锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性的调节
作者：岑小波 王瑞淑 王航
单位：岑小波(华西医科大学附属第一医院医学实验中心，成都 610041)；王瑞淑(华西医科大学公共卫生学院)；王航(华西医科大学口腔医学院)
关键词：锌；Ca2+-ATP酶；成骨细胞；蛋白激酶C；钙调素
摘要摘要：为了研究锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATP酶和Na+、K+-ATP酶活性的影响及其机制，实验设对照组和3个补锌组。采用孔雀绿比色法同步测定膜Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶活性，以研究Zn2+对酶活性的影响以及蛋白激酶C或钙调素特异性抑制剂对Zn2+诱导的成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性的影响。结果表明，Zn2+可以显著提高成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性，但对Na+,K+-ATPase活性无影响；钙调素特异性抑制剂R24571对Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性无影响，钙调素对膜Ca2+-ATP酶基础活性也无激活作用；蛋白激酶C特异性抑制剂三氟拉嗪可使Zn2+诱导的Ca2+-ATP酶的活性显著降低。因此，锌可能通过蛋白激酶C介导调节成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性。
, 百拇医药
中图分类号：Q593.6 Q581 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0052-03
Zinc modulates the Ca2+-ATPase activity of rat osteoblast membrane
Cen Xiaobo,Wang Ruishu,Wang Hang
(Medical Experimental Center of First University Hospital,West China
University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China)
, 百拇医药 Abstract：The effect and mechanism of zinc on Ca2+-ATPase and Na+,K+-ATPase activity of rat osteoblast membrane were studied.The activities were measured by colorimetric method.The effect of special inhibitors of protein kinase C or calmodulin on membrane Ca2+-ATPase and Na+,K+-ATPase activity which induced by zinc were also examined.The results showed that zinc could increase membrane Ca2+-ATPase activity,but no influence was observed on Na+,K+-ATPase activity.R24571,a special inhibitor of calmodulin,had no effect on membrane Ca2+-ATPase activity. Calmodulin also could not promote the basic Ca2+-ATPase activity of membrane.But trifluoperazine,a special inhibitor of protein kinase C,obviously reduced its activity.It was concluded that the modulation of zinc on membrane Ca2+-ATPase activity of rat osteoblast could be mediated by protein kinase C.
, 百拇医药
Key words：zinc,osteoblast,Ca2+-ATPase,protein kinase C,calmodulin
Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)和Na+、K+-ATP酶(Na+、K+-ATPase)是ATP酶家族中的两个重要成员，它们在成骨细胞活跃的离子代谢中发挥重要的调节作用。其中Ca2+-ATPase是质膜上Ca2+转运系统的一个重要成员，直接参与成骨细胞向骨细胞的分化以及骨组织有机质的钙化，其活性状况反映成骨细胞的功能。锌能够影响成骨细胞的增殖和分化，本文采用孔雀绿比色法研究锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响，以阐明锌对成骨细胞Ca2+、Na+、K+等离子代谢的调节作用。Ca2+-ATPase活性主要受到蛋白激酶C(PKC)和/或钙调素(CaM)的调控[1]，所以用PKC或CaM特异性抑制剂探测它们是否参与介导受试物的生理效应，以研究锌对Ca2+-ATPase的影响机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
DMEN培养基(Gibco);ZnSO4。7H2O、钙调素、Compound R24571、哇巴因均为Sigma产品；三氟拉嗪(上海制药一厂)。其余试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 大鼠成骨细胞的体外培养 参照Hiroko等的方法[2]。
