硝酸铈对大鼠组织中ATP酶活性的影响
作者：杨维东 王艇 雷衡毅 杨燕生
单位：杨维东(暨南大学生物工程系，广州 510632)；王艇(中山大学生命科学学院)；雷衡毅(暨南大学生物工程系，广州 510632)；杨燕生(暨南大学生物工程系，广州 510632)
关键词：铈；Ca2+-ATP酶；K+、Na+-ATP酶；Mg2+-ATP酶；大鼠
卫生研究990603 摘要 研究了硝酸铈对大鼠内脏、大脑、肌肉中ATP酶活性的影响。结果显示，连续腹腔注射低浓度硝酸铈后，大鼠肝脏、肾脏、心脏等组织中Ca2+-ATP酶，K+、Na+-ATP酶，Mg2+-ATP酶活性明显增强；而当注射高浓度硝酸铈时，酶活性均未发生明显变化。估计这是机体受到外界毒物影响后的一种保护机制。
分类号 Q557 O614.332
, 百拇医药
Effect of cerous nitrate on the activity of ATPase in tissues
Yang Weidong, Wang Ting, Lei Hengyi， Yang Yansheng
(Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632,China)
The effect of cerous nitrate on the activity of some ion-dependent ATPase such as Ca2+-ATPase, K+，Na+-ATPase and Mg2+-ATPase was studied in vivo. The results showed that Ca2+-ATPase, K+，Na+-ATPase and Mg2+-ATPase activity was increased in rat liver, kidney and heart after recurrent intraperitoneal administration of low dose of cerous nitrate(1mg/kg)，but no changes happened for these enzymes activity after high cerous nitrate administration(50mg/kg).The mechanism of the phenomena was discussed.
, 百拇医药
Key words:cerium, Ca2+-ATPase,K+、Na+-ATPase,Mg2+-ATPase,rat
近年来研究发现，细胞内Na+、K+、Ca2+离子代谢异常，可能是某些病理变化和疾病发病的重要机制，而细胞膜上ATP酶活性对维持细胞内外Na+、Ca2+离子转运有着十分重要的意义[1，2]；同时自由基引起的脂质过氧化反应与维持细胞内Na+ 、Ca2+离子转运的ATP酶活性有相关关系[3]。
由于稀土元素，特别是硝酸铈在农业和医药上的广泛运用，稀土元素将不可避免地通过生物圈进入人体，然而其生物效应目前尚不清楚。我们曾研究发现，高剂量的硝酸铈腹腔注射后能够引起大鼠肝脏组织脂质过氧化作用明显增强[4]。本文将考察连续注射稀土元素以后ATP酶包括Na+、K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的变化情况。
, 百拇医药
1 实验材料
Ce(NO3)3溶液：氧化铈(CeO2)，纯度99.95%，购自广州珠江冶炼厂。在浓盐酸和盐酸羟氨中溶解后，加入过量草酸使其沉淀，然后用蒸馏水洗涤沉淀。将沉淀在浓硝酸中溶解后，加热除去多余的硝酸，用EDTA标准溶液进行铈浓度的标定，灭菌后备用。
实验用雌性SD大鼠，体重190～210g，购自广东实验动物场。随机分为3组，低浓度组、高浓度组和对照组各8只，腹腔注射Ce(NO3)3 低浓度组1mg/kg BW，高浓度 组腹腔注射50 mg/kg BW，对照组腹腔注射等量的生理盐水，注射15天后全部处死。取肝脏、脾脏、心脏、肾脏、骨骼肌和大脑用生理盐水清洗后准确称重，用预冷的匀浆介质(pH7.5，0.25 mol/L蔗糖，0.025mol/L Tris-HCl,0.1mmol/L EDTA)制成10%组织匀浆备用。
, 百拇医药
蛋白测定采用双缩脲法；ATP酶的活性通过每小时每毫克蛋白质的无机磷生成量来定量。试剂均购自南京建成生物工程研究所。
各项指标的测定均在752紫外光栅分光光度计上进行，统计学分析均采用t检验。
2 结果
2.1 Ce(NO3)3对大鼠体重的影响 从图1可以看出，与对照组比较，高浓度时，Ce(NO3)3对大鼠生长有明显的抑制作用(P<0.05)；低浓度时，体重增长略好于对照，但无显著性差异。
图1 Ce(NO3)3对大鼠体重的影响
, 百拇医药
2.2 对Na+、K+-ATP酶活性的影响 从图2可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3 后，大鼠肝脏、肾脏、脾脏、大脑中Na+、K+-ATP活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠中大脑、肌肉中Na+，K+-ATP活性有所增加，肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
