高压氧对缺血再灌注条件下鼠视网膜细胞膜功能的影响(论著)
作者：周历 张康兰 方以群 陈晓阳 滕燕生
单位：250031 济南军区总医院眼科(周历〈现在解放军第309医院〉、张康兰)；海军医学研究所(方以群)；武警总医院(陈晓阳)；解放军第401医院(滕燕生)
关键词：高压氧；；；视网膜；；再灌注损伤；；Na+-K+-ATP酶；；；膜流动性
高压氧对缺血再灌注条件下鼠视网膜 细胞膜功能的影响
摘要 目的:观察高压氧(HBO)对缺血再灌注视网膜细胞膜功能的影响。方法：
选择35只SD大鼠，随机分为4组：正常组、再灌注组、空气加压组和HBO组。采
用升高眼内压(IOP)致视网膜血管断流造成视网膜缺血模型，然后给予再灌注3
, 百拇医药
小时。其中空气加压组和HBO组于再灌注开始后将动物置于HBO舱内，在252.38 k
Pa(≈2.5 ATA)压力下分别吸空气和纯氧，加压时间为80分钟。再灌注结束后取
眼球制备视网膜细胞膜匀浆液。用定磷法测定视网膜Na+-K+-ATP酶活性，用荧
光探针DPH标记细胞膜并测定其膜流动性。结果：HBO组视网膜细胞膜Na+-K+-ATP
酶活性与正常组比较无显著性差异，而与再灌注组比较有非常显著性差异；HBO
组膜流动性与再灌注组比较有非常显著性差异。结论：HBO对缺血及再灌注所造
成的视网膜细胞功能的损伤具有明显的治疗作用。 Effect of hyperbaric oxygen on membrane function in rat retina
, 百拇医药
after ischemia-reperfusion. Zhou Li,Zhang Kanglan,Fang Yiqun,et al.
Department of Ophthalmology,PLA Jinan Command General Hospital，Jinan 250031
Abstract Aim:To study the effect of hyperbaric oxygen(HBO) on
membrane function in rat retina after ischemia-reperfusion.Methods:
Thirty-five SD rats were randomized into normal,ischemia-reperfusion,hyperbaric air and HBO groups.The intraocular pressoure(IOP) was
, http://www.100md.com
raised to interrupt the retinal blood flow so as to induce the formation
of ischemia model,then reperfusion was given for 3 hours.The hyperbaric
air and HBO groups of rats were treated after the begining of reperfusion
accordingly with hyperbaric air or HBO at 252.38 kPa for 80 min.The
eyeball was taken out right after the completion of reperfusion and
, 百拇医药
ground cell membrane fluid of retina prepared.The colorimetric
phosphorus determination method was used to estimate the
Na+-K+-ATPase activity;and with DPH fluorescence probe
labaling, the membrane fluidity was measured by means of fluorescence
spectrophotometer.Results:The Na+-K+-ATPase activity of HBO group
, 百拇医药
was increased markedly as compared with the ischemia-reperfusion group;
and the membrane fluidity of the former group was significantly lower than
the latter group.Conclusion:HBO has significant beneficial effect on the
functional recovery after impairment of retinal cell membrane induced by
ischemia-reperfusion.
