样品前处理对食物中叶酸测定的影响
作者：王竹
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：叶酸；样品前处理；微生物法
卫生研究000617 摘要：叶酸结构上带有多谷氨酸残基，要准确测定食品中叶酸含量，必需采用适当的样品前处理方法对叶酸进行降解和提取。本文采用微生物法针对不同类食物讨论了磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH6.8)一次水解、二次水解、鸡胰酶水解、蛋白酶和/或淀粉酶水解以及3酶联合水解等方法对叶酸检出结果的影响。结果：强化剂类样品采用磷酸缓冲液一次水解；口服液采用鸡胰酶水解；蔬菜类样品采用磷酸缓冲液二次水解；含高蛋白和/或淀粉类样品采用3酶联合水解法，可得到叶酸最大检测结果。对不同的样品选用相应的前处理方法，批内、批间测定的相对标准差分别为6.5%～9.9%和3.5%～14.1%，回收率为86.8%～106.8%。
, 百拇医药
中图分类号：R151.3 TS207.4 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)06-0404-03
Effect of pretreatment on the measurement of folate in foods
Wang Zhu
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
Abstract：In order to measure the content of folate in foods accurately,to hydrolyze and extract folate in foods with suitable pretreatment is necessary because folate in foods is always in polyglutamate structure.The pretreatment of samples including hydrolysis with phosphate buffer(0.05 mol/L,pH6.8)once or twice,with chick pancreatin,protease and/or amylase,and a combining of trienzyme methods was compared and discussed.A microbiological method with lactobacillus casei was used.A high result of folate in foods could be obtained when extracting folate enriched samples or vegetables with phosphate buffer once or twice respectively,or hydrolyzing“extracted oral liquids”with chick pancreatin,or when extracting samples rich in protein and/or starch with trienzyme.The RSD of interassay and intrassay were 6.5%-9.9% and 3.5%-14.1% respectively,and the recovery rate was 86.8%-106.8%.
, 百拇医药
Key words:folate,pretreatment,microbiological method
叶酸通常是指含有蝶酰谷氨酸结构的一类维生素，微生物法是测定食物中叶酸含量的经典方法[1]，Lactobacillus Casei(ATCC7469)是常用菌种，可利用叶酸单、双、三谷氨酸盐。由于叶酸衍生物繁多，食物中部分叶酸以与蛋白结合的方式存在，加之受干扰物质的影响等，给叶酸测定带来一定困难；尤其是如何对样品进行前处理以得到最大检测结果是国内外分析工作者关注的问题。本文选取多类食物样品，对样品前处理方法进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种
用Lactobacillus Casei(ATCC7469)。培养基根据文献[2]由实验室配制：磷酸缓冲液(PB,0.05 mol/L,pH6.8，含1%维生素C)；蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶(Sigma公司)；叶酸标准品(Sigma公司)；分光光度计。