1.2.2 实验分组 实验设置对照组和3个补锌组。对照组：DMEM基础培养基；3个补锌组：在DMEM培养基中分别补充Zn2+10、25和50μmol/L。
1.2.3 Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性测定[3] (1)酶促反应体系基本成分为：反应液A组分(mmol/L):L-组氨酸80(pH7.4)、ATP2.5、MgCl23.6、NaCl 80、KCl33、乙二醇双-(β-氨基乙酸)醚四乙酸(EGTA)1和哇巴因0.9，反应液B组分为：20μmol/L CaCl2代替反应液A中的EGTA，反应液C的组分为反应液A除去哇巴因；(2)消化分离培养的细胞，制成细胞悬液，调整密度为5×105/ml，待测；(3)酶促反应：A、B、C反应液各0.9ml分别加入3支康氏试管中，于37℃水浴中预保温10分钟后，加入细胞悬液40μl(或根据实验目的而加入不同体积)，混匀后在37℃水浴中振摇保温1小时，加入20%三氯醋酸0.2ml终止反应；(4)酶促反应产物磷的测定：取各管上清液0.6ml，加入孔雀绿显色液3ml，混匀。准确1分钟后加入24%柠檬酸0.6ml。2小时后以空白管调零于660nm波长测定读数。根据标准曲线计算出各管磷含量；(5)酶活性计算：B管与A管含磷量的差值为Ca2+、ATPase活性，C管与A管含磷量的差值为Na+,K+-ATPase活性。酶活性以37℃条件下保温1小时，每106个细胞释放磷的微摩尔数[μmol Pi/(h。106细胞)]表示。
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1.2.4 锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响 将成骨细胞5×104个接种于25ml培养瓶，培养24小时后，弃去旧培养液。分别换上含有不同锌浓度的细胞培养液，继续培养3天后收集细胞，测定酶活性。
1.2.5 PKC或CaM抑制剂对Zn2+诱导成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响 将成骨细胞5×104个接种于25ml培养瓶，培养24小时后，弃去旧培养液。分别换上含锌25μmol/L的细胞培养液。同时分别加入PKC抑制剂三氟拉嗪或CaM抑制剂R24571，使其终浓度分别为20μmol/L或10μmol/L。继续培养3天后收集细胞，测定酶活性。
1.2.6 CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase基础活性的影响 在每个测定膜Ca2+-ATPase活性的酶促反应体系中分别加入20、40或60μl的细胞悬液和50ng的CaM，温育1小时后测定酶活性。
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2 结果
2.1 锌对成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+,K+-ATPase活性的影响
10、25及50μmol/L的Zn2+可以显著提高成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性，但对Na+、K+-ATPase活性无影响(表1)。
表1 不同浓度锌对成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响(
±s,n=4)
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μmol Pi/(h。106细胞)
Zn2+(μmol/L)
Ca2+-ATPase活性
Na+、K+-ATPase活性
0
0.91±0.20
1.18±0.56
10
1.64±0.37(1)
0.98±0.20
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25
1.87±0.32(1)
1.19±0.44
50
1.86±0.43(1)
1.12±0.26
注：(1)与对照组比较，P<0.05
2.2 PKC或CaM抑制剂对Zn2+诱导的成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
25μmol/L的Zn2+使Ca2+-ATPase活性显著增加；CaM抑制剂R24571对25μmol/L Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性无影响，但PKC抑制剂三氟拉嗪可使25μmol/L Zn2+诱导Ca2+-ATPase的活性显著降低(表2)。
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2.3 CaM对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
在加入不同细胞悬液量的酶促反应体系中补充50mgCaM，但均不影响成骨细胞膜Ca2+-ATPase的基础活性，表明CaM并不能够提高膜Ca2+-ATPase活性(附图)。
表2 PKC或CaM抑制剂对Zn2+(25μmol/L)诱导成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响(±s,n=4)
μmol Pi/(h。106细胞
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组 别
Ca2+-ATPase活性
对照组
0.73±0.16
Zn2+
1.47±0.21(1)
三氟拉嗪+Zn2+
0.58±0.16(2)
R24571+Zn2+
1.31±0.07
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注：(1)与对照组比较，P<0.05 (2)与Zn2+组比较，P<0.05
A:补充50ngCaM B：无CaM
