐四唑(BCIP)(Sigma产品)；丙烯酰胺(Fluka公司)；Tris (Serva公司)；牛血清白蛋白(B.M.公司)；低分子量蛋白质标准(Pharmacia公司)。GST1-1、1-2、3-3的兔抗鼠多克隆抗体由日本Hirosaki University, School of Medicine的Dr.Kimihiko Satoh惠赠。碱性磷酸酶标记兔型二抗(Bio-Rad公司)
DMEM培养液：17.4g DMEM粉(Sigma产品)溶于900ml三蒸水中，全溶后，加入NaHCO3 3.7g，定容至1000ml,0.22μm滤膜过滤除菌后分装。临用时加10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素、链霉素。
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小牛血清(CS)：购自中国医学科学院基础医学研究所。临用前56℃水浴30min灭活补体。
胰酶(trypsin活力1∶250)：(Sigma产品)，用D-Hank液配成0.25%胰酶、。
丝裂霉素C(MMC)：(Sigma产品)用DMSO配制成1g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。临用时用无血清DMEM培养液稀释至0.25g/L。
松胞素B(CytB):(Sigma产品)用DMSO配制成2g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。用时释释至1g/L。
12-O-十四烷酰基-佛波-13-乙酸酯(TPA)：(Sigma产品)用DMSO配制成0.25g/L的储备液，分装后放-20℃保存。
6-巯基鸟嘌呤(6-TG):(Sigma产品)用0.5% Na2CO3溶液配制成1.0g/L溶液，4℃冰箱保存。临用前0.22μm滤膜过滤除菌。
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磷酸缓冲液(PBS)：KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H2O 2.89g、KCl0.2g、NaCl8.0g，溶于三蒸水，定容至1000ml，高压灭菌后，置4℃冰箱保存。
茶多酚、茶色素：茶多酚为淡黄色粉末(40%纯度)，茶色素为棕褐色粉末，为茶多酚的氧化产物，由中国农业科学院杭州茶科所提供。分别称取茶多酚、茶色素10g，溶于三蒸水，定容至100ml(浓度0.1g/L)。用定性滤纸抽滤。三蒸水10倍稀释后0.45μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃冰箱保存，终浓度为0.01g/L。另按所需浓度用蒸馏水溶解。
1.3 方法
1.3.1 V79细胞基因正向突变试验 参照Cajelli等的方法进行[5]，接种V79细胞6×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，换无血清培养基，并按选定的浓度加入受试物，作用2小时后，换为含10%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，分别消化各组细胞，以低密度接种使其表达6天，其间换液消化一次。接种2×105细胞/皿，加6-TG 5mg/L作突变体选择，另外接种200细胞/皿，不加6-TG作存活率测定。培养8天后计数存活和突变集落数，并计算突变率(每1×106个存活细胞中的突变细胞数)和抑制率。
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1.3.2 V79细胞周期阻滞法微核实验 参照Krishna等的方法进行[6]，接种V79细胞6×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，加入不同浓度的受试物，除阴性组外，其余组均加阳性物MMC 1mg/L置37℃、5% CO2条件下继续培养2小时后，加CytB 4.5g/L，再继续培养24小时，消化细胞，制片，Giemsa染色后镜检，计数每1000个双核细胞中的微核发生率。
1.3.3 V79细胞代谢协作实验 参照Yotti等的方法进行[7]，混合接种6×105 V79细胞及200M细胞/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养4小时后，加TPA 100mg/L及不同浓度的受试物，继续培养1小时，加6-TG 5mg/L。另外只接种200M细胞/皿，和上述同样的步骤加入不同浓度受试物。置37℃、5% CO2培养箱中继续培养8天，其间换液2次(只含6-TG 5mg/L及10% CS)，甲醇固定后，计数各皿集落数，以只接种200M细胞/皿而不加任何受试物平皿的集落数为100%，计算相对存活率及阻断率。
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式中，相对存活率为混合接种V79细胞及M细胞平皿与只接种M细胞平皿的相对存活率
1.3.4 TPA诱发小鼠耳皮肤炎性水肿实验 参照Gschwendt的方法进行[8]。实验分为3组，即高剂量组(50mg/只)、低剂量组(12.5mg/只)和对照组(给蒸馏水)，每组32只动物，雌雄各半，每天灌胃给受试物，受试物每天配制，连续灌胃7天，最后一次给药半小时后，各组右耳涂TPA(600ng/耳)，6小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用眼科打孔器在相同部位钻一圆片，万分之一天平称重，记左、右耳重。
1.3.5 Hela细胞存活率及软琼脂生长能力的测定 参照吴德丰的方法进行[9]。
存活率测定：接种Hela细胞3×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，加入不同浓度茶色素(阴性组除外)，作用48小时后，消化各组细胞，接种500细胞/皿，置37℃、5%CO2培养箱中继续培养8天后，计数存活集落数，计算抑制率。
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软琼脂生长能力的测定：在12孔板中，接种Hela细胞250/孔于1ml 0.3%的琼脂培养液内(含35%CS)，同时加入不同浓度的茶色素，置37℃、5% CO2培养箱中培养14天后，用放大镜计数各组形成的集落数，计算抑制率。
1.3.6 小鼠S180实体瘤的检测[10] 实验分为4组，每组60只动物，雌雄各半，每只动物分别灌胃给受试物0、12.5、25和50mg/天，连续灌胃至第9天，前右腿腋窝部皮肤经碘酒、酒精消毒后于皮下接种瘤细胞(5×106)，继续灌胃给受试物，9天后处死小鼠取出瘤体，去除脂肪、肌肉，万分之一天平称重，弃去瘤重较小的不合理数据(雄性小于1.0g、雌性小于0.7g)为有效动物数，用t检验法检验。