, 百拇医药
1.2 食物样品
包括强化剂、口服液、蔬菜、奶制品、谷类及动物内脏等，由市场上购买。
1.3 样品前处理
1.3.1 一次水解 称取一定量样品，加PB 50 ml，于121℃高压水解15 min。
1.3.2 二次水解 样品经上述处理后过滤，残渣用PB再次水解，合并2次滤液。
1.3.3 鸡胰酶水解 样品经一次水解后，加入鸡胰酶混悬液(0.5～6 mg/g样品)，37℃酶解16 h。
1.3.4 蛋白酶和/或淀粉酶水解 样品一次水解后，加入蛋白酶和/或淀粉酶混悬液(10 mg/g样品)，37℃酶解16 h；
, 百拇医药 1.3.5 3酶联合水解 高蛋白和/或淀粉类样品加入蛋白酶、淀粉酶和鸡胰酶联合水解16 h。
1.4 测定
采用微生物法。每个样品分别采用不同前处理方法至少测定2次，每次测定2～3个平行样品，结果以均值表示。以PB一次提取的检测结果作为基础值，将采用不同前处理方法的结果与其比较(用百分数表示)，以判断前处理方法对检测结果的影响。
2 结果
本实验室以往的研究表明，叶酸在酸性和过碱性的环境中破坏严重，样品提取液和培养基的pH值应控制在6.8～7.2，维生素C有助于预防叶酸受到氧化破坏，0.05 mol/L的磷酸缓冲液适合于叶酸提取。表1列出了采用不同样品前处理方法所测得的叶酸含量。以一次水解的检测结果作为基础值，与其它方法进行比较，发现不同的样品应采用不同的前处理方法，才能得到最大检测结果(表2)。含强化剂类食品，各种前处理方法没有明显差别，这可能是由于强化剂中叶酸结构比较单一，样品无需进一步处理。从天然食物中提炼而来的口服液选用鸡胰酶水解法基本可以得到最大检测结果；蔬菜样品采用二次水解处理的结果高于鸡胰酶水解结果；4种样品前处理方法均可不同程度地提高含蛋白质和/或淀粉类食品中叶酸含量的检测结果，其中3酶联合水解法对叶酸的检测发挥了更大的作用。
, http://www.100md.com
表1 采用不同前处理方法的叶酸检测结果
μg/100g 样品
PB一
次水解
PB二
次水解
鸡胰酶
水解
蛋白酶和
/或淀粉
酶水解
3酶联
合水解
, 百拇医药
强化剂(1)
叶酸药片
4.2
4.1
3.6
4.1
-
英之康
0.39
0.37
0.42
0.39
-
, 百拇医药
口服液
生命源口服液
0.25
-
0.29
0.26
-
三株口服液
2.0
-
2.1
-
双歧王口服液
, 百拇医药
3.7
-
3.5
3.4
-
花粉蜂王浆
18.4
-
66.8
37.2
-
蔬菜
洋葱
, http://www.100md.com 11.2
15.6
13.7
-
-
油菜
46.2
-
26.3
-
-
芹菜
24.2
29.0
, http://www.100md.com
22.8
-
-
小葱
18.9
20.5
16.5
-
-
菠菜
65.8
72.9
79.6
, 百拇医药 -
-
含高蛋白质/淀粉食品
奶粉(1)
16.5
18.3
37.5
36.2
38.2
奶粉(2)
20.9
22.0
22.5
, 百拇医药
53.5
52.6
奶粉(3)
17.2
15.2
16.5
15.8
35.1
富叶酸米
253.2
-
315.9
340.0
, 百拇医药
384.5
面粉
2.5
3.4
4.5
7.5
16.7
大豆提取物
16.7
24.0
94.2
27.6
288.9
, 百拇医药
猪肝
185.6
330.7
277.7
382.8
356.4
注：(1)单位，mg/片表2 同一次样品提取液不同前处理方法对叶酸检测
结果的影响 % 样品
PB二次
水解法
鸡胰酶水解
蛋白和/或淀
, http://www.100md.com
粉酶水解
3酶联合水解
强化剂
94.9～ 97.6
85.7～107.7
97.6 ～1 00.0
-
口服液
-
94.6～363.0
91.9～202.2
-
, http://www.100md.com 蔬菜
108.5～139.3
56.9 ～122.3
-
-
含高蛋白质
/淀粉食品
88.4～178.2
95.9 ～564.1
91.9～300.0
151.9～1729.9
在以上研究的基础上，对谷类、奶粉、动物性食物采用3酶联合水解，果蔬采用二次水解，强化剂类样品采用PB一次水解的方法，进行方法的精密度、准确度的实验。批内、批间测定的相对标准差(RSD)分别为6.5%～9.9%和3.5%～14.1%，其中蔬菜的批间RSD>10%；回收率为86.8%～106.8%(表3)。表3 不同方法批内、批间测定结果及回收率(n=6) 样品
, 百拇医药
批内测定
批间测定
回收率
(%)
±s
(μg/100g)