Key words Hyperbaric oxygen Retina Reperfusion injury
, 百拇医药
Na+-K+-ATPase Membrane fluidity
(Chin J Naut Med,1998。5：76)
国内外应用高压氧(HBO)治疗眼缺血性疾病很广泛。但近年来对应用HBO
治疗缺血性疾病出现争议，主因是HBO的缩血管及其增加自由基的作用，对组
织有不利影响。本实验试通过观察HBO对视网膜细胞膜功能的影响，探讨HBO
治疗视网膜缺血性疾病的机理。
材料与方法
1.动物模型及分组：选35只日龄60～70天的Sprague Dawley大鼠，体重
, 百拇医药
240～290 g，随机分为正常组(不缺血)、再灌注组(缺血+再灌注)、空气
加压组(缺血+再灌注+空气加压)和HBO组(缺血+再灌注+HBO)共4个组，每
组8～9只。缺血各组以戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉，按Buchi等[1]
报道方法升高眼内压(IPO)致视网膜血管断流造成视网膜缺血模型。缺血
时间为60分钟，再灌注时间3小时。其中空气加压组和HBO组于再灌注开始
后将动物置于加压舱内，在252.38 kPa(≈2.5 ATA)压力下分别吸空气和纯
氧。加压时间为80分钟，舱内温度22～24 ℃。再灌注结束后处死动物，迅
, 百拇医药
速摘取眼球。
2.指标与测定方法：
(1)视网膜细胞膜匀浆液的制备：将摘取的SD大鼠眼球沿赤道部切开，去除角
膜和晶体，生理盐水冲洗玻璃体，用眼科镊子将视网膜神经层缓慢剥离下来置
于1 ml含50 mmol Tris-HCl(pH7.1)冰浴缓冲液中快速匀浆。取500 μl匀浆液
用上述缓冲液稀释至终浓度为含视网膜组织蛋白1.25 mg/ml作为测定液。
(2)视网膜Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性检测：测活反应溶液终体积
, 百拇医药
500 μl，内含60 mmol NaCl，10 mmol KCl，1.5 mmol MgCl\-2，0.25 mmol
EDTA,1 mmol ATP,50 mmol Tris-HCl(pH 7.4)。取50 μl测定液与未加ATP和
MgCl2的反应液置37 ℃水浴预温10分钟，加入ATP和MgCl2后20分钟取出反应
液，加入55%三氯醋酸100 μl终止反应。冰浴冷却后，加蒸馏水1 ml及定磷
试剂1.5 ml，置45 ℃反应后冷却，在660 nm下测定吸光度A(旧称光密度OD)
值。另外加有0.1 mmol Ouabain的相同反应体系同时进行上述步骤。从磷标准
, 百拇医药
曲线中查出Pi释放量，除以蛋白含量，即得酶的活力值，将含与不含Ouabain
条件下所测ATP酶活力值相减，得Na+-K+-ATPase的活力值，单位为：nmol
Pi*min-1*mg-1 Prot。
(3)膜细胞膜流动性检测：DPH(1，6-二苯基1，3，5-己三烯)探针用四氢呋喃
溶液配成2×10-8mol，按1 μl DPH/mg蛋白加入匀浆液混匀，冰浴下避光
反应30分钟，10 000 r/min离心10分钟，弃上清以去除未标记的萤光探针。使
用日立-850萤光分光光度计加偏振片测定萤光偏振度(P)，机器循环水浴25 ℃，狭距10 mm，激发波长355 nm，发射波长410 nm，偏振度(P)按下列公式计算：
, 百拇医药
P＝(I0/0-G×I0/90)/(I0/0+G×I0/90)
其中 G＝(I90/0)/(I90/90)
式中I0/0，I0/90分别为起偏器光轴垂直放置而检偏器光轴垂直和水平
放置时测得的萤光强度；I90/0，I90/90分别为起偏器光轴水平放置
而检偏器光轴垂直和水平放置时测得的萤光强度。P值越大，膜流动性越小；
P值越小，膜流动性越大。
3.统计学方法：采用组间方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
1.视网膜细胞Na+-K+-ATPase活性的变化：缺血各组Na+-K+-ATPase活性较
正常组均下降，其中单纯再灌注组和高气压组下降较正常组有显著差异；HBO
组与正常组比较无显著差异，而与再灌注组比较有非常显著性差异(见附表)。
2.视网膜细胞膜流动性的变化：从附表中可见缺血各组膜流动性较正常组下降
均有显著性差异。HBO组与正常组比较无显著性差异，而与再灌注组比较有显
著性差异。
附表 视网膜细胞膜Na+-K+-ATP酶活性和膜流动性的变化(
±s)
, http://www.100md.com
Tab. Changes of Na+-K+-ATPase activity and mambrane fluidity in the retina 组 别
