降钙素对人成骨样细胞增殖与细胞膜流动性的影响
作者：薛延 袁润英 相东 王红霞
单位：北京市创伤骨科研究所，北京 100035
关键词：降钙素；OS-732细胞系；细胞增殖；细胞周期；细胞膜流动性
卫生研究000314 摘要：为了解降钙素(CT)对体外培养的人成骨样细胞OS-732增殖与细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)2D3的作用进行比较，在培养液中添加1IU/ml CT前后观察DNA合成速率、细胞增殖、细胞周期和细胞膜流动性的变化。结果表明CT有明显促进OS-732细胞增殖和DNA合成的作用，使G2+M期细胞所占的百分比增加，而S期细胞的百分比下降。1，25(OH)2D3可使细胞膜流动性增加，而1IU/ml CT使其下降。结论认为降钙素与1，25(OH)2D3不同，它促进人成骨样细胞增殖和降低细胞膜流动性。
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中图分类号：Q573 Q593.6 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0168-02
Effect of calcitonin on the proliferation and membrane fluidity of
human osteoblast-like cells
Xue Yan, Yuan Runying, Xiang Dong, Wang Hongxia
(Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035,China)
Abstract：The effects of calcitonin (CT) on the proliferation and membrane fluidity of human osteoblast-like cells line OS-732 were compared with the effect of 1,25(OH)2D3. The rate of DNA synthesis, cell proliferation, cell cycle and membrane fluidity of OS-732 cells were observed. Results showed that 1IU/ml CT stimulated cell proliferation and DNA synthesis. The percentage of cell in the G2+M phase was increased and the percentage of cell in the synthetic phase was decreased. The membrane fluidity of OS-732 cells was increased after 0.1μmol/L and 0.01μmol/L 1,25(OH)2D3 treatment and was decreased after 1IU/ml CT treatment. It is concluded that calcitonin might increase the cell proliferation and decrease the membrane fluidity.
, 百拇医药
Key words:calcitonin, OS-732 cell line, cell proliferation, cell cycle, membrane fluidity
降钙素(CT)和1，25双羟维生素D3[1,25(OH)2D3]、甲状旁腺激素(PTH)是三大重要的钙调节激素[1，2]，它们之间互相协调不仅维持了血钙的平衡，也保证了骨代谢的正常进行，使骨形成和骨吸收处于平衡状态。当这一平衡被破坏就会引起代谢性骨病的发生。
我所建立的人成骨肉瘤细胞系OS-732[3]，已成为我们研究成骨样细胞特征的体外模型。本文观察了鲑鱼降钙素对人成骨样细胞OS-732细胞的增殖、细胞周期和细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)2D3进行比较。
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1 材料与方法
1.1 试剂
1，25双羟维生素D3[1，25(OH)2D3]由瑞士F.Hoffmann-La Roche公司提供。溶于无水乙醇，用培养液稀释成0.1和0.01μmol/L。
鲑鱼降钙素(calcitonin,CT)瑞士山德药厂产品，用培养液稀释成1IU/ml。
DPH(1，6-diphenyl-1,3,5-hexatriene,1,6,-二苯基-1,3,5,-已三烯)为美国Sigma公司产品，3H-TdR为中国原子能研究院产品，四氢呋喃为上海试剂厂产品。
1.2 细胞培养与处理
, 百拇医药
将人成骨样细胞系OS-732接种于含20%小牛血清的RPMI-1640(Gibco)培养液的培养瓶内，在对数生长期换为含1IU/ml CT的培养液，对照组仅更换基础培养液，将细胞密度调至5×104/ml，置于37℃，5%CO2培养箱中，第2、4、6天进行细胞计数，绘制生长曲线，并计数抑制率和增长率。
1.3 OS-732细胞DNA合成速率的测定