图2 Ce(NO3)3对Na+、K+-ATP酶活性的
影响[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
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2.3 对Mg2+-ATP酶活性的影响
从图3可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3后，大鼠肝脏、肾脏、心脏、大脑中Mg2+-ATP酶活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠中大脑、肌肉中Mg2+-ATP活性有所增加，肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
图3 Ce(NO3)3对Mg2+-ATP酶活性的
影响[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
2.4 对Ca2+-ATP酶活性的影响 从图4可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3后，大鼠肝脏、肾脏、肌肉中Ca2+-ATP酶活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠肌肉中Ca2+-ATP酶活性有所增加，大脑中Ca2+-ATP酶活性显著降低；肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
, 百拇医药
图4 Ce(NO3)3对Ca2+-ATP酶活性的影响
[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
3 讨论
早在80年代，有人观察到低浓度的稀土离子对人红细胞膜Na+、K+-ATP酶、肌质网膜Ca2+、Mg2+-ATP酶有一定的激活作用，并随浓度的增加呈现明显的抑制作用[5，6]；稀土离子对ATP酶作用可能与稀土离子竞争Ca2+、Mg2+结合位点、膜脂流动性的变化以及稀土离子的键合位点有关[7]。
我们的研究发现，腹腔注射低浓度硝酸铈时，脏器中Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均有所增强，提示硝酸铈对这些酶有一定的激活作用；腹腔注射高浓度硝酸铈时，Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性并未明显减小，甚至在某些组织活性有所增强，这一点与Sastry等人在研究重金属离子对水生动物体内ATP酶活性的影响所得到的结果非常相似[8]，估计这是机体在长期毒物负荷下的一种保护机制[9]。
, 百拇医药
金属离子影响酶活性的途径一般有两条[10]：直接与蛋白质结合，竞争金属活性位点；改变膜的流动性。冰冻断裂电镜、拉曼光谱以及差示扫描量热研究表明[7]，稀土离子可降低膜的流动性，而Ca2+-ATP酶位于细胞膜之上，因而有可能因此减低Ca2+-ATP酶的活性。另一方面，高浓度稀土离子进入动物体以后，能够引起肝、肺组织脂质过氧化作用明显增强，而脂质过氧化作用能够引起细胞内Ca2+浓度的明显升高，细胞内过高的Ca2+浓度可激活calpain(钙激活的中性蛋白酶)，后者可通过对Ca2+-ATP酶的有限水解而激活Ca2+-ATP酶，这种作用被视为机体在长期高钙负荷下的一种自我保护机制[3]。稀土离子对动物体内Ca2+-ATP酶活性的影响可能是多种机制综合作用的结果。
低浓度稀土元素对Na+，K+-ATP酶活性具有一定的激活作用，提示低浓度稀土元素对动物细胞能量代谢有一定的促进作用，其刺激动、植物生长可能与此有关，低剂量摄入稀土有利于动物体的生长和能量代谢；另外，低浓度下，稀土元素对Ca2+-ATP酶活性具有明显的促进作用，而稀土本身是一种钙拮抗剂，Ca2+-ATP酶活性的增加与“钙拮抗”之间的关系如何，值得研究。
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国家自然科学基金(No.29671034)；广东省自然科学基金资助项目(No.96048)
杨维东，男，博士，讲师
参考文献
1，Stauffer TP, Hilfiker H, Carafoli E, et al. Quantitative a nalysis of alternative splicing options of human plasma membrane calcium pump gene. J Biol Chem, 1993,268(34)：25993-26003
