氯醚避孕针对小鼠显性致死突变的研究
作者：黄芒莉 吴亦帆
单位：湖北省药品检验所 武汉430064
关键词：氯醚避孕针；显性致死突变；小鼠；显性致死突变指数；负二项分布
数理医药学杂志990220
摘要 用昆明种小鼠对氯醚避孕针进行显性致死突变的研究。实验结果表明，用显性致死突变指数分析与用负二项分布分析，氯醚避孕针均无显性致死突变作用。
致突变物可以引起哺乳动物双亲中某一方面的配子的基因组发生变化。配子基因组的这种变化，不是表现为基因某个特定部位所发生的变化，而是几乎到处都能发生的染色体畸变，因此，往往不能再与异性生殖细胞结合或者结合后会出现胚胎的早期吸收或胚胎死亡。显性致死突变试验就是根据这个原理来检验受试物是否具有致突变性。由于这种方法是在实验动物体内进行的，所以能较全面的反映受试物的致突变性[1]。
, 百拇医药
氯醚避孕针是由氯地孕酮和醋炔醚两种孕激素组成的一种长效注射避孕药，经临床使用效果良好。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠，雌鼠为处女鼠，体重25～28g，雄鼠体重25～30g。由湖北省医学实验动物中心提供。
1.2 饲料 全价普鼠颗粒饲料，由湖北省医学实验动物中心饲料厂提供。
1.3 实验动物管理 每个标准塑料饲育盒饲养1对小鼠，小鼠食全价颗粒饲料，饮水为自来水，饮水与饲料均不限量。室温为25±3℃，湿度为60%，采用12：12h明暗光照，自然通风。每周更换二次垫底木屑，每周消毒1次饲育盒与清洗1次给水瓶。
1.4 药品 氯醚避孕针，由武汉健民制药厂提供。
1.5 方法 取昆明种雄性小鼠80只，随机分组，每组20只。实验组分为高剂量组(醋炔醚7.5mg*kg-1氯地孕酮2.5mg*kg-1)，中剂量组(醋炔醚3.75mg*kg-1氯地孕酮1.25mg*kg-1)，低剂量组(醋炔醚1.87mg*kg-1氯地孕酮1.25mg*kg-1)，并设生理盐水对照组。经腹腔注射氯醚避孕针，连续注射10天，停药。在停药后第1周，第2周，第3周，第4周，第5周，第6周与正常雌鼠(处女鼠)交配，七天后，雌鼠与雄鼠分开饲养。在交配后翌日，检查阴道栓，以确定受孕时间，受孕后第13～15天剖检孕鼠，统计子宫内的活胎数、死胎数(包括早期吸收胎)和总着床数。
, 百拇医药
对照组以上述同样方式进行交配，作为平行对照。
2 结果与分析
2.1 用显性致死突变指数分析[2，3]
把各组胚胎死亡数、总着床数按下列公式进行计算：
显性致死突变指数=(胚胎死亡数+早期胚胎吸收数)/(总着床数)×100
实验结果见表1。
表1 氯醚避孕针对小鼠显性致死突变指数的影响 组
别
交
配
, 百拇医药
次
序
动物数
活胎数
胚
胎
死
亡
数
总
着
床
数
显突
, http://www.100md.com
性变
致指
死数
P值
高
剂
量
组
1
20
132
13
145
8.97
, 百拇医药
>0.05
2
20
89
11
100
11.00
3
20
111
19
130
14.62
, 百拇医药 4
20
101
4
105
3.81
5
20
69
6
75
8.00
6
20
, 百拇医药
42
1
43
2.33
低
剂
量
组
1
20
148
15
163
9.20
, 百拇医药
>0.05
2
20
109
9
118
7.63
3
20
104
7
111
6.31
, 百拇医药 4
20
106
7
113
6.19
5
20
94
7
101
6.93
6
20
, 百拇医药
38
8
106
7.55
中
剂
量
组
1
20
150
19
169
11.24
, http://www.100md.com
>0.05
2
20
124
11
135
8.25
3
20
96
3
99
3.03
, http://www.100md.com 4
20
133
11
144
7.64
5
20
63
5
68
7.35
6
20
, 百拇医药
54
1
55
1.82
生
理
盐
水
对
照
组
1
20
93
, 百拇医药
7
100
7.00
2
20
97
12
109
11.01
3
20
139
10
149
, 百拇医药
6.71
4
20
89
4
93
4.30
5
20
71
2
73
2.74
6
, 百拇医药
20
71
2
73
2.74
实验结果表明，氯醚避孕针各剂量组与生理盐水对照组的显性致死突变指数分别在2.33～14.62%，6.19～9.20%，1.82～11.24%和2.74～11.01%范围内变动。经统计学处理，氯醚避孕针各剂量组与生理盐水组比较均无显著性差异(P>0.05)。故氯醚避孕针无明显的显性致死突变作用。