用培养液将细胞密度调至2.5×104/ml，将细胞悬液加入96孔培养板，每孔再加入3H-TdR 1000Bq，按纸片法进行3H-TdR参入实验，用液闪仪计数。
1.4 细胞周期分析
各实验组及对照组细胞在培养到第2、4、6天后离心收获，用70%冷乙醇固定24小时后用PBS清洗除去乙醇，用RNase(0.5mg/管)37℃消化30min，冷却，PI染色15min，用美国B-D公司FACS-440型流式细胞仪(激发光488nm，发射光585nm)以鸡血细胞为内参对照，测定DNA含量(CV值<7%)。根据DNA分布的直方图，用多项式拟合法计数细胞周期各时相的百分比。
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1.5 细胞膜脂的荧光标记及膜流动性的计算
DPH标记过程按文献进行[4]。将DPH溶于四氢呋喃，配成20mmol/L的储存液，用0.15mol/L PBS(pH7.5)稀释成2μ mol/L的应用液。用DPH应用液将细胞密度调至7×105/ml，37℃孵育30min。标记后的细胞用PBS洗涤并配成细胞悬液。用日立MPF-4型荧光分光光度计(激发波长为362nm，发射波长为432nm)，测定荧光偏振值(P)。
Pr和Pmax分别代表P的测量值和理论极限值(Pmax=0.5)
1.6 统计学处理
用t检验进行统计学处理。
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2 结 果
2.1 细胞生长曲线
1 IU/ml CT组和对照组细胞生长曲线表明：在给药后第2、4、6天CT对细胞增殖有促进作用(图1)。
图1 细胞生长曲线
2.2 DNA合成速率
OS-732细胞在用1 IU/ml CT处理后第2和第6天，3H-TdR参入量分别为13650和11326cpm，对照组分别为9373和7593cpm，表明1 IU/ml CT对OS-732细胞DNA合成有促进作用。
2.3 细胞周期
, 百拇医药
在药物处理后第2、4、6天用流式细胞仪分别测定对照组和实验组的OS-732细胞DNA含量。按拟合曲线程序计算出各时相细胞百分数。
附表为用1IU/ml CT处理后第2、4、6天细胞周期各时相细胞百分比。在给CT后的第2、4、6天，G0+G1期细胞比率增加，S期细胞比率下降。G2+M期在给CT后第2和4天细胞比率均增加，而第6天下降。
2.4 细胞膜流动性
OS-732细胞膜流动度(LFU)在0.01 μmol/L 1，25(OH)2D3处理后第2天和第4天均高于对照组(图2a)。
OS-732细胞膜流动度在1 IU/ml CT处理后第2、4、6天，均低于对照组(图2b)。
, 百拇医药
图2 细胞膜流动性
3 讨 论
1，25(OH)2D3对骨代谢和血钙浓度具有双向调节作用，既能促进骨吸收，又能促进骨形成。体外实验表明1，25(OH)2D3对不同来源和不同成熟阶段的细胞增殖均有抑制作用[5]。并参与调节成骨细胞(OB)的生理功能。1，25(OH)2D3促进OB分泌骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙素和IGF-1；抑制OB分泌Ⅰ型胶原并调节ALP的活性。而降钙素的主要生理功能是降低血钙，抑制破骨细胞(OC)活性和骨吸收。
本文以细胞生长曲线和3H TdR参入实验作为细胞增殖指标，观察CT对人成骨样细胞系OS-732增殖的影响。发现1 IU/ml CT可促进OS-732细胞增殖，对DNA合成也有促进作用。CT对OS-732细胞增殖的作用与1，25(OH)2D3相反，说明CT与1，25(OH)2D3对成骨样细胞有不同的调节作用。
, 百拇医药
细胞周期各时相的百分比反映了细胞增殖状态。我们曾报道1，25(OH)2D3处理第4天，大多数细胞进入G0期，2C细胞增加[5]。G0+G1百分比增高，S期百分比下降，细胞被阻断在G0+G1期。S期细胞百分比下降，G2+M期无改变。而1IU/ml CT处理后第4天，S期细胞百分比下降，而G2+M期上升，表明1IU/ml CT有促进4C细胞增殖的作用。
细胞膜在细胞代谢、分裂、增殖中起重要作用。细胞膜上蛋白质和脂类具有传递胞外各种信息的作用。细胞膜区的流动性反映分子在双层脂层三维空间中的运动。细胞膜的流动性与细胞的通透性、信号传递、膜上酶的活性激素受体功能等有密切关系[6]。膜流动性的下降使这些功能特征下降和损伤；膜流动性上升，使这些功能被激活。1，25(OH)2D3增加OS-732细胞膜的流动性，Robey等报道1，25(OH)2D3可刺激纤粘蛋白、骨桥蛋白的合成和骨钙素mRNA的表达[7]；而CT使OS-732细胞膜流动性下降，Teti和Bucsi等报道CT可增加MC-3T3-E1细胞胞浆内游离钙浓度[8]，刺激成纤维细胞集落形成等。[9]
, 百拇医药
我们的结论是：降钙素与1，25(OH)2D3不同，有促进人成骨样细胞增殖和降低细胞膜流动性的作用，反映两种钙调节激素对成骨细胞的作用不同。
基金项目：国家自然科学基金资助项目
作者简介：薛延，女，研究员
参考文献
1，Scheven BAA, Van Der Veen MJ, Damen CA, et al. Effect of methotrexate on human osteoblasts in vitro modulation by 1,25 dihydroxy vitamin D3, J Bone Miner Res, 1995,10(6):874
