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编号:10261226
急性缺氧对脑损伤大鼠脑皮层代谢型谷氨酸受体1α表达的影响
http://www.100md.com 《中华航空航天医学杂志》 2000年第4期
     作者:李侠 章翔 费舟 何远东 马瑞山 秦云 梁景文

    单位:李侠 章翔 费舟 何远东 梁景文(710032 西安,第四军医大学西京医院全军神经外科研究所);马瑞山(航空航天医学系航空生理教研室);秦云(航空航天医学系航空生理教研室)

    关键词:急性缺氧;代谢型谷氨酸受体;脑损伤

    中华航空航天医学杂志000409 【摘要】 目的 观察急性中度缺氧对脑损伤大鼠脑皮层代谢型谷氨酸受体1α (metabotropic glutamate receptor 1α, mGluR1α)表达的影响,探讨缺氧诱导二次脑损伤的致伤机理。 方法 90只雄性SD大鼠随机分为对照组,损伤组(改良Marmarou脑损伤模型)、缺氧(4 000 m 高度)10 min组、缺氧30 min组、损伤后缺氧10 min组、损伤后缺氧30 min组等6组,各组在相应处理后4 h取标本,行免疫组化、HE染色及电镜检测。光镜下计数每高倍视野中损伤神经元及mGluR1α阳性神经元的数目,并对实验结果进行析因设计的方差分析。 结果 10 min和30 min缺氧对正常鼠脑皮层的显微、超微结构及mGluR1α表达无明显影响(P>0.05);10 min缺氧也未导致脑损伤大鼠脑皮层显微、超微结构及mGluR1α表达明显改变(P>0.05);而30 min缺氧可诱导脑损伤大鼠脑皮层显微及超微结构明显改变,mGluR1α表达明显增高(P<0.01)。 结论 30 min急性中度缺氧可加剧脑损伤大鼠脑皮层神经元损伤,同时诱导mGluR1α高表达,提示mGluR1α可能参与了缺氧诱导的二次脑损伤过程。
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    【中国图书资料分类法分类号】 R852.11

    Effects of acute hypoxia on the expression of metabotropic glutamate receptor 1α in the brain cortex of rats with brain injury

    LI Xia,ZHANG Xiang,FEI Zhou

    (Institute of Neurosurgery of PLA in Xi-Jing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, China)

    【Abstract】 Objective To detect the effects of acute moderately hypoxia on the expression of metabotropic glutamate receptor 1α in the brain cortex of rats with brain injury and to explore the traumagenic mechanism of secondary insult of hypoxia following the brain injury. Methods Ninety male SD rats were randomly separated into 6 groups(n=15): control group, traumatic group(modified Marmarou model group), hypoxia for 10 min group, hypoxia for 30min group, hypoxia for 10 min following traumatic brain injury group and hypoxia for 30 min following traumatic brain injury group. Four hours after different treatments were performed, brain specimens of each group of rats were obtained for immunohistochemistry staining, HE staining and electron microscopy detection. Damaged neurons and positive mGluR1α neurons in each high-powered field were counted. The data of different groups were treated with factorial analysis and variance analysis. Results As compared with control group, the hypoxia for 10 min or 30 min had no evident effects on the microscopic structure, ultrastructure and the number of positive mGluR1α neurons of normal rats cortex (P>0.05);As compared with traumatic group, hypoxia for 10 min following brain injury also had no obvious effects on the microscopic structure, ultrastructure and the number of positive mGluR1α neurons in the cortex of rats (P>0.05); while hypoxia for 30 min following brain injury induced evident changes of microscopic structure and ultrastructure of brain cortex, and the number of positive mGluR1α neurons were significantly increased (P<0.01). Conclusion Moderate acute hypoxia for 30 min following the brain injury may exacerbate the primary neuronal damage, and increase the number of positive mGluR1α neurons, which imply that mGluR1α is involved in the traumagenic process induced by secondary hypoxia.
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    【Key words】 Acute hypoxia; Metabotropic glutamate receptor 1α; Brain injury 颅脑损伤后继发气道阻塞、呼吸抑制及肺水肿等在临床较为常见,均可能诱导缺氧性二次脑损伤,因此防护和治疗继发性缺氧对于颅脑损伤的治疗具有重要意义[1]。已有研究报道颅脑损伤患者预后与继发性脑缺氧的程度及时间明显相关[2]。Barzo等[3]证实脑损伤继发缺氧可加剧皮层神经元的病理损害,但其机理尚未阐明。研究表明脑损伤时谷氨酸(Glu)的堆积可产生明显的神经毒性作用[4]。我们在以往研究中也发现脑损伤后海马CA1区谷氨酸水平明显升高[5]。Glu通过离子型受体(iGluR)及代谢型受体(metabotropic glutamate receptor, mGluR)作用于神经元,诱导其病理损伤过程。以往研究中对iGluR关注较多,而对新近发现的mGluR报道较少,尤其关于缺氧诱导二次脑损伤与mGluR表达改变的相关性研究尚未见报道。mGluR1α是mGluR的亚型之一,本研究旨在探讨缺氧性二次脑损伤中mGluR1α表达的变化规律,以期阐明mGluR1α在该损伤过程中的作用机理,进而寻找治疗和预防缺氧性二次脑损伤的有效方法。
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    材料和方法