附图 CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
3 讨论
3.1 Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响
成骨细胞离子代谢活跃且机制比较复杂，这与成骨细胞的增殖、有机质形成和钙化密切相关。Ca2+-ATPase也称为Ca2+泵，是成骨细胞钙稳态的重要调控者。动物实验和流行病学调查表明，锌可以促进骨骼的钙化；当锌缺乏时，骨骼钙化受到抑制、骨龄延迟[4]。本实验结果证实不同浓度的Zn2+可以提高成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性，因此，Zn2+可能加速成骨细胞Ca2+的转运，从而促进成骨细胞的钙化，表明Zn2+参与调节骨钙化。国内学者研究表明，25μmol/L的Zn2+可以增强大鼠海马突触体Ca2+-ATPase活性，但当Zn2+浓度等于或高于50μmol/L时，该酶活性就会受到抑制。高锌也通过抑制Ca2+-ATPase而使肝细胞内Ca2+超载，造成细胞损害[5，6]。Zhang等研究表明：100μmol/L的Zn2+可以结合肝细胞微粒体基质小泡Ca2+-ATPase上一些氨基酸残基中的巯基，从而抑制该酶活性[7]。本次实验中，50μmol/L的Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性并无抑制作用。Hexum对肝微粒体的研究表明，Zn2+是Na+、K+-ATPase的非竞争性抑制剂(IC50为1μmol/L)[8]，但在本实验中Zn2+对大鼠成骨细胞膜Na+、K+-ATPase活性无影响。
, 百拇医药
3.2 Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性影响的机制
Ca2+-ATPase的调节机制比较复杂，与数个胞内信号系统都有关系，表明它在细胞生命活动中十分重要。Ca2+-ATPase活性主要受到CaM和/或PKC调节[9]。本实验证实，Zn2+对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响并不受CaM调节，分析原因如下：(1)反应体系中加入CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性无影响；(2)CaM的特异性抑制剂R24571也不能抑制25μmol/L Zn2+诱导提高的Ca2+-ATPase活性。因此，成骨细胞膜Ca2+-ATPase并不是CaM的作用靶。但PKC特异性抑制剂三氟拉嗪可明显抑制25μmol/L Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性，这表明成骨细胞膜Ca2+-ATPase是PKC的靶标，Zn2+通过PKC影响膜Ca2+-ATPase活性。PKC可使Ca2+-ATPase C末端CaM结合区域中特异性氨基酸残基(如丝氨酸、苏氨酸)磷酸化，暴露出活性部位，从而活化酶。质膜Ca2+-ATPase(PMCA)在不同组织中的亚型不同，不同亚型的Ca2+-ATPase对CaM或PKC的敏感性也不相同[10]。例如红细胞中存在的PMCA1和PMCA3亚型对CaM敏感。大鼠成骨细胞PMCA是何种亚型尚不清楚。但从本次结果看，该亚型的PMCA对CaM不敏感，而对PKC敏感。
, 百拇医药
作者简介：贾旭东，男，硕士
基金项目：国家自然科学基金(No.39770647)
作者简介：岑小波，男，博士，讲师
参考文献
1，Kosk-Kosicka D,Zylinska L.Protein kinase C and calmodulin effects on the plasma membrane Ca2+-ATPase from excitable and nonexcitable cells.Mol Cell Biol,1997,173:79—87
2，Hiroko S,Hiro-Ari K,Yuji A,et al.In vitro differentiation and calcification in a new clony osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria.J Cell Biol,1983,96:191—198
, http://www.100md.com
3，岑小波，黄永光，王瑞淑，等.孔雀绿比色法同步测定大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATP酶和Na+、K+-ATP酶活性.华西医科大学学报，1998，29：427—430
4，Beattie JH,Alison A.Trace element nutrition and bone metabolism.Nutr Res Rev,1992,5:167—188
5，左巍，陈启盛，李东生，等.锌离子对大鼠海马突触Ca2+、Mg2+-ATP酶活性及蛋白合成的影响.神经科学，1997，4：31—33
6，丁虹，陈建华，彭仁绣.高锌对正常小鼠脏器的作用——对脏器Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的影响.卫生研究，1998，27(1)：44—45
, http://www.100md.com
7，Zhang GH,Yamai M,Kimura S,et al.Effect of heavy metal on rat liver microsomal Ca2+-ATPase and Ca2+ sequestering.J Biol Chem,1990,265:2184—2189
8，Hexum TD.Studies on the reaction catalyzed by transport(Na,K)adenosine triphosphatase-I:effect of divalent metals.Bioch Pharmarcol,1974,23:3441—3447