2，Favus MJ. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. New York:Raven Press,1996:58—76
, http://www.100md.com
3，张佩玉.人成骨肉瘤细胞系OS-732建立的细胞特征观察.中华骨科杂志，1985，5(2)：100—104
4，林克椿，聂松青，潘惠卿，等.用荧光探剂DPH研究腹水藻细胞膜流动性.生物化学与细胞生理进展，1981，6(42)：32—35
5，薛延，王红霞，袁润英，等.1，25双羟维生素D3对成骨样细胞增殖与分化的影响.中国骨质疏松杂志，1996，2(1)：28—31
6，蒋江红，余斌，俞志红，等.氧自由基，苯并[a]芘和佛波酯致NIH3T3细胞膜流动性改变.中国医学科学院学报，1997，19(3)：217—220
7，Robey PG, Boskey AL. The biochemistry of bone. In:Osteoporosis. Marcus R, Feldman D & Kelsey J, London:Academic Press Inc,1996:95—157
, 百拇医药
8，Teti A, Raniccia R, Goldring SR, Calcitonin increase cytosolic free calcium concentration via capacitative calcium entry pathway. J Bone Miner Res,1995,10(Supple 1):523
9，Bucsi L, Ashton BA. Comparative study of the in vitro effects of calcitonin, NaF and ipriflavone in cell culture. Magy Traumatol Ortop Kezceb Plasztikai-seb,1994,37(3):257—60
(1999-12-14收稿), 百拇医药
单位：北京市创伤骨科研究所，北京 100035
关键词：降钙素；OS-732细胞系；细胞增殖；细胞周期；细胞膜流动性
卫生研究000314 摘要：为了解降钙素(CT)对体外培养的人成骨样细胞OS-732增殖与细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)2D3的作用进行比较，在培养液中添加1IU/ml CT前后观察DNA合成速率、细胞增殖、细胞周期和细胞膜流动性的变化。结果表明CT有明显促进OS-732细胞增殖和DNA合成的作用，使G2+M期细胞所占的百分比增加，而S期细胞的百分比下降。1，25(OH)2D3可使细胞膜流动性增加，而1IU/ml CT使其下降。结论认为降钙素与1，25(OH)2D3不同，它促进人成骨样细胞增殖和降低细胞膜流动性。
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中图分类号：Q573 Q593.6 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0168-02
Effect of calcitonin on the proliferation and membrane fluidity of
human osteoblast-like cells
Xue Yan, Yuan Runying, Xiang Dong, Wang Hongxia
(Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035,China)
Abstract：The effects of calcitonin (CT) on the proliferation and membrane fluidity of human osteoblast-like cells line OS-732 were compared with the effect of 1,25(OH)2D3. The rate of DNA synthesis, cell proliferation, cell cycle and membrane fluidity of OS-732 cells were observed. Results showed that 1IU/ml CT stimulated cell proliferation and DNA synthesis. The percentage of cell in the G2+M phase was increased and the percentage of cell in the synthetic phase was decreased. The membrane fluidity of OS-732 cells was increased after 0.1μmol/L and 0.01μmol/L 1,25(OH)2D3 treatment and was decreased after 1IU/ml CT treatment. It is concluded that calcitonin might increase the cell proliferation and decrease the membrane fluidity.