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1.3.7 Hep G2细胞醌还原酶(QR)活性测定[11，12] Hep G2细胞每孔按1×104细胞培养24小时后，重新换培养液100μl并加入受试茶样品(每个样品分别设2、10mg/L2个浓度)，对照组加相应量的培养液，继续培养24小时后，去掉培养液，每孔加入0.8%洋地黄皂甙50μl，于37℃作用10min,并于25℃振摇10分钟后，加入反应混合物(0.5mol/L Tris-HCl 7.5ml,100mg牛血清白蛋白，1.5%吐温-20 1ml,7.5mmol/L FAD 0.1ml,150mmol/L葡萄糖-6-磷酸1ml,50mmol/L NADP 90μl,300U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，45mg MTT用三蒸水配成150ml。临用前按1ml/L加入50mmol/L甲萘醌)200μl，反应5min,加入0.3mmol/L双香豆素50μl，于波长610nm比色测定QR活性。另将Hep G2细胞培养48小时后，去培养液，将板浸入0.2%结晶紫溶液，于37℃浸泡10min后用流动水清洗2min。然后加入0.5%十二烷基磺酸钠200μl，37℃培养10min。于610nm比色检测，作细胞定量分析。
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1.3.8 Hep G2的培养及处理 Hep G2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，3天换液一次，6天传代一次，采用0.25%的胰酶和0.01%EDTA混合消化液消化细胞。Hep G2细胞于指数生长期分别加入25、50、100mg/L的茶多酚和茶色素，继续培养，于处理后24h、48小时收集细胞，冻融2次后，匀浆进一步破碎细胞。9000g离心后取上清，再经105000g离心后，上清为胞浆，沉淀为微粒体。分装后-80℃保存或即刻测定GST活性。
1.3.9 大鼠肝癌前病变模型[13] 雄性Wistar大鼠150只，体重80～100g，由中国医学科学院动物繁育场提供。在温度为(24±1)℃和相对湿度为40%以上的条件下饲养，喂以常规大鼠饲料。适应性喂养3天后开始实验，共分为4组，阳性对照组(DEN)给予如下处理：自第7天起，每日经腹腔注射DEN10mg/kg BW，连续6天，继续喂养，至第40、41天分别经腹腔注射20% CCl40.5ml,第42天时行2/3肝叶切除，伤口缝合后继续喂养至第56天处死；茶多酚阳性组除给予DEN处理外，全程饮用0.1%茶多酚；茶色素阳性组除给予DEN处理外，全程饮用0.1%茶色素；阴性对照组以正常饲料和自来水喂养，动物处死后取肝脏匀浆，105000g分离胞浆进行GST及亚型测定。
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1.3.10 胞浆GST活性测定 按Habig方法以CDNB为底物，以其与GSH的结合产物(GS-CDNB)的增加速率来表示GST活性[14]。
1.3.11 GST亚型的测定(Western Blotting) 取肝胞浆蛋白30μg.经聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)分离胞浆蛋白[15]转硝酸纤维素膜，滤膜于5%的脱脂奶中阻断非特异性蛋白质结合位点，4℃过夜，依次用异性多克隆第一抗体(稀释度为1∶1500)、碱性磷酸酶标记二抗于4℃温育1小时。吐温20/Tris盐酸缓冲液(TTBS)漂洗滤膜3×5分钟。将滤膜放于显色底物液中显色。结果用Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-9000分析仪灰度扫描以进行蛋白相对定量。
1.4 统计学方法
本实验数据均用PEMS2.0统计分析软件包分析，数据用x±s表示，各组之间的 比较用χ2检验或t检验。
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2 结果
2.1 根据癌症发生的三阶段理论，对茶多酚及茶色素防癌作用强度进行比较。
2.1.1 对起动阶段的作用 茶多酚和茶色素对丝裂霉素C(以下简称MMC)诱发V79细胞正向突变的影响，结果见表1。茶多酚和茶色素浓度在10～100mg/L时，对V79细胞正向突变有抑制作用；浓度在10mg/L时，茶多酚和茶色素的抑制率分别为29.5%和43.9%，浓度升高，抑制率有升高趋势，当浓度达到100mg/L时，抑制率分别为59%和76.7%。茶多酚和茶色素对MMC诱发V79细胞微核形成影响的结果见表2。茶多酚和茶色素浓度在10～100mg/L范围时，对MMC诱发的微核发生有抑制作用，且随着浓度升高而加强。浓度升高到100mg/L，抑制率分别为62.0%和50.8%。结果表明茶多酚与茶色素均有明显的抗突变作用，对癌症发生的起动阶段有明显阻断作用。
表1 茶多酚及茶色素对MMC诱发V79细胞基因正向突变的影响
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处理
茶多酚
浓度
(mg/L)
突变集落数
(/106细胞)
存活率
(%)
突变数
(/106细胞)
抑制率
(%)
, 百拇医药 阳性对照组(MMC)
61
32.4
188.3
-
茶多酚组
10
43
32.4
132.7(1)
29.5
(MMC+茶多酚)
50
, 百拇医药
34
32.3
105.3(1)
45.3
100
19
24.9
76.3(1)
59.5
阳性对照组(MMC)
27
30.8
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219.0
-
茶色素
10
12
37.8
79.0(1)
43.9
(MMC+茶色素)
50
12
41.3
73.0(1)
, 百拇医药
66.7
100
8
39.5
51.0(2)
76.7
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05，(2) P<0.01 表2 茶多酚和茶色素对MMC诱发V79细胞微核发生的影响
处理
浓度
(mg/L)
微核数
, 百拇医药
(每1000个双核细胞)
抑制率
(%)
阳性对照组(MMC)
73.2
-
茶多酚组
10
52.9(1)
27.5
(MMC+茶多酚)
50
, 百拇医药 41.7(1)
42.2
100
27.4(1)
62.0
阳性对照组(MMC)
70.0
-
茶色素
10
48.0(1)
33.3