group
例数
n
Na+-K+-ATPase
活性activity
荧光偏振度(P)
fluor polar
正常normal
, 百拇医药
8
7.35±1.74
0.256±0.012
再灌注
ischemia-reperfusion
9
4.56±0.43**
0.279±0.008**
空气加压
hyperbaric air
9
, 百拇医药
6.19±1.71*△
0.267±0.007**△
HBO
9
6.86±1.64△△
0.258±0.010△△
与正常组比υs normal group *P<0.05 **P<0.01
与再灌注组比υs ischemia-reperfusion group △P<0.05 △△P<0.01
, 百拇医药
讨 论
细胞膜上的Na+-K+-ATPase是维持细胞内外离子平衡、细胞代谢、膜兴奋
传导以及神经递质释放所必需，在正常生理条件下，Na+-K+-ATPase约消耗细
胞全部能量的50%。视网膜组织完全缺血后，出现ATP耗竭，Na+-K+-ATPase功
能受影响，导致Na、K离子转运障碍，视网膜组织受损。视网膜恢复供血后，再
灌注过程中能产生大量自由基。自由基是一种不稳定的电子基团，它可与细胞
膜上的多聚不饱和脂肪酸反应，引起过氧化损害，导致蛋白磷酸化受抑制，酶
, 百拇医药
活性下降。自由基对膜流动性的影响，还能间接进一步引起酶结构的改变，从
而加大Na+-K+-ATPase活性的降低程度。
HBO能促使组织产生自由基目前已得到公认[2]，由于这一因素，近年来
对应用HBO治疗缺血性疾病颇有争议。本研究中HBO并未使再灌流损伤造成的
Na+-K+-ATPase活性下降和膜流动性下降的情况加重，相反这两项指标均有所
恢复，尤其是在HBO组与正常组统计学比较无显著差异，而与再灌注组比较有显
著性差异。以上说明缺血再灌注条件下，应用HBO并不加重再灌注损伤，其机理
, 百拇医药
据近年报道有以下：Richard等[3]认为，尽管HBO可增加氧自由基的量，但由
于体内的抗氧化物质能够将因HBO作用而产生的其大多数予以清除，因此并不会
影响神经组织的恢复过程。Reitan等[4]认为，内源性抗过氧化物质足以清除
因HBO作用而产生的自由基。据此我们认为，HBO作用所产生的自由基不足以导致
组织损害，而HBO对于恢复供血的组织可通过增加血浆内氧张力来提高细胞的氧
化磷酸化水平，增加细胞能量供应；Sirsjo等[5]亦认为，HBO条件下，有利于
解除血管内皮水肿，且微血管功能得到恢复，使组织有效灌注的毛细血管密度增
, 百拇医药
加，再灌注组织可显著地恢复ATP和CP的供应，改善Na+-K+-ATPase的活性，从
而解除再灌注损伤对组织功能造成的影响。本研究中经HBO治疗后视网膜功能
的恢复进一步证实了上述机理。
参 考 文 献
1 Buchi ER,Suivaizdis I,Fu J.Pressure-induced retinal ischemia in rat:an
experimental model for quantitative study.Ophthalmologica,1991,203:138-147.
, 百拇医药 2 Stewart RJ,Moore T,Bennett B,et al.Effect of free-radical scavengers
and hyperbaric oxygen on random-pattern skin flaps.Arch Surg,1994,129:982-988.
3 Richard BM,Andrew JD.Hyperbaric oxygen after global cerebral
ischemia in rabbits does not promote brain lipid peroxidation.Crit
Care Med,1995,23:1398-1404.
4 Reitan JA,Kien ND,Thorup S,et al.Hyperbaric oxygen increase
, 百拇医药
survival following carotid ligation in gerbils.Stroke,1990,21:119-123.
5 Sirsjo A,Lehr HA,Nolte D,et al.Hyperbaric oxygen treatment enhances
the recovery of blood flow and function capillary density in post-ischmia
striated muscle.Circulatory Shock,1993,40:9-13.