2，McDonough AA, Magyar CE, Komatsu Y. Expression of Na+、K+-ATPase α-and β-subunits along rat nephron specificity and response to hypokalem. Am J Physiol, 1994,267(Cell Physiol,36):C901-908
, 百拇医药
3，Croall DE, DeMartino GN. Ca2+-activated neutral prote inase(calpain) system:structure, function and regulation. Physiol Rev,1991,71：8 13-847
4，杨维东，王艇，雷衡毅，等.硝酸铈可致大鼠肝脏脂质过氧化损伤.卫生研究，1999，28(2)：91-92
5，张金红，魏继中，吴隽中，等.稀土离子(La3+、Nd3+、Ho3+、Yb3+)对人红细胞膜Na+/K+-ATPase作用的初步研究.生物化学杂志，1993，9(3)：274-277
6，李新民，倪嘉缵，王平原，等.稀土对肌质网Ca2+-ATP酶活性的影响.生物化学杂志，1995，11(3)：281-285
, http://www.100md.com
7，倪嘉缵主编.稀土生物无机化学.北京：科学出版社，1995
8，Sastry KV, Gupta PK. Chronic mercuric chloride intoxication in the digestive system of Channa punctatus. J Environ Pathol Toxicol,1978,2：443-446
9，Thaker J, Chhaya J, Nuzhat S, et al. Effect of chromium on some ion-dependent ATPase in gills, kidney and intestine of a coastalteleost Periophthalmus dipes. Toxicology,1996,112：237-244
10，Lakshmi R, Kundu R, Mansuri AP. Toxicity of mercuri to mudskipper, boleophthalmus dentatus(Cuv and Val). Part1:Changes in the activity of ATPase in gills. Acta Hydrochem Hydrobiol,1990,18(5):605-611
(1999-07-05收稿), 百拇医药
单位：杨维东(暨南大学生物工程系，广州 510632)；王艇(中山大学生命科学学院)；雷衡毅(暨南大学生物工程系，广州 510632)；杨燕生(暨南大学生物工程系，广州 510632)
关键词：铈；Ca2+-ATP酶；K+、Na+-ATP酶；Mg2+-ATP酶；大鼠
卫生研究990603 摘要 研究了硝酸铈对大鼠内脏、大脑、肌肉中ATP酶活性的影响。结果显示，连续腹腔注射低浓度硝酸铈后，大鼠肝脏、肾脏、心脏等组织中Ca2+-ATP酶，K+、Na+-ATP酶，Mg2+-ATP酶活性明显增强；而当注射高浓度硝酸铈时，酶活性均未发生明显变化。估计这是机体受到外界毒物影响后的一种保护机制。
分类号 Q557 O614.332
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Effect of cerous nitrate on the activity of ATPase in tissues
Yang Weidong, Wang Ting, Lei Hengyi， Yang Yansheng
(Department of Biotechnology, Jinan University, Guangzhou 510632,China)
The effect of cerous nitrate on the activity of some ion-dependent ATPase such as Ca2+-ATPase, K+，Na+-ATPase and Mg2+-ATPase was studied in vivo. The results showed that Ca2+-ATPase, K+，Na+-ATPase and Mg2+-ATPase activity was increased in rat liver, kidney and heart after recurrent intraperitoneal administration of low dose of cerous nitrate(1mg/kg)，but no changes happened for these enzymes activity after high cerous nitrate administration(50mg/kg).The mechanism of the phenomena was discussed.