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(MMC+茶色素)
50
42.0(1)
43.1
100
37.0(1)
50.8
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05 2.1.2 对促癌阶段的作用 茶多酚和茶色素对细胞代谢协作的影响系选用V79细胞进行检测，以TPA为促癌剂。该试验是检测细胞间信息交流的一种有效手段，这种细胞间信息交流与细胞的生长调控密切相关，控制细胞间代谢协作是许多促癌物的共同机制。茶色素对TPA作用的阻断率高于茶多酚，结果见图1。V79与M细胞混合接种后，由于发生代谢协作作用，M细胞的相对存活率下降，但加入TPA后，这种代谢协作作用被抑制，相对存活率又升到较高水平。同时加入茶多酚或茶色素和TPA，浓度在10～20mg/L的范围内，M细胞的相对存活率下降，说明茶多酚和茶色素对TPA有阻断作用，且随着浓度升高，阻断作用加强。表明在肿瘤形成的促进阶段茶多酚和茶色素均有明显抑制作用。另茶色素对TPA诱发小鼠耳皮肤炎性水肿影响的试验(图2)结果表明茶色素用量在12.5mg/只时，即可减轻水肿程度，并有浓度-反应关系。此结果支持代谢协作试验的结果。
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图1 茶多酚 、茶色素对TPA诱发的V79细胞代谢协作的抑制作用
图2 茶色素对小鼠耳 水肿的抑制作用
2.1.3 对癌细胞增殖的作用 茶多酚和茶色素对Hela细胞存活率及软琼脂生长能力的影响：结果表明浓度在50mg/L时，茶多酚和茶色素对Hela细胞存活抑制率分别为10.6%和22.1%(图3)，浓度为100mg/L时，其抑制率分别为36.4%和34.1%(表3)，而Hela细胞软琼脂生长能力与动物体内成瘤率有良好的相关性。结果提示茶多酚和茶色素在肿瘤细胞增殖阶段有抑制作用。又以小鼠接种S180腹水瘤细胞，结果表明茶色素对肿瘤的生长具有抑制作用(表4)。
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图3 茶多酚 、茶色素对Hela细胞存活能力的影响
表3 茶多酚和茶色素对Hela细胞软琼脂生长能力的影响
处理
浓度
(mg/L)
集落数
抑制率
(%)
对照组
284.0
±
9.7
, 百拇医药
-
茶多酚组
20
269.1
±
21.2
5.0
50
250.3
±
16.8
11.9
100
, 百拇医药
180.7
±
9.7(1)
36.4
对照组
226.0
±
5.5
-
茶色素
10
221.0
±
, 百拇医药
5.6
2.2
50
176.0
±
16.3
22.1
100
149.0
±
14.4(1)
34.1
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1) P<0.05 表4 茶色素对小鼠S180实体瘤的影响
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性别
浓度
(mg.L)
有效
动物数
瘤重
(g)
抑制率(%)
雄
0
27
2.682±0.964
-
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1.25
26
2.073±0.724(1)
22.7
2.50
28
2.065±0.389(1)
23.0
5.00
26
1.859±0.597(2)
30.7
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雄
0
28
2.424±0.706
-
1.25
28
2.197±0.621
9.3
2.50
25
1.900±0.753(1)
21.6
, 百拇医药
5.00
26
1.680±0.945(1)
30.7
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05 (2)P<0.01 2.2 茶多酚、茶色素对机体抗氧化和解毒能力的作用
抗氧化作用是茶叶防癌作用的主要机制之一。本次结果表明茶色素浓度为2mg/L时醌还原酶(QR)活性诱导率为58.8%，浓度为10mg/L时，酶活性诱导率为60.4%，其单体茶红素和茶黄素对Hep G2肝肿瘤细胞中醌还原酯与对照组相比亦有增高，浓度在10mg/L时酶活性增高分别为30.3%和18.5%，见表5。
表5 茶多酚、茶色素及其单体对HepG2细胞醌还原酶活性的诱导作用
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处理
浓度
(mg/L)
QR活性
(mmol/g)
诱导率
(%)
对照组
-
248.6±62.6
-
茶多酚组
2
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336.8±43.8
35.8
10
430.4±71.8(1)
73.0
茶色素组
2
394.8±97.4(2)
58.8
10
399.0±57.6(2)
60.4
, 百拇医药
茶色素组
2
298.2±43.6
19.9
10
324.2±29.0(2)
30.3
茶黄素组
2
244.4±47.0
-
10
294.8±51.8
, 百拇医药
18.5
注：与相同时间点未处理组比较，经χ2检验，(1)P<0.05， (2) P<0. 01 另用茶多酚、茶色素处理Hep G2肝肿瘤细胞可引起谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性的升高，结果见图4。处理24小时后，100mg/L的茶多酚和茶色素即有明显的诱导作用，并有明显的浓度-反应关系和时间-反应关系。100mg/L的茶多酚处理48小时可使GST活性升高64.6%，同样浓度的茶色素处理48小时后，GST活性增加84.3%。
图4 茶多酚、茶色素对Hep G2细胞GST活性的影响
用DEN诱发大鼠肝癌癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低。而饮用0.1%茶多酚、茶色素2个月的大鼠肝脏胞浆GST显著高于对照组；茶多酚的诱导率为25%，茶色素的诱导率为18%，见表6。用Western Blot方法检测GST 1-1、1-2、3-3蛋白水平亦均有明显升高(见表7)，其中茶多酚和茶色素对GST 1-1的诱导作用比其它两个亚型更为明显，两者的作用强度相近。对GST 3-2的作用以茶多酚较强，对GST 1-3的诱导作用则茶色素优于茶多酚。
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表6 茶多酚、茶色素对肝癌前病变大鼠肝脏胞浆GST活性的影响(n=12)
组别
胞浆GST活性
U/(min.g prot.)