(收稿：1997-04-04 修回：1997-12-19), http://www.100md.com
单位：250031 济南军区总医院眼科(周历〈现在解放军第309医院〉、张康兰)；海军医学研究所(方以群)；武警总医院(陈晓阳)；解放军第401医院(滕燕生)
关键词：高压氧；；；视网膜；；再灌注损伤；；Na+-K+-ATP酶；；；膜流动性
高压氧对缺血再灌注条件下鼠视网膜 细胞膜功能的影响
摘要 目的:观察高压氧(HBO)对缺血再灌注视网膜细胞膜功能的影响。方法：
选择35只SD大鼠，随机分为4组：正常组、再灌注组、空气加压组和HBO组。采
用升高眼内压(IOP)致视网膜血管断流造成视网膜缺血模型，然后给予再灌注3
, 百拇医药
小时。其中空气加压组和HBO组于再灌注开始后将动物置于HBO舱内，在252.38 k
Pa(≈2.5 ATA)压力下分别吸空气和纯氧，加压时间为80分钟。再灌注结束后取
眼球制备视网膜细胞膜匀浆液。用定磷法测定视网膜Na+-K+-ATP酶活性，用荧
光探针DPH标记细胞膜并测定其膜流动性。结果：HBO组视网膜细胞膜Na+-K+-ATP
酶活性与正常组比较无显著性差异，而与再灌注组比较有非常显著性差异；HBO
组膜流动性与再灌注组比较有非常显著性差异。结论：HBO对缺血及再灌注所造
成的视网膜细胞功能的损伤具有明显的治疗作用。 Effect of hyperbaric oxygen on membrane function in rat retina
, 百拇医药
after ischemia-reperfusion. Zhou Li,Zhang Kanglan,Fang Yiqun,et al.
Department of Ophthalmology,PLA Jinan Command General Hospital，Jinan 250031
Abstract Aim:To study the effect of hyperbaric oxygen(HBO) on
membrane function in rat retina after ischemia-reperfusion.Methods:
Thirty-five SD rats were randomized into normal,ischemia-reperfusion,hyperbaric air and HBO groups.The intraocular pressoure(IOP) was
, http://www.100md.com
raised to interrupt the retinal blood flow so as to induce the formation
of ischemia model,then reperfusion was given for 3 hours.The hyperbaric
air and HBO groups of rats were treated after the begining of reperfusion
accordingly with hyperbaric air or HBO at 252.38 kPa for 80 min.The
eyeball was taken out right after the completion of reperfusion and
, 百拇医药
ground cell membrane fluid of retina prepared.The colorimetric
phosphorus determination method was used to estimate the
Na+-K+-ATPase activity;and with DPH fluorescence probe
labaling, the membrane fluidity was measured by means of fluorescence
spectrophotometer.Results:The Na+-K+-ATPase activity of HBO group
, 百拇医药
was increased markedly as compared with the ischemia-reperfusion group;
and the membrane fluidity of the former group was significantly lower than
the latter group.Conclusion:HBO has significant beneficial effect on the
functional recovery after impairment of retinal cell membrane induced by
ischemia-reperfusion.