9，刘景生主编.细胞信息与调控.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1998，169—206
10，Stauffer TP,Guerini D,Carafoli E.Tissue distribution of the four gene products for the plasma membrane Ca2+ pump.J Biol Chem,1995,270:12184—12190
(1999-07-23收稿), 百拇医药
单位：岑小波(华西医科大学附属第一医院医学实验中心，成都 610041)；王瑞淑(华西医科大学公共卫生学院)；王航(华西医科大学口腔医学院)
关键词：锌；Ca2+-ATP酶；成骨细胞；蛋白激酶C；钙调素
摘要摘要：为了研究锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATP酶和Na+、K+-ATP酶活性的影响及其机制，实验设对照组和3个补锌组。采用孔雀绿比色法同步测定膜Ca2+-ATP酶和Na+，K+-ATP酶活性，以研究Zn2+对酶活性的影响以及蛋白激酶C或钙调素特异性抑制剂对Zn2+诱导的成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性的影响。结果表明，Zn2+可以显著提高成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性，但对Na+,K+-ATPase活性无影响；钙调素特异性抑制剂R24571对Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性无影响，钙调素对膜Ca2+-ATP酶基础活性也无激活作用；蛋白激酶C特异性抑制剂三氟拉嗪可使Zn2+诱导的Ca2+-ATP酶的活性显著降低。因此，锌可能通过蛋白激酶C介导调节成骨细胞膜Ca2+-ATP酶活性。
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中图分类号：Q593.6 Q581 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0052-03
Zinc modulates the Ca2+-ATPase activity of rat osteoblast membrane
Cen Xiaobo,Wang Ruishu,Wang Hang
(Medical Experimental Center of First University Hospital,West China
University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China)
, 百拇医药 Abstract：The effect and mechanism of zinc on Ca2+-ATPase and Na+,K+-ATPase activity of rat osteoblast membrane were studied.The activities were measured by colorimetric method.The effect of special inhibitors of protein kinase C or calmodulin on membrane Ca2+-ATPase and Na+,K+-ATPase activity which induced by zinc were also examined.The results showed that zinc could increase membrane Ca2+-ATPase activity,but no influence was observed on Na+,K+-ATPase activity.R24571,a special inhibitor of calmodulin,had no effect on membrane Ca2+-ATPase activity. Calmodulin also could not promote the basic Ca2+-ATPase activity of membrane.But trifluoperazine,a special inhibitor of protein kinase C,obviously reduced its activity.It was concluded that the modulation of zinc on membrane Ca2+-ATPase activity of rat osteoblast could be mediated by protein kinase C.
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Key words：zinc,osteoblast,Ca2+-ATPase,protein kinase C,calmodulin
Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase)和Na+、K+-ATP酶(Na+、K+-ATPase)是ATP酶家族中的两个重要成员，它们在成骨细胞活跃的离子代谢中发挥重要的调节作用。其中Ca2+-ATPase是质膜上Ca2+转运系统的一个重要成员，直接参与成骨细胞向骨细胞的分化以及骨组织有机质的钙化，其活性状况反映成骨细胞的功能。锌能够影响成骨细胞的增殖和分化，本文采用孔雀绿比色法研究锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响，以阐明锌对成骨细胞Ca2+、Na+、K+等离子代谢的调节作用。Ca2+-ATPase活性主要受到蛋白激酶C(PKC)和/或钙调素(CaM)的调控[1]，所以用PKC或CaM特异性抑制剂探测它们是否参与介导受试物的生理效应，以研究锌对Ca2+-ATPase的影响机制。
