兔海水淹溺肺水肿肺Na＋-K＋-ATP酶和细胞色素氧化酶活性变化的图像定量分析(论著)
作者：王琰 董文度 赵增荣 袁驾南 张敏华 刘虹 徐根兴 谷俊
单位：210099 南京，海军医学高等专科学校细胞生物学研究室
关键词：Na+-K+-ATP酶；；；细胞色素氧化酶；；海水淹溺肺水肿
兔海水淹溺肺水肿肺Na
摘要 目的:探究海水淹溺肺水肿(PE-SWD)的典型症状及其病理生理变化。方
法：通过向兔肺进行海水灌注诱导PE-SWD。用细胞化学和图像定量分析方法测
定兔肺组织Na+-K+-ATP酶和细胞色素氧化酶(CYTO)活性。结果：PE-SWD组兔
, 百拇医药
肺中，以上两种酶活性均显著降低。结论：酶活性的降低可能与淹溺造成肺组
织缺氧有关，同时缺氧引起ATP减少导致一系列肺组织代谢、功能与结构的变
化，造成肺不张和PE-SWD。Image quantitative assay of Na+-K+-ATPase and cytochrome oxidase
activity changes in lung tissue of rabbit with pulmonary edema after
seawater drowning Wang Yan,Dong Wendu,Zhao Zengrong,et al.Naval
, http://www.100md.com
Medical College,Nanjing 210099
Abstract Aim:To investigate the characteristic symptom and physiopathologic
changes of pulmonary edema after seawater drowning(PE-SWD).Methods:
Sea-water was infused into the rabbit's lung to induce PE-SWD.Cytochemical
and image quantitative assays were used to detected the Na+-K+-ATPase
, http://www.100md.com
and cytochrome oxidase activities in the lung tissue.Results: the activities of
the above mentioned two enzymes in the lung were shown decreased
significantly after sea-water infusing.Conclusion:The decrease of enzyme
activities may be related to the anoxia of lung tissue caused by sea-water
infusion;and the ATP deficiency caused by anoxia resulted in a series of
, http://www.100md.com
changes of metabolism,function and structure of the lung leading to atelectasis
and PE-SWD.
Key words Na+-K+-ATPase Cytochrome oxidase(CYTO)
Pulmonary edema after seawater drowning(PE-SWD)
(Chin J Naut Med,1998，5：90)
海水淹溺后淹溺者一旦发生肺水肿，病情多危重，常造成死亡，为探讨
, http://www.100md.com 其机理，本实验选用纯种新西兰兔为实验动物，向其肺内灌入海水，成功地
复制出海水淹溺肺水肿(pulmonary edema after seawater drowning,PE-SWD)动物模
型。用图像定量分析方法，观察肺中Na+-K+-ATP酶和细胞色素氧化酶(cytochrome
oxidase,CYTO)的活性变化。
材料和方法
1.实验动物：雌性一级纯种新西兰兔18只(江苏省农科院动物实验中心提供)，体重2.44±0.21 kg。随机分成PE-SWD组14只和不灌海水对照组4只。
2.动物模型复制：PE-SWD组动物耳缘静脉注射20%氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg)麻
, http://www.100md.com
醉。将兔仰卧于兔台上，气管切开插入“Y”型玻璃套管，左侧颈总动脉插管
连接检压计观察记录血压。快速向兔肺内灌入海水(4 ml/kg)，1分钟内灌完。
连续观察120分钟，可见灌海水后动物出现明显的呼吸困难，呼吸频率显著增
加，持续波动在161-196/min之间，两肺布满湿罗音，气管内不断溢出泡沫状
液体，PaO2和SatO2显著下降，表现出严重的进行性低氧血症，发绀明显。动
脉血pH、实际碳酸氢盐、碱剩余等项指标均降低，酸中毒持续存在，血压处于
较低水平。肺表面可见暗红色片状区和(或)出血区，切面可挤出多量的粉红色
, 百拇医药
水肿液。形成典型的PE-SWD模型。
3.细胞化学反应检查：于灌海水后120分钟，将PE-SWD组兔静脉注入3.0%戊巴比
妥麻醉处死，对照组亦以同样方法处死。分别从两组兔肺下叶取0.5 cm×0.5 cm×
0.5 cm肺组织6块，2%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定液固定1小时，切成10 mm厚的薄