Key words Hyperbaric oxygen Retina Reperfusion injury
, 百拇医药
Na+-K+-ATPase Membrane fluidity
(Chin J Naut Med,1998。5：76)
国内外应用高压氧(HBO)治疗眼缺血性疾病很广泛。但近年来对应用HBO
治疗缺血性疾病出现争议，主因是HBO的缩血管及其增加自由基的作用，对组
织有不利影响。本实验试通过观察HBO对视网膜细胞膜功能的影响，探讨HBO
治疗视网膜缺血性疾病的机理。
材料与方法
1.动物模型及分组：选35只日龄60～70天的Sprague Dawley大鼠，体重
, 百拇医药
240～290 g，随机分为正常组(不缺血)、再灌注组(缺血+再灌注)、空气
加压组(缺血+再灌注+空气加压)和HBO组(缺血+再灌注+HBO)共4个组，每
组8～9只。缺血各组以戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射麻醉，按Buchi等[1]
报道方法升高眼内压(IPO)致视网膜血管断流造成视网膜缺血模型。缺血
时间为60分钟，再灌注时间3小时。其中空气加压组和HBO组于再灌注开始
后将动物置于加压舱内，在252.38 kPa(≈2.5 ATA)压力下分别吸空气和纯
氧。加压时间为80分钟，舱内温度22～24 ℃。再灌注结束后处死动物，迅
, 百拇医药
速摘取眼球。
2.指标与测定方法：
(1)视网膜细胞膜匀浆液的制备：将摘取的SD大鼠眼球沿赤道部切开，去除角
膜和晶体，生理盐水冲洗玻璃体，用眼科镊子将视网膜神经层缓慢剥离下来置
于1 ml含50 mmol Tris-HCl(pH7.1)冰浴缓冲液中快速匀浆。取500 μl匀浆液
用上述缓冲液稀释至终浓度为含视网膜组织蛋白1.25 mg/ml作为测定液。
(2)视网膜Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)活性检测：测活反应溶液终体积
, 百拇医药
500 μl，内含60 mmol NaCl，10 mmol KCl，1.5 mmol MgCl\-2，0.25 mmol
EDTA,1 mmol ATP,50 mmol Tris-HCl(pH 7.4)。取50 μl测定液与未加ATP和
MgCl2的反应液置37 ℃水浴预温10分钟，加入ATP和MgCl2后20分钟取出反应
液，加入55%三氯醋酸100 μl终止反应。冰浴冷却后，加蒸馏水1 ml及定磷
试剂1.5 ml，置45 ℃反应后冷却，在660 nm下测定吸光度A(旧称光密度OD)
值。另外加有0.1 mmol Ouabain的相同反应体系同时进行上述步骤。从磷标准
, 百拇医药
曲线中查出Pi释放量，除以蛋白含量，即得酶的活力值，将含与不含Ouabain
条件下所测ATP酶活力值相减，得Na+-K+-ATPase的活力值，单位为：nmol
Pi*min-1*mg-1 Prot。
(3)膜细胞膜流动性检测：DPH(1，6-二苯基1，3，5-己三烯)探针用四氢呋喃
溶液配成2×10-8mol，按1 μl DPH/mg蛋白加入匀浆液混匀，冰浴下避光
反应30分钟，10 000 r/min离心10分钟，弃上清以去除未标记的萤光探针。使
用日立-850萤光分光光度计加偏振片测定萤光偏振度(P)，机器循环水浴25 ℃，狭距10 mm，激发波长355 nm，发射波长410 nm，偏振度(P)按下列公式计算：
, 百拇医药
P＝(I0/0-G×I0/90)/(I0/0+G×I0/90)
其中 G＝(I90/0)/(I90/90)
式中I0/0，I0/90分别为起偏器光轴垂直放置而检偏器光轴垂直和水平
放置时测得的萤光强度；I90/0，I90/90分别为起偏器光轴水平放置
而检偏器光轴垂直和水平放置时测得的萤光强度。P值越大，膜流动性越小；
P值越小，膜流动性越大。
3.统计学方法：采用组间方差分析。
, http://www.100md.com
结 果
1.视网膜细胞Na+-K+-ATPase活性的变化：缺血各组Na+-K+-ATPase活性较
正常组均下降，其中单纯再灌注组和高气压组下降较正常组有显著差异；HBO
组与正常组比较无显著差异，而与再灌注组比较有非常显著性差异(见附表)。
2.视网膜细胞膜流动性的变化：从附表中可见缺血各组膜流动性较正常组下降
均有显著性差异。HBO组与正常组比较无显著性差异，而与再灌注组比较有显
著性差异。
附表 视网膜细胞膜Na+-K+-ATP酶活性和膜流动性的变化(
±s), http://www.100md.com
Tab. Changes of Na+-K+-ATPase activity and mambrane fluidity in the retina 组 别
group