    一、实验动物分组

    雄性SD大鼠90只,体重250~300 g(本校实验动物中心),利用随机数字法将实验动物分成6 组:①对照组(C);②损伤组(T);③缺氧10 min组(H-10);④缺氧30 min组(H-30);⑤损伤后缺氧10 min组(TH-10);⑥损伤后缺氧30 min组(TH-30)。每组15只大鼠。

    二、改良Marmarou脑损伤模型制作[6]

    大鼠称重,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40 mg/kg),固定于立体定向头架,正中切开大鼠顶部皮肤,固定一金属垫片(直径8 mm,厚2 mm)于顶骨上。900 g铜棒自1 m高处自由落于金属圆盘上,即刻移开大鼠以免造成二次击伤。

    三、急性缺氧模型制作
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    H-10和H-30组大鼠放入动物低压舱(本校航空航天医学系航空生理教研室)内模拟上升到4 000 m高度,速度35 m/s,暴露时间分别为10 min和30 min;TH-10和TH-30组大鼠制作改良Marmarou脑损伤模型后立即放入动物低压舱内模拟上升到4 000 m高度,速度35 m/s,暴露时间为10 min和30 min。

    四、免疫组化染色

    利用随机数字法于各组中取10只于相应实验处理后4 h取脑。戊巴比妥钠腹腔麻醉,4%多聚甲醛饱和苦味酸液(pH7.3)灌注固定2 h。在前囟至前囟后8 mm区域内取脑,置于30%蔗糖溶液内,4℃过夜。作冠状位连续冰冻切片(厚30 μm),隔8取1,收集于PBS内。置于兔抗大鼠mGluR1α(美国基因公司)血清中(1∶1 000),4℃孵育72 h。滴加生物素化羊抗兔血清(中国武汉博士德公司),工作浓度为(1∶100),37℃反应3 h,滴加SABC复合物,37℃反应1 h,DAB显色。酒精脱水,透明,封片。
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    五、HE染色

    随机数字法于每组中取3只大鼠,相应处理后4 h以4%多聚甲醛灌注固定、取脑、后固定、脱水、透明、石蜡包埋并制成6 μm厚的切片,进行HE染色。

    六、电镜检测

    每组剩余的2只大鼠,相应处理后4 h以2%戊二醛灌注固定。取室上皮层区体积1 mm×1 mm×1 mm组织小块,丙酮逐级脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,透射电镜下观察超微结构。

    七、损伤神经元及mGluR1α阳性神经元计数

    每张切片的室上皮层区各选1个0.567 mm×1.134 mm的区域,每个区域的面积为0.643 mm2,在该选定区域内随机选取10个高倍视野计数损伤及mGluR1α阳性神经元,以均数±标准差表示神经元数目。
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    八、统计学分析

    利用SPLM统计软件进行析因设计的方差分析。

    结果

    一、免疫组化染色结果

    T、TH-10、TH-30组中可见弥漫性分布的mGluR1α 阳性神经元,主要分布于大脑皮层Ⅰ~Ⅲ层,棕黄色颗粒位于胞浆、胞膜(图1,见封2),与对照组比较阳性神经元数目显著增高,其中T、TH-10组间阳性神经元数目差异无显著性意义(P>0.05),TH-30组较T组有显著增加(P<0.01);C、H-10、H-30组中可发现少量的阳性神经元,组间差异无显著性意义(P>0.05)(表1)。

    二、HE染色结果

    与对照组比较,T、TH-10、TH-30组均可见弥漫的神经元变性和坏死,表现为胞体皱缩、空泡形
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    表1 各组大鼠室上皮层区损伤神经元及mGluR1α阳性神经元计数

    Tab 1 Number of damaged neurons and positive mGluR1α neurons observed in various groups of rats

    损伤神经元(HE×100)

    Damaged neurons(HE×100)

    mGluR1α阳性神经元(×4 00)

    Positive mGluR1α neurons(×4 00)

    无损伤

    No brain trauma
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    脑损伤

    Brain trauma

    无损伤

    No brain trauma

    脑损伤

    Brain trauma

    无缺氧

    No hypoxia

    0.56±0.32(C)

    17.61±6.08**(T)

    3.23±0.78(C)
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    8.54±2.71**(T)

    缺氧10 min

    Hypoxia for 10 min

    0.67±0.30(H-10)

    17.50±7.15**(TH-10)

    3.45±0.85(H-10)

    8.31±3.01**(TH-10)

    缺氧30 min

    Hypoxia for 30 min

    0.72±0.29(H-30)
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    30.50±11.09**△△(TH-30)

    3.67±0.65(H-30)

    20.76±9.29**△△(TH-30)