片，进行Na+-K+-ATPase和CYTO反应。
4.图像定量分析：为相对定量比较两组间酶活性强度的变化情况，酶反应的切
片用本室研制的彩色图像分析仪进行酶活性反应的平均灰度测量[1]。该图
, 百拇医药
像分析仪的灰度级为256级，灰度值越低，表示酶反应强度越大，以积分吸光
度作为主要输出来表示强度量的变化。图像监视器为512×512象素点，在128×
128象素点测量窗口下，每张切片随机测量至少36次，取其平均值，进行统计
学F和t检验。分析结果标记为：A1：阳性反应面积，A2阴性反应面积，G1：
阳性反应区域平均灰度，G2：阴性反应区域平均灰度。A1和A2的单位为测
量窗128×128象素点中所占相对面积(μm2)，G1和G2为灰度范围0～255中的相
, 百拇医药
对测量值(无单位)[1]。
结 果
1.酶的定位：Na+-K+-ATPase和CYTO反应的产物呈棕黄色，Na+-K+-ATPase
产物位于细胞膜上，CYTO反应产物位于线粒体中。将两种酶反应切片置于光
镜下观察，可见中央无色透明，为阴性反应区。
2.定量分析：见表1、2。
表1 PE-SWD组肺细胞中Na+-K+-ATPase活性变化的图像定量分析
, 百拇医药
Tab.1 Image quantitative assay of Na+-K+-ATPase activity change in lung
cells of PE-SWD group 图像分析
image assay
组别group
对照control
PE-SWD
A1(um2)
80.72±21.24
, 百拇医药
35.59±10.91**
A2(um2)
1188.42±21.24
1233.55±10.91**
G1
70.80±2.77
77.07±4.02**
G2
103.42±2.52
105.41±1.75**
, 百拇医药
A1：posit reaction area A2：neg reaction area
G1：average grey of A1 G2:average grey of A2
与对照组比vs control group **P<0.01
表2 PE-SWD组肺细胞中CYTO活性变化的图像定量分析
Tab.2 Image quantitativc assay of CYTO activity
change in lung cells of PE-SWD group 图像分析
, http://www.100md.com
image assay
组别group
对照control
PE-SWD
A1(um2)
84.45±10.49
39.83±8.74**
A2(um2)
1184.69±10.95
29.31±8.74**
, http://www.100md.com
G1
83.75±2.40
85.61±3.84*
G2
107.20±1.69
106.87±2.68
与对照组比vs control group *P<0.05 **P<0.01
讨 论
Na+-K+-ATPase是细胞膜上的镶嵌蛋白质，属离子泵。表1图像分析结
, http://www.100md.com
果显示，溺水兔肺组织中Na+-K+-ATPase阳性反应面积显著低于正常兔，而
灰度值则显著高于正常兔。阳性反应区域面积表示反应产物总量，阳性反应
区域面积降低表示反应产物总量减少，即酶活性降低；灰度值表示反应产物
的分布密度，灰度值增加表示产物分布密度下降，即酶活性下降。Na+-K+
-ATPase活性下降，则Na+被泵出细胞的效率受影响，Na+在细胞内积聚，引
起细胞水肿，细胞结构受到破坏，进而使Na+-K+-ATPase活性进一步下降。
, 百拇医药
由于Na+梯度参与细胞膜对葡萄糖、氨基酸等物质的摄入，Na+-K+-ATPase
活性下降对细胞的长期后果是引起细胞内能量缺乏和影响蛋白质等有机大分
子的新陈代谢，造成进一步的结构损伤。推测Na+-K+-ATPase活性下降是由
于细胞处于缺氧状态，造成细胞损伤而间接引起。
CYTO是线粒体(mitochondria,MIT)内膜上的镶嵌蛋白质，是MIT电子传递
链的重要环节。表2的图像分析结果显示，溺水后兔肺细胞中CYTO的阳性反应
区域面积下降，灰度值上升，表明溺水后CYTO反应的产物总量下降，产物分
, 百拇医药
布密度降低，即CYTO活性下降。溺水后CYTO活性下降，表明肺细胞中MIT进行
氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，作为细胞中各种反应的原动力，ATP缺乏将
对细胞产生广泛而深远的影响：(1)影响Na+-K+-ATPase活性，造成细胞水肿，并引起细胞其它结构的破坏；(2)ATP缺乏引起肾H+分泌障碍，导致代谢性酸
中毒，使呼吸加深加快；(3)抑制表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的合成
与分泌。实验观察到，海水肺灌注后兔气道中有许多气泡，推测这是由于海
水进入气管、支气管和肺后，一些含有亲水及疏水基团的分子(包括蛋白质、PS等)混入液体之故。气泡阻碍空气流通，会产生压力性肺水肿；而PS流失则
, 百拇医药
使肺泡表面液体层表面张力增加，肺泡回缩力增加，导致肺不张。CYTO活性下
降，是由于细胞缺氧，电子传递链不能及时将电子传给O2，以及电子传递链
上的CYTO等蛋白质停滞于还原状态所致[2～8]。
参 考 文 献
1 徐根兴.定量细胞和细胞化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993.77-85.