RSD
(%)±s
( μg/100g)
RSD
(%)
, 百拇医药
奶粉
38.2± 3.8
9.9
37.7± 3.6
9.6
99.6
富叶酸米
848.3±66.1
7.8
865.1±30.1
3.5
106.8
猪肝
, http://www.100md.com
335.2±27.9
8.3
324.8±31.9
9.8
90.2
菠菜
75.6± 5.2
6.9
79.6±11.2
14.1
95.8
芹菜
10.8± 0.9
, 百拇医药
8.3
10.2± 1.3
12.7
97.3
叶酸片
4.6± 0.3(1)
6.5
4.7± 0.3(1)
6.4
97.5
注：(1)单位：mg/片3 讨论
在自然界中叶酸多以蝶酰多谷氨酸盐的形式存在，即便是以单谷氨酸盐形式存在，也常是多种衍生物共存，所以在测定时必需应用轭合酶对叶酸进行降解，以便得到L.Casei可利用的叶酸盐形式。目前国际上的前处理方法常用鸡胰酶水解。
, http://www.100md.com
鸡胰酶含有叶酸轭合酶，可将叶酸水解成双谷氨酸盐，其用量直接影响叶酸测定。以往的报告中指出水解200 ng叶酸需加入0.5～1 mg鸡胰酶[2]。Goli等认为在pH7.0的环境下增加酶的用量并将水解时间延长至20 h，可以改善干扰因子对酶的抑制作用[3，4]。Phillips发现鸡胰酶用量加大时，叶酸水解可达到一定稳态[5]。为此，本研究以大豆制品为对象，选用不同剂量的鸡胰酶对样品进行水解，发现当水解200 ng叶酸，鸡胰酶用量为2～4 mg时，检测结果随酶用量增高而增高，当超过4 mg时，检测结果呈现下降趋势，表明鸡胰酶用量以4 mg为宜。
本研究中发现，虽然用鸡胰酶增加了部分样品叶酸检测结果，但不能解决所有的样品前处理问题。这可能是因为轭合酶的活性可受到多种因素的干扰，如蔬菜中的柠檬酸等。并且天然食物中，如蔬菜、动物性食物含有内源性轭合酶，使各衍生物之间可以互相转换[6，7]，且在储存过程中降解。这可能也是在蔬菜测定过程中外源性轭合酶不能充分发挥效用、批间测定RSD增大的原因之一。本文中对蔬菜样品采用PB二次水解可得到最大结果，无需鸡胰酶处理。值得一提的是测定果蔬样品时，应选用新鲜样品并及时处理，减少储存过程中叶酸转化和降解，以保证测定结果可靠。
, 百拇医药
一般认为，叶酸多谷氨酸盐是以γ-羧基而不是α-羧基链结合的，普通的蛋白酶不能起到去轭合的作用。但实验发现蛋白酶、淀粉酶有助于含有高蛋白/淀粉食物中叶酸的测定，说明在蛋白酶、淀粉酶的作用下，样品中包裹于蛋白、淀粉中间的叶酸或与蛋白结合的叶酸可能被释放，提高了部分样品的检测结果。而3酶联合应用更有利于叶酸的检测，并且3酶联合的水解效力不简单地等于三种酶的效力之和。其作用机制有待于进一步研究。
综上所述，叶酸测定的样品前处理过程应视样品种类而定，适宜的前处理方法有助于获得最大检出结果。强化剂型样品可直接采用磷酸缓冲液一次水解；蔬菜类样品宜采用PB2次水解；含高蛋白质、高淀粉的样品需用鸡胰酶、蛋白酶、淀粉酶3酶联合水解。
作者简介：王竹，女，本科，助理研究员
4 参考文献
1，Tanner JT,Barnett SA,Mountford MK.Analysis of milk-base d infant formula.J AOAC international,1993,76:399-413
, 百拇医药
2，Jorg A,Barbara P,Klein DAB,et al.Methods of vitamin assays.4th e d. New York: John Wiley & Sons Inc,1985,445-462
3，Goli DM,Vanderslice JT.Microbiological assays of folacin using a CO2 analyzer system.J Micronutr Analy,1989,6:19-33
4，Goli DM,Vanderslice JT.Investigation of the conjugase treatment procedure in the microbiological assay of folate.Food Chem,1992,43:57-64
5，Phillips DR,Wright JR.Studies on the response of Lactobacillus casei to different folate monoglutamates.Br J Nutr,1982,47:183-189
, http://www.100md.com