诱导率
(%)
阳性对照组(DEN)
456.38±84.68
-
茶多酚组
573.10±95.58(1)
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25
DEN+0.1%茶色素组
542.93±80.81(1)
18
阴性对照组
514.82±77.88
-
注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P<0.05 表7 茶多酚、茶色素对肝癌前病变大鼠肝脏组织胞浆GST亚型的影响(n=6)
组别
GST1-1亚型
GST1-2亚型
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GST3-3亚型
阳性对照组
1.095±0.163
0.742±0.255
0.816±0.131
茶多酚阳性组
1.510±0.288(1)
1.280±0.102(1)
1.146±0.162(1)
茶色素阳性组
1.454±0.245(1)
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1.148±0.089(1)
1.337±0.374(2)
阴性对照组
0.861±0.396
1.055±0.123(2)
0.986±0.031(2)
注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P<0.01(2)P<0.05 3 讨论
在短期试验中，茶色素对丝裂霉素C诱发的V79细胞基因正向突变、V79细胞代谢协作试验及Hela细胞存活和软琼脂生长试验均表现出与茶多酚相类似的抑制作用；在小鼠S180肿瘤模型中，茶色素也显示对肿瘤生长有明显抑制作用。这些结果与国外文献和我们实验室过去得到的有关红茶的防癌作用的结果相一致[16，17]。
, 百拇医药
茶色素对肿瘤的抑制和预防作用机理可能与其抗氧化作用及诱导Ⅱ相代谢酶的作用有关。体外对Hep G2细胞作用的研究结果提示茶色素可能通过诱导Ⅱ相代谢酶活性，加速致癌剂的结合反应，促进对致癌物活性代谢产物的排泄，从而降低其进一步对DNA、蛋白等生物大分子的毒性作用[12]。本研究还表明茶色素的抗氧化作用至少不弱于茶多酚。比较茶色素和其主要单体成分茶黄素和茶红素的作用发现，两种单体成分对QR的诱导作用之和小于茶色素的作用，说明还有其它有效成分。在以DEN启动，辅以CCl4和肝切除促进的肝癌前病变模型中，阳性对照组动物的GST活性较正常动物降低，给茶色素、茶多酚后水平有明显升高，从GST各亚型Western blotting试验结果看，茶多酚、茶色素对GST 1-1、1-2、3-3均有诱导作用。茶多酚和茶色素对GST1-1有着相同强度的，诱导作用，比其它亚型表现明显；对GST1-2的诱导作用以茶多酚为主，茶色素对GST3-3有较强的诱导作用。GST1-1、1-2都属于GSTα，GST3-3则属GSTμ；GSTα主要对氢过氧化物有较高的亲和力，其特征性的反应为GSH-Px(不含Se)活性，因此它对于清除过氧化产物有重要意义。它也参与黄曲霉毒素B1-8，9-氧化物(AFB1-8,9-oxide)的解毒过程，另外，GSTα可作为结合蛋白，还具有结合、运输功能，与一些活性亲电物结合可使其失活或抑制；而GSTμ主要参与GSH与DMBA(二甲基苯并蒽)、B[a]P(苯丙芘)、1-nitropyrene(1-硝基芘)的环氧化物的结合解 毒过程[18]，它的另一作用是参与DEN代谢过程的去硝基反应，对DEN的代谢解毒和排出有重要意义[19]。因此，茶多酚能清除脂质过氧化产物，对抗脂质过氧化损伤；而茶色素则在本试验中对致癌剂的解毒作用更有意义，这可能与它们的防癌作用有关。
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考虑到茶色素在红茶的含量大致与茶多酚在绿茶中的含量(30%～40%)相当，而其化学性质远比茶多酚稳定，因此，茶色素可能是一种较为理想的化学预防剂。如同茶多酚一样，茶色素是一个混合物，主要包括茶红素、茶黄素和茶褐素。在进一步研究茶色素的作用时，有必要同时对茶色素各种单一组分的作用进行比较。同时，鉴于国内在茶色素预防心血管病的临床观察方面已取得初步结果[20]，我们认为茶色素是一种很值得进一步研究和开发的茶组分。
国家自然科学基金资助项目(No.39330180)
韩驰，女，大学，研究员
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(1999-07-14收稿), 百拇医药
单位：韩驰(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050)；宫芸芸(中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050)
关键词：茶多酚；茶色素；癌症短筛试验
卫生研究 JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH 1999 Vol 摘要 作者用一组体外短期检测试验，检验了茶色素在肿瘤的起动、促进、增殖阶段的作用并与茶多酚进行比较。选用基因正向突变和周期阻断法微核实验作为起动阶段指标，选用代谢协作和小鼠耳炎性水肿实验作为促癌阶段指标，选用Hela细胞存活率和软琼脂生长及小鼠S180实体瘤实验，检测对肿瘤细胞存活和增殖的影响。结果发现茶色素与茶多酚在肿瘤发生的起动、促进和增殖各阶段均显示出明显的保护作用；体外给予茶多酚、茶色素处理Hep G2肝肿瘤细胞，发现茶色素及其单体成分及茶多酚可诱导醌还原酶(QR)活性和谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性；在用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的大鼠肝癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低；饮用0.1%茶多酚、茶色素可显著诱导大鼠肝GST活性，茶多酚的诱导率为25%，茶色素的诱导率为18%，而且GST1-1、1-2、3-3蛋白表达均有明显升高。结果表明茶色素与茶多酚同样具有抗肿瘤作用，茶色素对具有抗氧化作用和解毒作用的Ⅱ相代谢酶QR和GST具有诱导作用，这可能是茶色素防癌作用的重要机制。
, 百拇医药
分类号 R730.1 TS272
Experimental studies on the cancer chemoprevention of tea pigments
Han Chi, Gong Yunyun
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
A batch of short-term tests were used to examine the effects of tea pigments on three stages of carcinogenesis, i.e.initiation, promotion and progression. Forward gene mutation test and micronuclei test were used to study the initiation stage of carcinogenesis;metabolic cooperation test and mice ear test to study the promotion stage. Viability and growth ability of Hela cells in soft agar and S180 solid tumor test in mice were used to examine the effect of tea pigments on the third stage of carcinogenesis. The results showed that both tea pigments and tea polyphenols had significantly protective effects on initiation, promotion and progression stages in carcinogenesis. In vitro study showed that tea pigments and tea polyphenols could induce QR and GST activity in Hep G2 cells. Oral administration of 0.1% tea polyphenols and 0.1% tea pigments could increase GST activity in rat liver by 25% and 18% respectively,and this increase was accompanied by the significant increase of GST 1-1,1-2 and 3-3 protein expression level in rat liver. Our results suggested that the antrcancer effect of tea pigments was the same as that of tea polyphenols, and the anticancer properties of tea pigments might be mediated by activating the enzymes such as QR and GST,which play important roles in the detoxification and exclusion of carcinogen.