2 Garg LC,Saha PK,Mohuczy D.Cholinergic inhibition of Na+-K+-ATPase
via activation of protein kinase C in Madin-Darby canine kidney cells.J Am Soc
, http://www.100md.com
Nephrol,1993,4:195-205.
3 Gotloib L,Shoslad A,Wajsbrot V,et al.The cytochemical profile of visceral
mesothelium under the influence of lactated-hyperosmolar peritoneal dialysis
solutions.Nephron,1995,69:466-471.
4 Meyer LH,Wanning C,Michel J,et al.Cellular mechanisms of action of a
ouabain-like factor in vascular smooth-musclc cells.J Cardiovasc Pharmacol,1993,22(Suppl2):S16-19.
, http://www.100md.com
5 徐根兴，董文度，袁驾南,等.海水型呼吸窘迫综合征兔肾皮质酶活性定位和图像
分析.中华航海医学杂志，1994，1：132-135.
6 范少光，汤浩，张衡.人体生理学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联
合出版社，1996.142-149.
7 王迪浔，金惠铭.病理生理学.北京:人民卫生出版社，1994.516-519.
8 印永嘉，李大珍.物理化学简明教程.北京：高等教育出版社，1984.117-132.
(收稿：1997-07-03 修回：1998-01-26), http://www.100md.com
单位：210099 南京，海军医学高等专科学校细胞生物学研究室
关键词：Na+-K+-ATP酶；；；细胞色素氧化酶；；海水淹溺肺水肿
兔海水淹溺肺水肿肺Na
摘要 目的:探究海水淹溺肺水肿(PE-SWD)的典型症状及其病理生理变化。方
法：通过向兔肺进行海水灌注诱导PE-SWD。用细胞化学和图像定量分析方法测
定兔肺组织Na+-K+-ATP酶和细胞色素氧化酶(CYTO)活性。结果：PE-SWD组兔
, 百拇医药
肺中，以上两种酶活性均显著降低。结论：酶活性的降低可能与淹溺造成肺组
织缺氧有关，同时缺氧引起ATP减少导致一系列肺组织代谢、功能与结构的变
化，造成肺不张和PE-SWD。Image quantitative assay of Na+-K+-ATPase and cytochrome oxidase
activity changes in lung tissue of rabbit with pulmonary edema after
seawater drowning Wang Yan,Dong Wendu,Zhao Zengrong,et al.Naval
, http://www.100md.com
Medical College,Nanjing 210099
Abstract Aim:To investigate the characteristic symptom and physiopathologic
changes of pulmonary edema after seawater drowning(PE-SWD).Methods:
Sea-water was infused into the rabbit's lung to induce PE-SWD.Cytochemical
and image quantitative assays were used to detected the Na+-K+-ATPase
, http://www.100md.com
and cytochrome oxidase activities in the lung tissue.Results: the activities of
the above mentioned two enzymes in the lung were shown decreased
significantly after sea-water infusing.Conclusion:The decrease of enzyme
activities may be related to the anoxia of lung tissue caused by sea-water
infusion;and the ATP deficiency caused by anoxia resulted in a series of
, http://www.100md.com
changes of metabolism,function and structure of the lung leading to atelectasis
and PE-SWD.