例数
n
Na+-K+-ATPase
活性activity
荧光偏振度(P)
fluor polar
正常normal
, 百拇医药
8
7.35±1.74
0.256±0.012
再灌注
ischemia-reperfusion
9
4.56±0.43**
0.279±0.008**
空气加压
hyperbaric air
9
, 百拇医药
6.19±1.71*△
0.267±0.007**△
HBO
9
6.86±1.64△△
0.258±0.010△△
与正常组比υs normal group *P<0.05 **P<0.01
与再灌注组比υs ischemia-reperfusion group △P<0.05 △△P<0.01
, 百拇医药
讨 论
细胞膜上的Na+-K+-ATPase是维持细胞内外离子平衡、细胞代谢、膜兴奋
传导以及神经递质释放所必需，在正常生理条件下，Na+-K+-ATPase约消耗细
胞全部能量的50%。视网膜组织完全缺血后，出现ATP耗竭，Na+-K+-ATPase功
能受影响，导致Na、K离子转运障碍，视网膜组织受损。视网膜恢复供血后，再
灌注过程中能产生大量自由基。自由基是一种不稳定的电子基团，它可与细胞
膜上的多聚不饱和脂肪酸反应，引起过氧化损害，导致蛋白磷酸化受抑制，酶
, 百拇医药
活性下降。自由基对膜流动性的影响，还能间接进一步引起酶结构的改变，从
而加大Na+-K+-ATPase活性的降低程度。
HBO能促使组织产生自由基目前已得到公认[2]，由于这一因素，近年来
对应用HBO治疗缺血性疾病颇有争议。本研究中HBO并未使再灌流损伤造成的
Na+-K+-ATPase活性下降和膜流动性下降的情况加重，相反这两项指标均有所
恢复，尤其是在HBO组与正常组统计学比较无显著差异，而与再灌注组比较有显
著性差异。以上说明缺血再灌注条件下，应用HBO并不加重再灌注损伤，其机理
, 百拇医药
据近年报道有以下：Richard等[3]认为，尽管HBO可增加氧自由基的量，但由
于体内的抗氧化物质能够将因HBO作用而产生的其大多数予以清除，因此并不会
影响神经组织的恢复过程。Reitan等[4]认为，内源性抗过氧化物质足以清除
因HBO作用而产生的自由基。据此我们认为，HBO作用所产生的自由基不足以导致
组织损害，而HBO对于恢复供血的组织可通过增加血浆内氧张力来提高细胞的氧
化磷酸化水平，增加细胞能量供应；Sirsjo等[5]亦认为，HBO条件下，有利于
解除血管内皮水肿，且微血管功能得到恢复，使组织有效灌注的毛细血管密度增
, 百拇医药
加，再灌注组织可显著地恢复ATP和CP的供应，改善Na+-K+-ATPase的活性，从
而解除再灌注损伤对组织功能造成的影响。本研究中经HBO治疗后视网膜功能
的恢复进一步证实了上述机理。
参 考 文 献
1 Buchi ER,Suivaizdis I,Fu J.Pressure-induced retinal ischemia in rat:an
experimental model for quantitative study.Ophthalmologica,1991,203:138-147.
, 百拇医药 2 Stewart RJ,Moore T,Bennett B,et al.Effect of free-radical scavengers
and hyperbaric oxygen on random-pattern skin flaps.Arch Surg,1994,129:982-988.
3 Richard BM,Andrew JD.Hyperbaric oxygen after global cerebral
ischemia in rabbits does not promote brain lipid peroxidation.Crit
Care Med,1995,23:1398-1404.
4 Reitan JA,Kien ND,Thorup S,et al.Hyperbaric oxygen increase
, 百拇医药
survival following carotid ligation in gerbils.Stroke,1990,21:119-123.
5 Sirsjo A,Lehr HA,Nolte D,et al.Hyperbaric oxygen treatment enhances
the recovery of blood flow and function capillary density in post-ischmia
striated muscle.Circulatory Shock,1993,40:9-13.
(收稿：1997-04-04 修回：1997-12-19), http://www.100md.com