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Key words:calcitonin, OS-732 cell line, cell proliferation, cell cycle, membrane fluidity
降钙素(CT)和1，25双羟维生素D3[1,25(OH)2D3]、甲状旁腺激素(PTH)是三大重要的钙调节激素[1，2]，它们之间互相协调不仅维持了血钙的平衡，也保证了骨代谢的正常进行，使骨形成和骨吸收处于平衡状态。当这一平衡被破坏就会引起代谢性骨病的发生。
我所建立的人成骨肉瘤细胞系OS-732[3]，已成为我们研究成骨样细胞特征的体外模型。本文观察了鲑鱼降钙素对人成骨样细胞OS-732细胞的增殖、细胞周期和细胞膜流动性的影响，并与1，25(OH)2D3进行比较。
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1 材料与方法
1.1 试剂
1，25双羟维生素D3[1，25(OH)2D3]由瑞士F.Hoffmann-La Roche公司提供。溶于无水乙醇，用培养液稀释成0.1和0.01μmol/L。
鲑鱼降钙素(calcitonin,CT)瑞士山德药厂产品，用培养液稀释成1IU/ml。
DPH(1，6-diphenyl-1,3,5-hexatriene,1,6,-二苯基-1,3,5,-已三烯)为美国Sigma公司产品，3H-TdR为中国原子能研究院产品，四氢呋喃为上海试剂厂产品。
1.2 细胞培养与处理
, 百拇医药
将人成骨样细胞系OS-732接种于含20%小牛血清的RPMI-1640(Gibco)培养液的培养瓶内，在对数生长期换为含1IU/ml CT的培养液，对照组仅更换基础培养液，将细胞密度调至5×104/ml，置于37℃，5%CO2培养箱中，第2、4、6天进行细胞计数，绘制生长曲线，并计数抑制率和增长率。
1.3 OS-732细胞DNA合成速率的测定
用培养液将细胞密度调至2.5×104/ml，将细胞悬液加入96孔培养板，每孔再加入3H-TdR 1000Bq，按纸片法进行3H-TdR参入实验，用液闪仪计数。
1.4 细胞周期分析
各实验组及对照组细胞在培养到第2、4、6天后离心收获，用70%冷乙醇固定24小时后用PBS清洗除去乙醇，用RNase(0.5mg/管)37℃消化30min，冷却，PI染色15min，用美国B-D公司FACS-440型流式细胞仪(激发光488nm，发射光585nm)以鸡血细胞为内参对照，测定DNA含量(CV值<7%)。根据DNA分布的直方图，用多项式拟合法计数细胞周期各时相的百分比。
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1.5 细胞膜脂的荧光标记及膜流动性的计算
DPH标记过程按文献进行[4]。将DPH溶于四氢呋喃，配成20mmol/L的储存液，用0.15mol/L PBS(pH7.5)稀释成2μ mol/L的应用液。用DPH应用液将细胞密度调至7×105/ml，37℃孵育30min。标记后的细胞用PBS洗涤并配成细胞悬液。用日立MPF-4型荧光分光光度计(激发波长为362nm，发射波长为432nm)，测定荧光偏振值(P)。
Pr和Pmax分别代表P的测量值和理论极限值(Pmax=0.5)
1.6 统计学处理
用t检验进行统计学处理。
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2 结 果
2.1 细胞生长曲线
1 IU/ml CT组和对照组细胞生长曲线表明：在给药后第2、4、6天CT对细胞增殖有促进作用(图1)。
图1 细胞生长曲线
2.2 DNA合成速率
OS-732细胞在用1 IU/ml CT处理后第2和第6天，3H-TdR参入量分别为13650和11326cpm，对照组分别为9373和7593cpm，表明1 IU/ml CT对OS-732细胞DNA合成有促进作用。
2.3 细胞周期
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在药物处理后第2、4、6天用流式细胞仪分别测定对照组和实验组的OS-732细胞DNA含量。按拟合曲线程序计算出各时相细胞百分数。
附表为用1IU/ml CT处理后第2、4、6天细胞周期各时相细胞百分比。在给CT后的第2、4、6天，G0+G1期细胞比率增加，S期细胞比率下降。G2+M期在给CT后第2和4天细胞比率均增加，而第6天下降。
2.4 细胞膜流动性
OS-732细胞膜流动度(LFU)在0.01 μmol/L 1，25(OH)2D3处理后第2天和第4天均高于对照组(图2a)。
OS-732细胞膜流动度在1 IU/ml CT处理后第2、4、6天，均低于对照组(图2b)。
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图2 细胞膜流动性
3 讨 论