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Key words:cerium, Ca2+-ATPase,K+、Na+-ATPase,Mg2+-ATPase,rat
近年来研究发现，细胞内Na+、K+、Ca2+离子代谢异常，可能是某些病理变化和疾病发病的重要机制，而细胞膜上ATP酶活性对维持细胞内外Na+、Ca2+离子转运有着十分重要的意义[1，2]；同时自由基引起的脂质过氧化反应与维持细胞内Na+ 、Ca2+离子转运的ATP酶活性有相关关系[3]。
由于稀土元素，特别是硝酸铈在农业和医药上的广泛运用，稀土元素将不可避免地通过生物圈进入人体，然而其生物效应目前尚不清楚。我们曾研究发现，高剂量的硝酸铈腹腔注射后能够引起大鼠肝脏组织脂质过氧化作用明显增强[4]。本文将考察连续注射稀土元素以后ATP酶包括Na+、K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的变化情况。
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1 实验材料
Ce(NO3)3溶液：氧化铈(CeO2)，纯度99.95%，购自广州珠江冶炼厂。在浓盐酸和盐酸羟氨中溶解后，加入过量草酸使其沉淀，然后用蒸馏水洗涤沉淀。将沉淀在浓硝酸中溶解后，加热除去多余的硝酸，用EDTA标准溶液进行铈浓度的标定，灭菌后备用。
实验用雌性SD大鼠，体重190～210g，购自广东实验动物场。随机分为3组，低浓度组、高浓度组和对照组各8只，腹腔注射Ce(NO3)3 低浓度组1mg/kg BW，高浓度 组腹腔注射50 mg/kg BW，对照组腹腔注射等量的生理盐水，注射15天后全部处死。取肝脏、脾脏、心脏、肾脏、骨骼肌和大脑用生理盐水清洗后准确称重，用预冷的匀浆介质(pH7.5，0.25 mol/L蔗糖，0.025mol/L Tris-HCl,0.1mmol/L EDTA)制成10%组织匀浆备用。
, 百拇医药
蛋白测定采用双缩脲法；ATP酶的活性通过每小时每毫克蛋白质的无机磷生成量来定量。试剂均购自南京建成生物工程研究所。
各项指标的测定均在752紫外光栅分光光度计上进行，统计学分析均采用t检验。
2 结果
2.1 Ce(NO3)3对大鼠体重的影响 从图1可以看出，与对照组比较，高浓度时，Ce(NO3)3对大鼠生长有明显的抑制作用(P<0.05)；低浓度时，体重增长略好于对照，但无显著性差异。
图1 Ce(NO3)3对大鼠体重的影响
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2.2 对Na+、K+-ATP酶活性的影响 从图2可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3 后，大鼠肝脏、肾脏、脾脏、大脑中Na+、K+-ATP活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠中大脑、肌肉中Na+，K+-ATP活性有所增加，肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
图2 Ce(NO3)3对Na+、K+-ATP酶活性的
影响[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
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2.3 对Mg2+-ATP酶活性的影响
从图3可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3后，大鼠肝脏、肾脏、心脏、大脑中Mg2+-ATP酶活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠中大脑、肌肉中Mg2+-ATP活性有所增加，肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
图3 Ce(NO3)3对Mg2+-ATP酶活性的
影响[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
2.4 对Ca2+-ATP酶活性的影响 从图4可以看出，注射低浓度Ce(NO3)3后，大鼠肝脏、肾脏、肌肉中Ca2+-ATP酶活性均有明显增加；注射高浓度Ce(NO3)3后，大鼠肌肉中Ca2+-ATP酶活性有所增加，大脑中Ca2+-ATP酶活性显著降低；肝脏、心脏、肾脏、脾脏中无明显变化。
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图4 Ce(NO3)3对Ca2+-ATP酶活性的影响
[mmol Pi/(g pro.h)，n=8]
3 讨论
早在80年代，有人观察到低浓度的稀土离子对人红细胞膜Na+、K+-ATP酶、肌质网膜Ca2+、Mg2+-ATP酶有一定的激活作用，并随浓度的增加呈现明显的抑制作用[5，6]；稀土离子对ATP酶作用可能与稀土离子竞争Ca2+、Mg2+结合位点、膜脂流动性的变化以及稀土离子的键合位点有关[7]。