6，Engelhardt R,Jesse FG Ⅲ.Adequacy of enzymatic deconjugation in quantification of folate in foods.J Agric Food Chem,1990,38:154-158
7，Gregory JF,Sartain DB,Day BPF.Fluorometric determination of folacin in biological materials using high performance liquid chromatography.J Nutr,1984,114:341-353
(1999-12-03收稿), 百拇医药
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：叶酸；样品前处理；微生物法
卫生研究000617 摘要：叶酸结构上带有多谷氨酸残基，要准确测定食品中叶酸含量，必需采用适当的样品前处理方法对叶酸进行降解和提取。本文采用微生物法针对不同类食物讨论了磷酸缓冲液(0.05 mol/L,pH6.8)一次水解、二次水解、鸡胰酶水解、蛋白酶和/或淀粉酶水解以及3酶联合水解等方法对叶酸检出结果的影响。结果：强化剂类样品采用磷酸缓冲液一次水解；口服液采用鸡胰酶水解；蔬菜类样品采用磷酸缓冲液二次水解；含高蛋白和/或淀粉类样品采用3酶联合水解法，可得到叶酸最大检测结果。对不同的样品选用相应的前处理方法，批内、批间测定的相对标准差分别为6.5%～9.9%和3.5%～14.1%，回收率为86.8%～106.8%。
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中图分类号：R151.3 TS207.4 文献标识码：B
文章编号：1000-8020(2000)06-0404-03
Effect of pretreatment on the measurement of folate in foods
Wang Zhu
(Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100050,China)
Abstract：In order to measure the content of folate in foods accurately,to hydrolyze and extract folate in foods with suitable pretreatment is necessary because folate in foods is always in polyglutamate structure.The pretreatment of samples including hydrolysis with phosphate buffer(0.05 mol/L,pH6.8)once or twice,with chick pancreatin,protease and/or amylase,and a combining of trienzyme methods was compared and discussed.A microbiological method with lactobacillus casei was used.A high result of folate in foods could be obtained when extracting folate enriched samples or vegetables with phosphate buffer once or twice respectively,or hydrolyzing“extracted oral liquids”with chick pancreatin,or when extracting samples rich in protein and/or starch with trienzyme.The RSD of interassay and intrassay were 6.5%-9.9% and 3.5%-14.1% respectively,and the recovery rate was 86.8%-106.8%.
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Key words:folate,pretreatment,microbiological method