Key words Na+-K+-ATPase Cytochrome oxidase(CYTO)
Pulmonary edema after seawater drowning(PE-SWD)
(Chin J Naut Med,1998，5：90)
海水淹溺后淹溺者一旦发生肺水肿，病情多危重，常造成死亡，为探讨
, http://www.100md.com 其机理，本实验选用纯种新西兰兔为实验动物，向其肺内灌入海水，成功地
复制出海水淹溺肺水肿(pulmonary edema after seawater drowning,PE-SWD)动物模
型。用图像定量分析方法，观察肺中Na+-K+-ATP酶和细胞色素氧化酶(cytochrome
oxidase,CYTO)的活性变化。
材料和方法
1.实验动物：雌性一级纯种新西兰兔18只(江苏省农科院动物实验中心提供)，体重2.44±0.21 kg。随机分成PE-SWD组14只和不灌海水对照组4只。
2.动物模型复制：PE-SWD组动物耳缘静脉注射20%氨基甲酸乙酯(1.0 g/kg)麻
, http://www.100md.com
醉。将兔仰卧于兔台上，气管切开插入“Y”型玻璃套管，左侧颈总动脉插管
连接检压计观察记录血压。快速向兔肺内灌入海水(4 ml/kg)，1分钟内灌完。
连续观察120分钟，可见灌海水后动物出现明显的呼吸困难，呼吸频率显著增
加，持续波动在161-196/min之间，两肺布满湿罗音，气管内不断溢出泡沫状
液体，PaO2和SatO2显著下降，表现出严重的进行性低氧血症，发绀明显。动
脉血pH、实际碳酸氢盐、碱剩余等项指标均降低，酸中毒持续存在，血压处于
较低水平。肺表面可见暗红色片状区和(或)出血区，切面可挤出多量的粉红色
, 百拇医药
水肿液。形成典型的PE-SWD模型。
3.细胞化学反应检查：于灌海水后120分钟，将PE-SWD组兔静脉注入3.0%戊巴比
妥麻醉处死，对照组亦以同样方法处死。分别从两组兔肺下叶取0.5 cm×0.5 cm×
0.5 cm肺组织6块，2%多聚甲醛-0.5%戊二醛固定液固定1小时，切成10 mm厚的薄
片，进行Na+-K+-ATPase和CYTO反应。
4.图像定量分析：为相对定量比较两组间酶活性强度的变化情况，酶反应的切
片用本室研制的彩色图像分析仪进行酶活性反应的平均灰度测量[1]。该图
, 百拇医药
像分析仪的灰度级为256级，灰度值越低，表示酶反应强度越大，以积分吸光
度作为主要输出来表示强度量的变化。图像监视器为512×512象素点，在128×
128象素点测量窗口下，每张切片随机测量至少36次，取其平均值，进行统计
学F和t检验。分析结果标记为：A1：阳性反应面积，A2阴性反应面积，G1：
阳性反应区域平均灰度，G2：阴性反应区域平均灰度。A1和A2的单位为测
量窗128×128象素点中所占相对面积(μm2)，G1和G2为灰度范围0～255中的相
, 百拇医药
对测量值(无单位)[1]。
结 果
1.酶的定位：Na+-K+-ATPase和CYTO反应的产物呈棕黄色，Na+-K+-ATPase
产物位于细胞膜上，CYTO反应产物位于线粒体中。将两种酶反应切片置于光
镜下观察，可见中央无色透明，为阴性反应区。
2.定量分析：见表1、2。
表1 PE-SWD组肺细胞中Na+-K+-ATPase活性变化的图像定量分析
, 百拇医药
Tab.1 Image quantitative assay of Na+-K+-ATPase activity change in lung
cells of PE-SWD group 图像分析
image assay
组别group
对照control
PE-SWD
A1(um2)
80.72±21.24
, 百拇医药
35.59±10.91**
A2(um2)
1188.42±21.24
1233.55±10.91**
G1
70.80±2.77
77.07±4.02**
G2
103.42±2.52
105.41±1.75**
, 百拇医药
A1：posit reaction area A2：neg reaction area
G1：average grey of A1 G2:average grey of A2
与对照组比vs control group **P<0.01
表2 PE-SWD组肺细胞中CYTO活性变化的图像定量分析
Tab.2 Image quantitativc assay of CYTO activity
change in lung cells of PE-SWD group 图像分析
, http://www.100md.com
image assay
组别group
对照control
PE-SWD
A1(um2)
84.45±10.49
39.83±8.74**