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1 材料与方法
1.1 材料
DMEN培养基(Gibco);ZnSO4。7H2O、钙调素、Compound R24571、哇巴因均为Sigma产品；三氟拉嗪(上海制药一厂)。其余试剂为国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 大鼠成骨细胞的体外培养 参照Hiroko等的方法[2]。
1.2.2 实验分组 实验设置对照组和3个补锌组。对照组：DMEM基础培养基；3个补锌组：在DMEM培养基中分别补充Zn2+10、25和50μmol/L。
1.2.3 Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性测定[3] (1)酶促反应体系基本成分为：反应液A组分(mmol/L):L-组氨酸80(pH7.4)、ATP2.5、MgCl23.6、NaCl 80、KCl33、乙二醇双-(β-氨基乙酸)醚四乙酸(EGTA)1和哇巴因0.9，反应液B组分为：20μmol/L CaCl2代替反应液A中的EGTA，反应液C的组分为反应液A除去哇巴因；(2)消化分离培养的细胞，制成细胞悬液，调整密度为5×105/ml，待测；(3)酶促反应：A、B、C反应液各0.9ml分别加入3支康氏试管中，于37℃水浴中预保温10分钟后，加入细胞悬液40μl(或根据实验目的而加入不同体积)，混匀后在37℃水浴中振摇保温1小时，加入20%三氯醋酸0.2ml终止反应；(4)酶促反应产物磷的测定：取各管上清液0.6ml，加入孔雀绿显色液3ml，混匀。准确1分钟后加入24%柠檬酸0.6ml。2小时后以空白管调零于660nm波长测定读数。根据标准曲线计算出各管磷含量；(5)酶活性计算：B管与A管含磷量的差值为Ca2+、ATPase活性，C管与A管含磷量的差值为Na+,K+-ATPase活性。酶活性以37℃条件下保温1小时，每106个细胞释放磷的微摩尔数[μmol Pi/(h。106细胞)]表示。
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1.2.4 锌对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响 将成骨细胞5×104个接种于25ml培养瓶，培养24小时后，弃去旧培养液。分别换上含有不同锌浓度的细胞培养液，继续培养3天后收集细胞，测定酶活性。
1.2.5 PKC或CaM抑制剂对Zn2+诱导成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响 将成骨细胞5×104个接种于25ml培养瓶，培养24小时后，弃去旧培养液。分别换上含锌25μmol/L的细胞培养液。同时分别加入PKC抑制剂三氟拉嗪或CaM抑制剂R24571，使其终浓度分别为20μmol/L或10μmol/L。继续培养3天后收集细胞，测定酶活性。
1.2.6 CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase基础活性的影响 在每个测定膜Ca2+-ATPase活性的酶促反应体系中分别加入20、40或60μl的细胞悬液和50ng的CaM，温育1小时后测定酶活性。
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2 结果
2.1 锌对成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+,K+-ATPase活性的影响
10、25及50μmol/L的Zn2+可以显著提高成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性，但对Na+、K+-ATPase活性无影响(表1)。
表1 不同浓度锌对成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响(
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μmol Pi/(h。106细胞)
Zn2+(μmol/L)
Ca2+-ATPase活性
Na+、K+-ATPase活性
0
0.91±0.20
1.18±0.56
10
1.64±0.37(1)
0.98±0.20
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25
1.87±0.32(1)
1.19±0.44
50
1.86±0.43(1)
1.12±0.26
注：(1)与对照组比较，P<0.05
2.2 PKC或CaM抑制剂对Zn2+诱导的成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
25μmol/L的Zn2+使Ca2+-ATPase活性显著增加；CaM抑制剂R24571对25μmol/L Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性无影响，但PKC抑制剂三氟拉嗪可使25μmol/L Zn2+诱导Ca2+-ATPase的活性显著降低(表2)。
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2.3 CaM对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
在加入不同细胞悬液量的酶促反应体系中补充50mgCaM，但均不影响成骨细胞膜Ca2+-ATPase的基础活性，表明CaM并不能够提高膜Ca2+-ATPase活性(附图)。
表2 PKC或CaM抑制剂对Zn2+(25μmol/L)诱导成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响(
±s,n=4)μmol Pi/(h。106细胞
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组 别
Ca2+-ATPase活性