叶酸通常是指含有蝶酰谷氨酸结构的一类维生素，微生物法是测定食物中叶酸含量的经典方法[1]，Lactobacillus Casei(ATCC7469)是常用菌种，可利用叶酸单、双、三谷氨酸盐。由于叶酸衍生物繁多，食物中部分叶酸以与蛋白结合的方式存在，加之受干扰物质的影响等，给叶酸测定带来一定困难；尤其是如何对样品进行前处理以得到最大检测结果是国内外分析工作者关注的问题。本文选取多类食物样品，对样品前处理方法进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 菌种
用Lactobacillus Casei(ATCC7469)。培养基根据文献[2]由实验室配制：磷酸缓冲液(PB,0.05 mol/L,pH6.8，含1%维生素C)；蛋白酶、淀粉酶、鸡胰酶(Sigma公司)；叶酸标准品(Sigma公司)；分光光度计。
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1.2 食物样品
包括强化剂、口服液、蔬菜、奶制品、谷类及动物内脏等，由市场上购买。
1.3 样品前处理
1.3.1 一次水解 称取一定量样品，加PB 50 ml，于121℃高压水解15 min。
1.3.2 二次水解 样品经上述处理后过滤，残渣用PB再次水解，合并2次滤液。
1.3.3 鸡胰酶水解 样品经一次水解后，加入鸡胰酶混悬液(0.5～6 mg/g样品)，37℃酶解16 h。
1.3.4 蛋白酶和/或淀粉酶水解 样品一次水解后，加入蛋白酶和/或淀粉酶混悬液(10 mg/g样品)，37℃酶解16 h；
, 百拇医药 1.3.5 3酶联合水解 高蛋白和/或淀粉类样品加入蛋白酶、淀粉酶和鸡胰酶联合水解16 h。
1.4 测定
采用微生物法。每个样品分别采用不同前处理方法至少测定2次，每次测定2～3个平行样品，结果以均值表示。以PB一次提取的检测结果作为基础值，将采用不同前处理方法的结果与其比较(用百分数表示)，以判断前处理方法对检测结果的影响。
2 结果
本实验室以往的研究表明，叶酸在酸性和过碱性的环境中破坏严重，样品提取液和培养基的pH值应控制在6.8～7.2，维生素C有助于预防叶酸受到氧化破坏，0.05 mol/L的磷酸缓冲液适合于叶酸提取。表1列出了采用不同样品前处理方法所测得的叶酸含量。以一次水解的检测结果作为基础值，与其它方法进行比较，发现不同的样品应采用不同的前处理方法，才能得到最大检测结果(表2)。含强化剂类食品，各种前处理方法没有明显差别，这可能是由于强化剂中叶酸结构比较单一，样品无需进一步处理。从天然食物中提炼而来的口服液选用鸡胰酶水解法基本可以得到最大检测结果；蔬菜样品采用二次水解处理的结果高于鸡胰酶水解结果；4种样品前处理方法均可不同程度地提高含蛋白质和/或淀粉类食品中叶酸含量的检测结果，其中3酶联合水解法对叶酸的检测发挥了更大的作用。
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表1 采用不同前处理方法的叶酸检测结果
μg/100g 样品
PB一
次水解
PB二
次水解
鸡胰酶
水解
蛋白酶和
/或淀粉
酶水解
3酶联
合水解
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强化剂(1)
叶酸药片
4.2
4.1
3.6
4.1
-
英之康
0.39
0.37
0.42
0.39
-
, 百拇医药
口服液
生命源口服液
0.25
-
0.29
0.26
-
三株口服液
2.0
-
2.1
-
双歧王口服液
, 百拇医药
3.7
-
3.5
3.4
-
花粉蜂王浆
18.4
-
66.8
37.2
-
蔬菜
洋葱
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15.6
13.7
-
-
油菜
46.2
-
26.3
-
-
芹菜
24.2
29.0
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22.8
-
-
小葱
18.9
20.5
16.5
-
-
菠菜
65.8
72.9
79.6
, 百拇医药 -
-
含高蛋白质/淀粉食品
奶粉(1)
16.5
18.3
37.5
36.2
38.2
奶粉(2)
20.9
22.0
22.5
, 百拇医药
53.5
52.6
奶粉(3)
17.2
15.2
16.5
15.8
35.1
富叶酸米
253.2
-
315.9
340.0
, 百拇医药
384.5
面粉
2.5
3.4
4.5
7.5
16.7
大豆提取物
16.7
24.0
94.2
27.6
288.9
, 百拇医药
猪肝
185.6
330.7
277.7
382.8
356.4
注：(1)单位，mg/片表2 同一次样品提取液不同前处理方法对叶酸检测
结果的影响 % 样品
PB二次
水解法
鸡胰酶水解
蛋白和/或淀