1，25(OH)2D3对骨代谢和血钙浓度具有双向调节作用，既能促进骨吸收，又能促进骨形成。体外实验表明1，25(OH)2D3对不同来源和不同成熟阶段的细胞增殖均有抑制作用[5]。并参与调节成骨细胞(OB)的生理功能。1，25(OH)2D3促进OB分泌骨粘连蛋白、骨桥蛋白、骨唾液酸蛋白、骨钙素和IGF-1；抑制OB分泌Ⅰ型胶原并调节ALP的活性。而降钙素的主要生理功能是降低血钙，抑制破骨细胞(OC)活性和骨吸收。
本文以细胞生长曲线和3H TdR参入实验作为细胞增殖指标，观察CT对人成骨样细胞系OS-732增殖的影响。发现1 IU/ml CT可促进OS-732细胞增殖，对DNA合成也有促进作用。CT对OS-732细胞增殖的作用与1，25(OH)2D3相反，说明CT与1，25(OH)2D3对成骨样细胞有不同的调节作用。
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细胞周期各时相的百分比反映了细胞增殖状态。我们曾报道1，25(OH)2D3处理第4天，大多数细胞进入G0期，2C细胞增加[5]。G0+G1百分比增高，S期百分比下降，细胞被阻断在G0+G1期。S期细胞百分比下降，G2+M期无改变。而1IU/ml CT处理后第4天，S期细胞百分比下降，而G2+M期上升，表明1IU/ml CT有促进4C细胞增殖的作用。
细胞膜在细胞代谢、分裂、增殖中起重要作用。细胞膜上蛋白质和脂类具有传递胞外各种信息的作用。细胞膜区的流动性反映分子在双层脂层三维空间中的运动。细胞膜的流动性与细胞的通透性、信号传递、膜上酶的活性激素受体功能等有密切关系[6]。膜流动性的下降使这些功能特征下降和损伤；膜流动性上升，使这些功能被激活。1，25(OH)2D3增加OS-732细胞膜的流动性，Robey等报道1，25(OH)2D3可刺激纤粘蛋白、骨桥蛋白的合成和骨钙素mRNA的表达[7]；而CT使OS-732细胞膜流动性下降，Teti和Bucsi等报道CT可增加MC-3T3-E1细胞胞浆内游离钙浓度[8]，刺激成纤维细胞集落形成等。[9]
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我们的结论是：降钙素与1，25(OH)2D3不同，有促进人成骨样细胞增殖和降低细胞膜流动性的作用，反映两种钙调节激素对成骨细胞的作用不同。
基金项目：国家自然科学基金资助项目
作者简介：薛延，女，研究员
参考文献
1，Scheven BAA, Van Der Veen MJ, Damen CA, et al. Effect of methotrexate on human osteoblasts in vitro modulation by 1,25 dihydroxy vitamin D3, J Bone Miner Res, 1995,10(6):874
2，Favus MJ. Primer on the metabolic bone diseases and disorders of mineral metabolism. New York:Raven Press,1996:58—76
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3，张佩玉.人成骨肉瘤细胞系OS-732建立的细胞特征观察.中华骨科杂志，1985，5(2)：100—104
4，林克椿，聂松青，潘惠卿，等.用荧光探剂DPH研究腹水藻细胞膜流动性.生物化学与细胞生理进展，1981，6(42)：32—35
5，薛延，王红霞，袁润英，等.1，25双羟维生素D3对成骨样细胞增殖与分化的影响.中国骨质疏松杂志，1996，2(1)：28—31
6，蒋江红，余斌，俞志红，等.氧自由基，苯并[a]芘和佛波酯致NIH3T3细胞膜流动性改变.中国医学科学院学报，1997，19(3)：217—220
7，Robey PG, Boskey AL. The biochemistry of bone. In:Osteoporosis. Marcus R, Feldman D & Kelsey J, London:Academic Press Inc,1996:95—157
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8，Teti A, Raniccia R, Goldring SR, Calcitonin increase cytosolic free calcium concentration via capacitative calcium entry pathway. J Bone Miner Res,1995,10(Supple 1):523
9，Bucsi L, Ashton BA. Comparative study of the in vitro effects of calcitonin, NaF and ipriflavone in cell culture. Magy Traumatol Ortop Kezceb Plasztikai-seb,1994,37(3):257—60
(1999-12-14收稿), 百拇医药