我们的研究发现，腹腔注射低浓度硝酸铈时，脏器中Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性均有所增强，提示硝酸铈对这些酶有一定的激活作用；腹腔注射高浓度硝酸铈时，Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性并未明显减小，甚至在某些组织活性有所增强，这一点与Sastry等人在研究重金属离子对水生动物体内ATP酶活性的影响所得到的结果非常相似[8]，估计这是机体在长期毒物负荷下的一种保护机制[9]。
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金属离子影响酶活性的途径一般有两条[10]：直接与蛋白质结合，竞争金属活性位点；改变膜的流动性。冰冻断裂电镜、拉曼光谱以及差示扫描量热研究表明[7]，稀土离子可降低膜的流动性，而Ca2+-ATP酶位于细胞膜之上，因而有可能因此减低Ca2+-ATP酶的活性。另一方面，高浓度稀土离子进入动物体以后，能够引起肝、肺组织脂质过氧化作用明显增强，而脂质过氧化作用能够引起细胞内Ca2+浓度的明显升高，细胞内过高的Ca2+浓度可激活calpain(钙激活的中性蛋白酶)，后者可通过对Ca2+-ATP酶的有限水解而激活Ca2+-ATP酶，这种作用被视为机体在长期高钙负荷下的一种自我保护机制[3]。稀土离子对动物体内Ca2+-ATP酶活性的影响可能是多种机制综合作用的结果。
低浓度稀土元素对Na+，K+-ATP酶活性具有一定的激活作用，提示低浓度稀土元素对动物细胞能量代谢有一定的促进作用，其刺激动、植物生长可能与此有关，低剂量摄入稀土有利于动物体的生长和能量代谢；另外，低浓度下，稀土元素对Ca2+-ATP酶活性具有明显的促进作用，而稀土本身是一种钙拮抗剂，Ca2+-ATP酶活性的增加与“钙拮抗”之间的关系如何，值得研究。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金(No.29671034)；广东省自然科学基金资助项目(No.96048)
杨维东，男，博士，讲师
参考文献
1，Stauffer TP, Hilfiker H, Carafoli E, et al. Quantitative a nalysis of alternative splicing options of human plasma membrane calcium pump gene. J Biol Chem, 1993,268(34)：25993-26003
2，McDonough AA, Magyar CE, Komatsu Y. Expression of Na+、K+-ATPase α-and β-subunits along rat nephron specificity and response to hypokalem. Am J Physiol, 1994,267(Cell Physiol,36):C901-908
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3，Croall DE, DeMartino GN. Ca2+-activated neutral prote inase(calpain) system:structure, function and regulation. Physiol Rev,1991,71：8 13-847
4，杨维东，王艇，雷衡毅，等.硝酸铈可致大鼠肝脏脂质过氧化损伤.卫生研究，1999，28(2)：91-92
5，张金红，魏继中，吴隽中，等.稀土离子(La3+、Nd3+、Ho3+、Yb3+)对人红细胞膜Na+/K+-ATPase作用的初步研究.生物化学杂志，1993，9(3)：274-277
6，李新民，倪嘉缵，王平原，等.稀土对肌质网Ca2+-ATP酶活性的影响.生物化学杂志，1995，11(3)：281-285
, http://www.100md.com
7，倪嘉缵主编.稀土生物无机化学.北京：科学出版社，1995
8，Sastry KV, Gupta PK. Chronic mercuric chloride intoxication in the digestive system of Channa punctatus. J Environ Pathol Toxicol,1978,2：443-446
9，Thaker J, Chhaya J, Nuzhat S, et al. Effect of chromium on some ion-dependent ATPase in gills, kidney and intestine of a coastalteleost Periophthalmus dipes. Toxicology,1996,112：237-244
10，Lakshmi R, Kundu R, Mansuri AP. Toxicity of mercuri to mudskipper, boleophthalmus dentatus(Cuv and Val). Part1:Changes in the activity of ATPase in gills. Acta Hydrochem Hydrobiol,1990,18(5):605-611
(1999-07-05收稿), 百拇医药