对照组
0.73±0.16
Zn2+
1.47±0.21(1)
三氟拉嗪+Zn2+
0.58±0.16(2)
R24571+Zn2+
1.31±0.07
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注：(1)与对照组比较，P<0.05 (2)与Zn2+组比较，P<0.05
A:补充50ngCaM B：无CaM
附图 CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响
3 讨论
3.1 Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase和Na+、K+-ATPase活性的影响
成骨细胞离子代谢活跃且机制比较复杂，这与成骨细胞的增殖、有机质形成和钙化密切相关。Ca2+-ATPase也称为Ca2+泵，是成骨细胞钙稳态的重要调控者。动物实验和流行病学调查表明，锌可以促进骨骼的钙化；当锌缺乏时，骨骼钙化受到抑制、骨龄延迟[4]。本实验结果证实不同浓度的Zn2+可以提高成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性，因此，Zn2+可能加速成骨细胞Ca2+的转运，从而促进成骨细胞的钙化，表明Zn2+参与调节骨钙化。国内学者研究表明，25μmol/L的Zn2+可以增强大鼠海马突触体Ca2+-ATPase活性，但当Zn2+浓度等于或高于50μmol/L时，该酶活性就会受到抑制。高锌也通过抑制Ca2+-ATPase而使肝细胞内Ca2+超载，造成细胞损害[5，6]。Zhang等研究表明：100μmol/L的Zn2+可以结合肝细胞微粒体基质小泡Ca2+-ATPase上一些氨基酸残基中的巯基，从而抑制该酶活性[7]。本次实验中，50μmol/L的Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性并无抑制作用。Hexum对肝微粒体的研究表明，Zn2+是Na+、K+-ATPase的非竞争性抑制剂(IC50为1μmol/L)[8]，但在本实验中Zn2+对大鼠成骨细胞膜Na+、K+-ATPase活性无影响。
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3.2 Zn2+对大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性影响的机制
Ca2+-ATPase的调节机制比较复杂，与数个胞内信号系统都有关系，表明它在细胞生命活动中十分重要。Ca2+-ATPase活性主要受到CaM和/或PKC调节[9]。本实验证实，Zn2+对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性的影响并不受CaM调节，分析原因如下：(1)反应体系中加入CaM对成骨细胞膜Ca2+-ATPase活性无影响；(2)CaM的特异性抑制剂R24571也不能抑制25μmol/L Zn2+诱导提高的Ca2+-ATPase活性。因此，成骨细胞膜Ca2+-ATPase并不是CaM的作用靶。但PKC特异性抑制剂三氟拉嗪可明显抑制25μmol/L Zn2+诱导的Ca2+-ATPase活性，这表明成骨细胞膜Ca2+-ATPase是PKC的靶标，Zn2+通过PKC影响膜Ca2+-ATPase活性。PKC可使Ca2+-ATPase C末端CaM结合区域中特异性氨基酸残基(如丝氨酸、苏氨酸)磷酸化，暴露出活性部位，从而活化酶。质膜Ca2+-ATPase(PMCA)在不同组织中的亚型不同，不同亚型的Ca2+-ATPase对CaM或PKC的敏感性也不相同[10]。例如红细胞中存在的PMCA1和PMCA3亚型对CaM敏感。大鼠成骨细胞PMCA是何种亚型尚不清楚。但从本次结果看，该亚型的PMCA对CaM不敏感，而对PKC敏感。
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作者简介：贾旭东，男，硕士
基金项目：国家自然科学基金(No.39770647)
作者简介：岑小波，男，博士，讲师
参考文献
1，Kosk-Kosicka D,Zylinska L.Protein kinase C and calmodulin effects on the plasma membrane Ca2+-ATPase from excitable and nonexcitable cells.Mol Cell Biol,1997,173:79—87
2，Hiroko S,Hiro-Ari K,Yuji A,et al.In vitro differentiation and calcification in a new clony osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria.J Cell Biol,1983,96:191—198
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3，岑小波，黄永光，王瑞淑，等.孔雀绿比色法同步测定大鼠成骨细胞膜Ca2+-ATP酶和Na+、K+-ATP酶活性.华西医科大学学报，1998，29：427—430
4，Beattie JH,Alison A.Trace element nutrition and bone metabolism.Nutr Res Rev,1992,5:167—188
5，左巍，陈启盛，李东生，等.锌离子对大鼠海马突触Ca2+、Mg2+-ATP酶活性及蛋白合成的影响.神经科学，1997，4：31—33
6，丁虹，陈建华，彭仁绣.高锌对正常小鼠脏器的作用——对脏器Na+、K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的影响.卫生研究，1998，27(1)：44—45
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(1999-07-23收稿), 百拇医药