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粉酶水解
3酶联合水解
强化剂
94.9～ 97.6
85.7～107.7
97.6 ～1 00.0
-
口服液
-
94.6～363.0
91.9～202.2
-
, http://www.100md.com 蔬菜
108.5～139.3
56.9 ～122.3
-
-
含高蛋白质
/淀粉食品
88.4～178.2
95.9 ～564.1
91.9～300.0
151.9～1729.9
在以上研究的基础上，对谷类、奶粉、动物性食物采用3酶联合水解，果蔬采用二次水解，强化剂类样品采用PB一次水解的方法，进行方法的精密度、准确度的实验。批内、批间测定的相对标准差(RSD)分别为6.5%～9.9%和3.5%～14.1%，其中蔬菜的批间RSD>10%；回收率为86.8%～106.8%(表3)。表3 不同方法批内、批间测定结果及回收率(n=6) 样品
, 百拇医药
批内测定
批间测定
回收率
(%)
±s(μg/100g)
RSD
(%)
±s( μg/100g)
RSD
(%)
, 百拇医药
奶粉
38.2± 3.8
9.9
37.7± 3.6
9.6
99.6
富叶酸米
848.3±66.1
7.8
865.1±30.1
3.5
106.8
猪肝
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335.2±27.9
8.3
324.8±31.9
9.8
90.2
菠菜
75.6± 5.2
6.9
79.6±11.2
14.1
95.8
芹菜
10.8± 0.9
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8.3
10.2± 1.3
12.7
97.3
叶酸片
4.6± 0.3(1)
6.5
4.7± 0.3(1)
6.4
97.5
注：(1)单位：mg/片3 讨论
在自然界中叶酸多以蝶酰多谷氨酸盐的形式存在，即便是以单谷氨酸盐形式存在，也常是多种衍生物共存，所以在测定时必需应用轭合酶对叶酸进行降解，以便得到L.Casei可利用的叶酸盐形式。目前国际上的前处理方法常用鸡胰酶水解。
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鸡胰酶含有叶酸轭合酶，可将叶酸水解成双谷氨酸盐，其用量直接影响叶酸测定。以往的报告中指出水解200 ng叶酸需加入0.5～1 mg鸡胰酶[2]。Goli等认为在pH7.0的环境下增加酶的用量并将水解时间延长至20 h，可以改善干扰因子对酶的抑制作用[3，4]。Phillips发现鸡胰酶用量加大时，叶酸水解可达到一定稳态[5]。为此，本研究以大豆制品为对象，选用不同剂量的鸡胰酶对样品进行水解，发现当水解200 ng叶酸，鸡胰酶用量为2～4 mg时，检测结果随酶用量增高而增高，当超过4 mg时，检测结果呈现下降趋势，表明鸡胰酶用量以4 mg为宜。
本研究中发现，虽然用鸡胰酶增加了部分样品叶酸检测结果，但不能解决所有的样品前处理问题。这可能是因为轭合酶的活性可受到多种因素的干扰，如蔬菜中的柠檬酸等。并且天然食物中，如蔬菜、动物性食物含有内源性轭合酶，使各衍生物之间可以互相转换[6，7]，且在储存过程中降解。这可能也是在蔬菜测定过程中外源性轭合酶不能充分发挥效用、批间测定RSD增大的原因之一。本文中对蔬菜样品采用PB二次水解可得到最大结果，无需鸡胰酶处理。值得一提的是测定果蔬样品时，应选用新鲜样品并及时处理，减少储存过程中叶酸转化和降解，以保证测定结果可靠。
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一般认为，叶酸多谷氨酸盐是以γ-羧基而不是α-羧基链结合的，普通的蛋白酶不能起到去轭合的作用。但实验发现蛋白酶、淀粉酶有助于含有高蛋白/淀粉食物中叶酸的测定，说明在蛋白酶、淀粉酶的作用下，样品中包裹于蛋白、淀粉中间的叶酸或与蛋白结合的叶酸可能被释放，提高了部分样品的检测结果。而3酶联合应用更有利于叶酸的检测，并且3酶联合的水解效力不简单地等于三种酶的效力之和。其作用机制有待于进一步研究。
综上所述，叶酸测定的样品前处理过程应视样品种类而定，适宜的前处理方法有助于获得最大检出结果。强化剂型样品可直接采用磷酸缓冲液一次水解；蔬菜类样品宜采用PB2次水解；含高蛋白质、高淀粉的样品需用鸡胰酶、蛋白酶、淀粉酶3酶联合水解。
作者简介：王竹，女，本科，助理研究员
4 参考文献
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(1999-12-03收稿), 百拇医药