, 百拇医药
Key words: tea polyphenols,tea pigments,short-term screen test for cancer
近年来国内外科学家运用现代科学技术研究茶的防癌作用，取得大量有意义的结果，许多动物试验证实饮茶对化学物质引起的食道、前胃、肝、大肠、口腔等多处肿瘤的发生具有明显预防作用[1，2]。当前，寻找茶中的防癌有效成分已成为进一步研究的焦点之一。这方面，国内外学者大都认为茶多酚是茶的主要有效成分，因为茶多酚具有抗氧化、诱导解毒酶、调节机体免疫等作用。然而，我们最近的研究结果表明茶叶中另一类主要成分茶色素对实验性肿瘤也具有不亚于茶多酚的预防作用。茶色素是茶多酚的氧化产物，是红茶的主要成分，其主要成分是茶红素和茶黄素。已有报道，茶色素也具有很强的抗氧化作用。为了进一步研究茶色素的作用及其机理，本研究选择一组体外短期检测试验，对茶色素在致癌过程的起动、促进、增殖阶段的作用进行检测，并与茶多酚的作用进行比较[3，4]。此外，本研究还对茶色素对实验性肝肿瘤发生的抑制作用、肝细胞抗氧化防御系统、以及对谷胱甘肽硫转移酶多种亚型的表达的影响等进行了一系列探讨。
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1 材料和方法
1.1 仪器设备
超净工作台：Environ Air Control Inc 10319(美国)；CO2培养箱：(SHEL-LAB 1825TC，美国)；倒置显微镜：(01ympusAT-Ⅱ，日本)；光学显微镜：(Nikon AFX-Ⅱ 日本)；高速电动匀浆器(Tekmar公司，西德)；高速离心机(Beckman GS-15R，美国)；超速离心机(Beckman L7-65,美国)；。电泳仪、电转槽(北京东方特立科贸中心)；台式多用恒温振荡器(江苏省太仓鹿河生化仪器厂)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；电热恒温干燥箱(南通)；薄层扫描分析仪(Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-900,日本)。
1.2 材料
, 百拇医药 1.2.1 细胞 中国地鼠V79细胞(6TG敏感型)、M细胞(6TG耐受型)、BALB/C3T3细胞株均购自中国医学科学院肿瘤医学研究所，HeLa细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，人肝癌细胞株Hep G2细胞购自北大医院病毒室。
1.2.2 主要试剂及其配制 CDNB、GSH、二乙基亚硝胺(DEN)、双丙烯酰胺、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(NBT)、氮盐四唑(BCIP)(Sigma产品)；丙烯酰胺(Fluka公司)；Tris (Serva公司)；牛血清白蛋白(B.M.公司)；低分子量蛋白质标准(Pharmacia公司)。GST1-1、1-2、3-3的兔抗鼠多克隆抗体由日本Hirosaki University, School of Medicine的Dr.Kimihiko Satoh惠赠。碱性磷酸酶标记兔型二抗(Bio-Rad公司)
DMEM培养液：17.4g DMEM粉(Sigma产品)溶于900ml三蒸水中，全溶后，加入NaHCO3 3.7g，定容至1000ml,0.22μm滤膜过滤除菌后分装。临用时加10%(v/v)小牛血清和1%(v/v)青霉素、链霉素。
, 百拇医药
小牛血清(CS)：购自中国医学科学院基础医学研究所。临用前56℃水浴30min灭活补体。
胰酶(trypsin活力1∶250)：(Sigma产品)，用D-Hank液配成0.25%胰酶、。
丝裂霉素C(MMC)：(Sigma产品)用DMSO配制成1g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。临用时用无血清DMEM培养液稀释至0.25g/L。
松胞素B(CytB):(Sigma产品)用DMSO配制成2g/L的储备液，分装后置-20℃冰箱。用时释释至1g/L。
12-O-十四烷酰基-佛波-13-乙酸酯(TPA)：(Sigma产品)用DMSO配制成0.25g/L的储备液，分装后放-20℃保存。
6-巯基鸟嘌呤(6-TG):(Sigma产品)用0.5% Na2CO3溶液配制成1.0g/L溶液，4℃冰箱保存。临用前0.22μm滤膜过滤除菌。
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磷酸缓冲液(PBS)：KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H2O 2.89g、KCl0.2g、NaCl8.0g，溶于三蒸水，定容至1000ml，高压灭菌后，置4℃冰箱保存。
茶多酚、茶色素：茶多酚为淡黄色粉末(40%纯度)，茶色素为棕褐色粉末，为茶多酚的氧化产物，由中国农业科学院杭州茶科所提供。分别称取茶多酚、茶色素10g，溶于三蒸水，定容至100ml(浓度0.1g/L)。用定性滤纸抽滤。三蒸水10倍稀释后0.45μm滤膜过滤除菌，分装后-20℃冰箱保存，终浓度为0.01g/L。另按所需浓度用蒸馏水溶解。
1.3 方法
1.3.1 V79细胞基因正向突变试验 参照Cajelli等的方法进行[5]，接种V79细胞6×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，换无血清培养基，并按选定的浓度加入受试物，作用2小时后，换为含10%小牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，分别消化各组细胞，以低密度接种使其表达6天，其间换液消化一次。接种2×105细胞/皿，加6-TG 5mg/L作突变体选择，另外接种200细胞/皿，不加6-TG作存活率测定。培养8天后计数存活和突变集落数，并计算突变率(每1×106个存活细胞中的突变细胞数)和抑制率。
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1.3.2 V79细胞周期阻滞法微核实验 参照Krishna等的方法进行[6]，接种V79细胞6×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养24小时后，加入不同浓度的受试物，除阴性组外，其余组均加阳性物MMC 1mg/L置37℃、5% CO2条件下继续培养2小时后，加CytB 4.5g/L，再继续培养24小时，消化细胞，制片，Giemsa染色后镜检，计数每1000个双核细胞中的微核发生率。