A2(um2)
1184.69±10.95
29.31±8.74**
, http://www.100md.com
G1
83.75±2.40
85.61±3.84*
G2
107.20±1.69
106.87±2.68
与对照组比vs control group *P<0.05 **P<0.01
讨 论
Na+-K+-ATPase是细胞膜上的镶嵌蛋白质，属离子泵。表1图像分析结
, http://www.100md.com
果显示，溺水兔肺组织中Na+-K+-ATPase阳性反应面积显著低于正常兔，而
灰度值则显著高于正常兔。阳性反应区域面积表示反应产物总量，阳性反应
区域面积降低表示反应产物总量减少，即酶活性降低；灰度值表示反应产物
的分布密度，灰度值增加表示产物分布密度下降，即酶活性下降。Na+-K+
-ATPase活性下降，则Na+被泵出细胞的效率受影响，Na+在细胞内积聚，引
起细胞水肿，细胞结构受到破坏，进而使Na+-K+-ATPase活性进一步下降。
, 百拇医药
由于Na+梯度参与细胞膜对葡萄糖、氨基酸等物质的摄入，Na+-K+-ATPase
活性下降对细胞的长期后果是引起细胞内能量缺乏和影响蛋白质等有机大分
子的新陈代谢，造成进一步的结构损伤。推测Na+-K+-ATPase活性下降是由
于细胞处于缺氧状态，造成细胞损伤而间接引起。
CYTO是线粒体(mitochondria,MIT)内膜上的镶嵌蛋白质，是MIT电子传递
链的重要环节。表2的图像分析结果显示，溺水后兔肺细胞中CYTO的阳性反应
区域面积下降，灰度值上升，表明溺水后CYTO反应的产物总量下降，产物分
, 百拇医药
布密度降低，即CYTO活性下降。溺水后CYTO活性下降，表明肺细胞中MIT进行
氧化磷酸化、合成ATP的能力下降，作为细胞中各种反应的原动力，ATP缺乏将
对细胞产生广泛而深远的影响：(1)影响Na+-K+-ATPase活性，造成细胞水肿，并引起细胞其它结构的破坏；(2)ATP缺乏引起肾H+分泌障碍，导致代谢性酸
中毒，使呼吸加深加快；(3)抑制表面活性物质(pulmonary surfactant,PS)的合成
与分泌。实验观察到，海水肺灌注后兔气道中有许多气泡，推测这是由于海
水进入气管、支气管和肺后，一些含有亲水及疏水基团的分子(包括蛋白质、PS等)混入液体之故。气泡阻碍空气流通，会产生压力性肺水肿；而PS流失则
, 百拇医药
使肺泡表面液体层表面张力增加，肺泡回缩力增加，导致肺不张。CYTO活性下
降，是由于细胞缺氧，电子传递链不能及时将电子传给O2，以及电子传递链
上的CYTO等蛋白质停滞于还原状态所致[2～8]。
参 考 文 献
1 徐根兴.定量细胞和细胞化学技术.长春：吉林科学技术出版社，1993.77-85.
2 Garg LC,Saha PK,Mohuczy D.Cholinergic inhibition of Na+-K+-ATPase
via activation of protein kinase C in Madin-Darby canine kidney cells.J Am Soc
, http://www.100md.com
Nephrol,1993,4:195-205.
3 Gotloib L,Shoslad A,Wajsbrot V,et al.The cytochemical profile of visceral
mesothelium under the influence of lactated-hyperosmolar peritoneal dialysis
solutions.Nephron,1995,69:466-471.
4 Meyer LH,Wanning C,Michel J,et al.Cellular mechanisms of action of a
ouabain-like factor in vascular smooth-musclc cells.J Cardiovasc Pharmacol,1993,22(Suppl2):S16-19.
, http://www.100md.com
5 徐根兴，董文度，袁驾南,等.海水型呼吸窘迫综合征兔肾皮质酶活性定位和图像
分析.中华航海医学杂志，1994，1：132-135.
6 范少光，汤浩，张衡.人体生理学.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联
合出版社，1996.142-149.
7 王迪浔，金惠铭.病理生理学.北京:人民卫生出版社，1994.516-519.
8 印永嘉，李大珍.物理化学简明教程.北京：高等教育出版社，1984.117-132.
(收稿：1997-07-03 修回：1998-01-26), http://www.100md.com