    经过析因分析显示创伤和缺氧两因素之间无交互效应,故进行组间均数的两两比较,T、TH-10和TH-30组较对照组有显著性差异,**P<0.01;H-10和H-30组与对照组无显著差异,P>0.05;TH-30组较T组有显著差异,△△P<0.01;而TH-10组与T组无显著差异,P>0.05成、核固缩、胞浆不规则分布,胞膜外周及小血管外水肿形成(图2,见封2),其中T组和TH-10组间的神经元损伤程度相近似,较TH-30组明显要轻(P<0.01);C、H-10和H-30组间光镜下结构无明显差异(表1)。

    三、电镜结果
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    透射电镜下,T组和TH-10组出现小血管周围水肿,神经元膜性结构轻度变形,胞核及胞质染色质呈浓缩状并有边集现象,线粒体肿胀,内质网扩张;TH-30组可见线粒体肿胀,嵴减少、消失、空泡样变,高尔基器融合,细胞器数目减少,轴突髓壳崩解,核固缩等(图3,见封2)。讨论

    诱发脑缺氧的原因有多种,不同程度及不同时间的缺氧会导致脑组织不同的生理和病理改变,刘俊英等[7]发现持续30 min的急性重度缺氧(高于8 000 m)会造成大鼠脑顶叶皮质明显的超微病理变化。颅脑损伤后经常继发缺氧,且正常情况下难以致伤的缺氧也可能加重原发伤,其机理目前尚不清楚[8]。谷氨酸(Glu)是哺乳类动物神经元的重要递质,已有研究证实机械性和缺血性脑损伤模型中, Glu过度释放或重吸收障碍导致其在细胞外堆积,可产生神经毒性作用[4]。Glu通过作用于Glu受体引起细胞内钙超载,从而诱导神经元损害。Glu 受体主要分为iGluR及mGluR,iGluR的激活可引起自身Ca2+通道的开放,而mGluR的活化和高表达可诱导第二信使PI等水解并促使细胞内Ca2+释放,这两条受体后通路均可形成细胞内钙超载,并进而启动神经元的病理损伤[9]。有研究表明采用iGluR拮抗剂治疗实验性脑损伤及脑缺血,未获得满意疗效[10],而利用mGluR的拮抗剂MCPG却可有效保护缺血的海马神经元[11],这或许提示mGluR在神经元损害中起更加重要的作用。
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    本实验在改良Marmarou弥漫性脑损伤模型基础上,经受急性中度缺氧10 min或30 min,较好地模拟了临床的情况。实验中以室上皮层区为神经元计数区域,是因为Marmarou模型中该区域的神经元损伤较重且表现较早。研究表明与单独脑损伤组比较,TH-30组的皮层mGluR1α阳性神经元数明显增加且病理损害明显加重,证实持续30 min的急性中度缺氧可致明显的二次脑损伤,同时伴有mGluR1α的表达增高,提示mGluR1α是缺氧诱导二次脑损伤中的重要环节。但是其他多种致伤因子,如一氧化氮、自由基等也可能参与了缺氧诱导的二次脑损伤,还需进一步实验证实。本研究提示mGluR1α参与了缺氧诱导的二次脑损伤,这为探索有效预防和治疗缺氧性二次脑损伤的方法提供了实验依据。

    基金项目:全军“九五”医学科研规划基金资助项目(98M101)

    参考文献

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    3,Barzo P, Marmarou A, Fatouros P, et al. Magnetic resonance imaging-monitored acute blood-brain barrier changes in experimental traumatic brain injury. J Neurosurg, 1996,85(6):1113-1121.

    4,Pin JP, Duvoisin R. Review: neurotransmitter receptor I——the metabotropic glutamate receptors: structure and functions. Neuropharmacology,1995,34(1):1-26.
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    5,费舟,章翔,易声禹,等.弥漫性脑损伤后低血压及高热对鼠脑海马细胞外液兴奋性氨基酸代谢的影响.陕西医学杂志, 1997,26(5):701-705.

    6,Foda MA, Marmarou A. A new model of diffuse brain injury in rats. J Neurosurg, 1994,80(2):301-313.

    7,刘俊英, 李德忠, 张经伦. 不同高度急性低压缺氧时大鼠大脑顶叶皮质的超微病理变化.中华航空航天医学杂志,1998,9(1):41-43.

    8,Ishige N, Pitts LH, Berry I, et al. The effect of hypoxia on traumatic head injury in rats: alternations in neurological function, brain edema, and cerebral blood flow. J Cereb Blood Flow Metab,1987, 7(6):759-767.
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    9,Buisson A, Choi DW. The inhibitory mGluR agonist S-4-carboxy-3-hydroxy phenylglycine selectively attenuates NMDA neurotoxicity and oxygen-glucose deprivation-induced neuronal death. Neuropharmacology, 1995,34(8):1081-1087.

    10,Nicoletti F, Bruno V, Copani A , et al. Metabotropic glutamate receptors: a new target for the therapy of neurodegenerative disorders. Trends Neurosci, 1996,19(7):267-271.

    11,Opitz T, Richter P, Reymann KG. The metabotropic glutamate receptor antagonist (α-methyl-4-carboxyphenylglycine) protects hippocampal CA1 neurons of the rat from in vitro hypoxia/hypoglycemia. Neuropharmacology ,1994,33(55):715-717.

    [收稿日期:2000-05-25], 百拇医药