1.3.3 V79细胞代谢协作实验 参照Yotti等的方法进行[7]，混合接种6×105 V79细胞及200M细胞/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5% CO2培养箱中培养4小时后，加TPA 100mg/L及不同浓度的受试物，继续培养1小时，加6-TG 5mg/L。另外只接种200M细胞/皿，和上述同样的步骤加入不同浓度受试物。置37℃、5% CO2培养箱中继续培养8天，其间换液2次(只含6-TG 5mg/L及10% CS)，甲醇固定后，计数各皿集落数，以只接种200M细胞/皿而不加任何受试物平皿的集落数为100%，计算相对存活率及阻断率。
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式中，相对存活率为混合接种V79细胞及M细胞平皿与只接种M细胞平皿的相对存活率
1.3.4 TPA诱发小鼠耳皮肤炎性水肿实验 参照Gschwendt的方法进行[8]。实验分为3组，即高剂量组(50mg/只)、低剂量组(12.5mg/只)和对照组(给蒸馏水)，每组32只动物，雌雄各半，每天灌胃给受试物，受试物每天配制，连续灌胃7天，最后一次给药半小时后，各组右耳涂TPA(600ng/耳)，6小时后颈椎脱臼处死小鼠，剪下双耳，用眼科打孔器在相同部位钻一圆片，万分之一天平称重，记左、右耳重。
1.3.5 Hela细胞存活率及软琼脂生长能力的测定 参照吴德丰的方法进行[9]。
存活率测定：接种Hela细胞3×105/皿于DMEM培养液中(含10%小牛血清)，置37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，加入不同浓度茶色素(阴性组除外)，作用48小时后，消化各组细胞，接种500细胞/皿，置37℃、5%CO2培养箱中继续培养8天后，计数存活集落数，计算抑制率。
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软琼脂生长能力的测定：在12孔板中，接种Hela细胞250/孔于1ml 0.3%的琼脂培养液内(含35%CS)，同时加入不同浓度的茶色素，置37℃、5% CO2培养箱中培养14天后，用放大镜计数各组形成的集落数，计算抑制率。
1.3.6 小鼠S180实体瘤的检测[10] 实验分为4组，每组60只动物，雌雄各半，每只动物分别灌胃给受试物0、12.5、25和50mg/天，连续灌胃至第9天，前右腿腋窝部皮肤经碘酒、酒精消毒后于皮下接种瘤细胞(5×106)，继续灌胃给受试物，9天后处死小鼠取出瘤体，去除脂肪、肌肉，万分之一天平称重，弃去瘤重较小的不合理数据(雄性小于1.0g、雌性小于0.7g)为有效动物数，用t检验法检验。
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1.3.7 Hep G2细胞醌还原酶(QR)活性测定[11，12] Hep G2细胞每孔按1×104细胞培养24小时后，重新换培养液100μl并加入受试茶样品(每个样品分别设2、10mg/L2个浓度)，对照组加相应量的培养液，继续培养24小时后，去掉培养液，每孔加入0.8%洋地黄皂甙50μl，于37℃作用10min,并于25℃振摇10分钟后，加入反应混合物(0.5mol/L Tris-HCl 7.5ml,100mg牛血清白蛋白，1.5%吐温-20 1ml,7.5mmol/L FAD 0.1ml,150mmol/L葡萄糖-6-磷酸1ml,50mmol/L NADP 90μl,300U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，45mg MTT用三蒸水配成150ml。临用前按1ml/L加入50mmol/L甲萘醌)200μl，反应5min,加入0.3mmol/L双香豆素50μl，于波长610nm比色测定QR活性。另将Hep G2细胞培养48小时后，去培养液，将板浸入0.2%结晶紫溶液，于37℃浸泡10min后用流动水清洗2min。然后加入0.5%十二烷基磺酸钠200μl，37℃培养10min。于610nm比色检测，作细胞定量分析。
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1.3.8 Hep G2的培养及处理 Hep G2细胞采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，3天换液一次，6天传代一次，采用0.25%的胰酶和0.01%EDTA混合消化液消化细胞。Hep G2细胞于指数生长期分别加入25、50、100mg/L的茶多酚和茶色素，继续培养，于处理后24h、48小时收集细胞，冻融2次后，匀浆进一步破碎细胞。9000g离心后取上清，再经105000g离心后，上清为胞浆，沉淀为微粒体。分装后-80℃保存或即刻测定GST活性。
1.3.9 大鼠肝癌前病变模型[13] 雄性Wistar大鼠150只，体重80～100g，由中国医学科学院动物繁育场提供。在温度为(24±1)℃和相对湿度为40%以上的条件下饲养，喂以常规大鼠饲料。适应性喂养3天后开始实验，共分为4组，阳性对照组(DEN)给予如下处理：自第7天起，每日经腹腔注射DEN10mg/kg BW，连续6天，继续喂养，至第40、41天分别经腹腔注射20% CCl40.5ml,第42天时行2/3肝叶切除，伤口缝合后继续喂养至第56天处死；茶多酚阳性组除给予DEN处理外，全程饮用0.1%茶多酚；茶色素阳性组除给予DEN处理外，全程饮用0.1%茶色素；阴性对照组以正常饲料和自来水喂养，动物处死后取肝脏匀浆，105000g分离胞浆进行GST及亚型测定。
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1.3.10 胞浆GST活性测定 按Habig方法以CDNB为底物，以其与GSH的结合产物(GS-CDNB)的增加速率来表示GST活性[14]。
1.3.11 GST亚型的测定(Western Blotting) 取肝胞浆蛋白30μg.经聚丙烯酰胺凝胶电脉(SDS-PAGE)分离胞浆蛋白[15]转硝酸纤维素膜，滤膜于5%的脱脂奶中阻断非特异性蛋白质结合位点，4℃过夜，依次用异性多克隆第一抗体(稀释度为1∶1500)、碱性磷酸酶标记二抗于4℃温育1小时。吐温20/Tris盐酸缓冲液(TTBS)漂洗滤膜3×5分钟。将滤膜放于显色底物液中显色。结果用Shimadzu Dual-wavelength flying-spot Scanner CS-9000分析仪灰度扫描以进行蛋白相对定量。
1.4 统计学方法
本实验数据均用PEMS2.0统计分析软件包分析，数据用x±s表示，各组之间的 比较用χ2检验或t检验。
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2 结果
2.1 根据癌症发生的三阶段理论，对茶多酚及茶色素防癌作用强度进行比较。
2.1.1 对起动阶段的作用 茶多酚和茶色素对丝裂霉素C(以下简称MMC)诱发V79细胞正向突变的影响，结果见表1。茶多酚和茶色素浓度在10～100mg/L时，对V79细胞正向突变有抑制作用；浓度在10mg/L时，茶多酚和茶色素的抑制率分别为29.5%和43.9%，浓度升高，抑制率有升高趋势，当浓度达到100mg/L时，抑制率分别为59%和76.7%。茶多酚和茶色素对MMC诱发V79细胞微核形成影响的结果见表2。茶多酚和茶色素浓度在10～100mg/L范围时，对MMC诱发的微核发生有抑制作用，且随着浓度升高而加强。浓度升高到100mg/L，抑制率分别为62.0%和50.8%。结果表明茶多酚与茶色素均有明显的抗突变作用，对癌症发生的起动阶段有明显阻断作用。
表1 茶多酚及茶色素对MMC诱发V79细胞基因正向突变的影响
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处理
茶多酚
浓度
(mg/L)
突变集落数
(/106细胞)
存活率
(%)
突变数
(/106细胞)
抑制率
(%)
, 百拇医药 阳性对照组(MMC)
61
32.4
188.3
-
茶多酚组
10
43
32.4
132.7(1)
29.5
(MMC+茶多酚)
50
, 百拇医药
34
32.3
105.3(1)
45.3
100
19
24.9
76.3(1)
59.5
阳性对照组(MMC)
27
30.8
, http://www.100md.com
219.0
-
茶色素
10
12
37.8
79.0(1)
43.9
(MMC+茶色素)
50
12
41.3
73.0(1)
, 百拇医药
66.7
100
8
39.5
51.0(2)
76.7
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05，(2) P<0.01 表2 茶多酚和茶色素对MMC诱发V79细胞微核发生的影响
处理
浓度
(mg/L)
微核数
, 百拇医药
(每1000个双核细胞)
抑制率
(%)
阳性对照组(MMC)
73.2
-
茶多酚组
10
52.9(1)
27.5
(MMC+茶多酚)
50
, 百拇医药 41.7(1)
42.2
100
27.4(1)
62.0
阳性对照组(MMC)
70.0
-
茶色素
10
48.0(1)
33.3
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(MMC+茶色素)
50
42.0(1)
43.1
100
37.0(1)
50.8
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05 2.1.2 对促癌阶段的作用 茶多酚和茶色素对细胞代谢协作的影响系选用V79细胞进行检测，以TPA为促癌剂。该试验是检测细胞间信息交流的一种有效手段，这种细胞间信息交流与细胞的生长调控密切相关，控制细胞间代谢协作是许多促癌物的共同机制。茶色素对TPA作用的阻断率高于茶多酚，结果见图1。V79与M细胞混合接种后，由于发生代谢协作作用，M细胞的相对存活率下降，但加入TPA后，这种代谢协作作用被抑制，相对存活率又升到较高水平。同时加入茶多酚或茶色素和TPA，浓度在10～20mg/L的范围内，M细胞的相对存活率下降，说明茶多酚和茶色素对TPA有阻断作用，且随着浓度升高，阻断作用加强。表明在肿瘤形成的促进阶段茶多酚和茶色素均有明显抑制作用。另茶色素对TPA诱发小鼠耳皮肤炎性水肿影响的试验(图2)结果表明茶色素用量在12.5mg/只时，即可减轻水肿程度，并有浓度-反应关系。此结果支持代谢协作试验的结果。
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图1 茶多酚 、茶色素对TPA诱发的V79细胞代谢协作的抑制作用
图2 茶色素对小鼠耳 水肿的抑制作用
2.1.3 对癌细胞增殖的作用 茶多酚和茶色素对Hela细胞存活率及软琼脂生长能力的影响：结果表明浓度在50mg/L时，茶多酚和茶色素对Hela细胞存活抑制率分别为10.6%和22.1%(图3)，浓度为100mg/L时，其抑制率分别为36.4%和34.1%(表3)，而Hela细胞软琼脂生长能力与动物体内成瘤率有良好的相关性。结果提示茶多酚和茶色素在肿瘤细胞增殖阶段有抑制作用。又以小鼠接种S180腹水瘤细胞，结果表明茶色素对肿瘤的生长具有抑制作用(表4)。
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图3 茶多酚 、茶色素对Hela细胞存活能力的影响
表3 茶多酚和茶色素对Hela细胞软琼脂生长能力的影响
处理
浓度
(mg/L)
集落数
抑制率
(%)
对照组
284.0
±
9.7
, 百拇医药
-
茶多酚组
20
269.1
±
21.2
5.0
50
250.3
±
16.8
11.9
100
, 百拇医药
180.7
±
9.7(1)
36.4
对照组
226.0
±
5.5
-
茶色素
10
221.0
±
, 百拇医药
5.6
2.2
50
176.0
±
16.3
22.1
100
149.0
±
14.4(1)
34.1
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1) P<0.05 表4 茶色素对小鼠S180实体瘤的影响
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性别
浓度
(mg.L)
有效
动物数
瘤重
(g)
抑制率(%)
雄
0
27
2.682±0.964
-
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1.25
26
2.073±0.724(1)
22.7
2.50
28
2.065±0.389(1)
23.0
5.00
26
1.859±0.597(2)
30.7
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雄
0
28
2.424±0.706
-
1.25
28
2.197±0.621
9.3
2.50
25
1.900±0.753(1)
21.6
, 百拇医药
5.00
26
1.680±0.945(1)
30.7
注：与阳性对照组比较，经χ2检验，(1)P<0.05 (2)P<0.01 2.2 茶多酚、茶色素对机体抗氧化和解毒能力的作用
抗氧化作用是茶叶防癌作用的主要机制之一。本次结果表明茶色素浓度为2mg/L时醌还原酶(QR)活性诱导率为58.8%，浓度为10mg/L时，酶活性诱导率为60.4%，其单体茶红素和茶黄素对Hep G2肝肿瘤细胞中醌还原酯与对照组相比亦有增高，浓度在10mg/L时酶活性增高分别为30.3%和18.5%，见表5。
表5 茶多酚、茶色素及其单体对HepG2细胞醌还原酶活性的诱导作用
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处理
浓度
(mg/L)
QR活性
(mmol/g)
诱导率
(%)
对照组
-
248.6±62.6
-
茶多酚组
2
, 百拇医药
336.8±43.8
35.8
10
430.4±71.8(1)
73.0
茶色素组
2
394.8±97.4(2)
58.8
10
399.0±57.6(2)
60.4
, 百拇医药
茶色素组
2
298.2±43.6
19.9
10
324.2±29.0(2)
30.3
茶黄素组
2
244.4±47.0
-
10
294.8±51.8
, 百拇医药
18.5
注：与相同时间点未处理组比较，经χ2检验，(1)P<0.05， (2) P<0. 01 另用茶多酚、茶色素处理Hep G2肝肿瘤细胞可引起谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性的升高，结果见图4。处理24小时后，100mg/L的茶多酚和茶色素即有明显的诱导作用，并有明显的浓度-反应关系和时间-反应关系。100mg/L的茶多酚处理48小时可使GST活性升高64.6%，同样浓度的茶色素处理48小时后，GST活性增加84.3%。
图4 茶多酚、茶色素对Hep G2细胞GST活性的影响
用DEN诱发大鼠肝癌癌前病变，阳性对照组的GST水平有一定程度的降低。而饮用0.1%茶多酚、茶色素2个月的大鼠肝脏胞浆GST显著高于对照组；茶多酚的诱导率为25%，茶色素的诱导率为18%，见表6。用Western Blot方法检测GST 1-1、1-2、3-3蛋白水平亦均有明显升高(见表7)，其中茶多酚和茶色素对GST 1-1的诱导作用比其它两个亚型更为明显，两者的作用强度相近。对GST 3-2的作用以茶多酚较强，对GST 1-3的诱导作用则茶色素优于茶多酚。
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表6 茶多酚、茶色素对肝癌前病变大鼠肝脏胞浆GST活性的影响(n=12)
组别
胞浆GST活性
U/(min.g prot.)
诱导率
(%)
阳性对照组(DEN)
456.38±84.68
-
茶多酚组
573.10±95.58(1)
, 百拇医药
25
DEN+0.1%茶色素组
542.93±80.81(1)
18
阴性对照组
514.82±77.88
-
注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P<0.05 表7 茶多酚、茶色素对肝癌前病变大鼠肝脏组织胞浆GST亚型的影响(n=6)
组别
GST1-1亚型
GST1-2亚型
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GST3-3亚型
阳性对照组
1.095±0.163
0.742±0.255
0.816±0.131
茶多酚阳性组
1.510±0.288(1)
1.280±0.102(1)
1.146±0.162(1)
茶色素阳性组
1.454±0.245(1)
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1.148±0.089(1)
1.337±0.374(2)
阴性对照组
0.861±0.396
1.055±0.123(2)
0.986±0.031(2)
注：与阳性对照组比较，经t检验，(1)P<0.01(2)P<0.05 3 讨论
在短期试验中，茶色素对丝裂霉素C诱发的V79细胞基因正向突变、V79细胞代谢协作试验及Hela细胞存活和软琼脂生长试验均表现出与茶多酚相类似的抑制作用；在小鼠S180肿瘤模型中，茶色素也显示对肿瘤生长有明显抑制作用。这些结果与国外文献和我们实验室过去得到的有关红茶的防癌作用的结果相一致[16，17]。
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茶色素对肿瘤的抑制和预防作用机理可能与其抗氧化作用及诱导Ⅱ相代谢酶的作用有关。体外对Hep G2细胞作用的研究结果提示茶色素可能通过诱导Ⅱ相代谢酶活性，加速致癌剂的结合反应，促进对致癌物活性代谢产物的排泄，从而降低其进一步对DNA、蛋白等生物大分子的毒性作用[12]。本研究还表明茶色素的抗氧化作用至少不弱于茶多酚。比较茶色素和其主要单体成分茶黄素和茶红素的作用发现，两种单体成分对QR的诱导作用之和小于茶色素的作用，说明还有其它有效成分。在以DEN启动，辅以CCl4和肝切除促进的肝癌前病变模型中，阳性对照组动物的GST活性较正常动物降低，给茶色素、茶多酚后水平有明显升高，从GST各亚型Western blotting试验结果看，茶多酚、茶色素对GST 1-1、1-2、3-3均有诱导作用。茶多酚和茶色素对GST1-1有着相同强度的，诱导作用，比其它亚型表现明显；对GST1-2的诱导作用以茶多酚为主，茶色素对GST3-3有较强的诱导作用。GST1-1、1-2都属于GSTα，GST3-3则属GSTμ；GSTα主要对氢过氧化物有较高的亲和力，其特征性的反应为GSH-Px(不含Se)活性，因此它对于清除过氧化产物有重要意义。它也参与黄曲霉毒素B1-8，9-氧化物(AFB1-8,9-oxide)的解毒过程，另外，GSTα可作为结合蛋白，还具有结合、运输功能，与一些活性亲电物结合可使其失活或抑制；而GSTμ主要参与GSH与DMBA(二甲基苯并蒽)、B[a]P(苯丙芘)、1-nitropyrene(1-硝基芘)的环氧化物的结合解 毒过程[18]，它的另一作用是参与DEN代谢过程的去硝基反应，对DEN的代谢解毒和排出有重要意义[19]。因此，茶多酚能清除脂质过氧化产物，对抗脂质过氧化损伤；而茶色素则在本试验中对致癌剂的解毒作用更有意义，这可能与它们的防癌作用有关。
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考虑到茶色素在红茶的含量大致与茶多酚在绿茶中的含量(30%～40%)相当，而其化学性质远比茶多酚稳定，因此，茶色素可能是一种较为理想的化学预防剂。如同茶多酚一样，茶色素是一个混合物，主要包括茶红素、茶黄素和茶褐素。在进一步研究茶色素的作用时，有必要同时对茶色素各种单一组分的作用进行比较。同时，鉴于国内在茶色素预防心血管病的临床观察方面已取得初步结果[20]，我们认为茶色素是一种很值得进一步研究和开发的茶组分。
国家自然科学基金资助项目(No.39330180)
韩驰，女，大学，研究员
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