2.2 用负二项分布分析[4]
在同一显性致死突变试验中，每只实验小鼠的胚胎死亡数均不相同，而被认为是与分布的随机变量，在总体内发生不定形的胚胎死亡分布，胚胎死亡数的频数大多数集合在频数分布表的上侧(正偏倚)，且方差大于均数，那么负二项分布是最优配合式。用矩法求出K值，然后用负二项分布式配合理论频数，并用χ2检验测定其适合度。实验结果见表2。表2 小鼠胚胎死亡理论频数与观察频数比较 胚胎
, 百拇医药
死亡数
观 察 频 数
理论频数(矩法)
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
0
32
, http://www.100md.com
44
33
41
31.44
44.12
32.68
41.56
1
18
20
26
16
19.60
, http://www.100md.com
18.93
27.16
13.75
2
9
6
10
3
7.68
7.43
8.49
5.22
3
, 百拇医药
2
2
1
2
2.41
2.83
1.19
2.06
4
1
3
1
0.65
1.08
, http://www.100md.com
0.83
5
1
0.34
适合度检验χ2
0.63
3.99
1.04
2.63
自由度
2
2
1
, 百拇医药
3
P
>0.70
>0.10
>0.30
>0.30
从表2中可见，用负二项分布式配合的理论频数与观察频数的差别无显著性差异，所以用负二项分布是适当的。
在进行各实验组的毒性比较时， 经常发现同一实验的各种结果，用负二项分布式配合理论频数时，有相似的参数K值，分布的平均数是反映毒性影响的最好测量值，故可先估计一个共同的Kc值。
i和S2i是第i个组样本均数和方差，用最小二乘法从i2对S2i-i的回归分析中估计共同Kc值。
(1)
, 百拇医药
得出共同Kc值后，进行方差稳定性转换，并用一般参数的检验假定来测定其处理效果，把Xi转换为Yi的公式为
Yi=1n(Xi+1/2Kc) (2)
两组比较用t检验，两组以上比较用方差分析。
下面用频数计算法进行分析，具体计算步骤如下：
① 按表2中的观察频数fi及胚胎死亡数Xi分别计算以下数值(见表3);
② 按公式(1)计算共同Kc值;
③ 按公式(2)把Xi转换为Yi(见表4);
④ 进行方差分析，计算平方和、均方及F值，结果见表5。
, 百拇医药 表3 i Si2 Ki记录表
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
∑fi
62
75
70
64
∑fiXi
46
50
, http://www.100md.com
49
37
∑fii
88
110
75
87
i
0.7419
0.6667
0.70
0.5781
Si2
, http://www.100md.com
0.8831
1.0360
0.5899
1.0414
i2
0.5504
0.4445
0.49
0.3342
Si2-i
0.1412
0.3693
, 百拇医药
-0.1101
0.4633
Ki
3.8980
1.2036
-4.4504
0.7213
表4 转换计算结果 胚胎死亡数
Xi
Yi=1n(Xi+0.4475)
观 察 频 数(fi)
合计
, http://www.100md.com
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
0
-0.8041
32
44
33
41
1
0.3698
18
, http://www.100md.com
20
26
16
2
0.8951
9
6
10
3
3
1.2376
2
2
1
, 百拇医药
2
4
1.4923
1
3
1
5
1.6952
1
∑fi
62
75
70
64
, http://www.100md.com
271
∑fiyi
35.6504
41.2819
34.4363
39.2652
150.6338
∑fiyi2
-7.0514
-15.6653
-6.7310
-18.7033
, 百拇医药
-48.1510
表5 方差分析 变异来源
平方和
自由度
均 方
F
P
总变异
142.0784
271
组间变异
1.6316
3
, 百拇医药
0.5439
1.0380
>0.05
组内变异
140.4468
268
0.5240
根据计算结果，F=1.3080,P>0.05,可认为各组之间的胚胎死亡水平无显著性差异。从负二项分布计算结果来看，进一步表明氯醚避孕针无明显的显性致死突变作用。
3 讨论
显性致死突变试验给药方法有：①急性试验：按被检物LD50的1/5量，一次经口或非经口给与雄性小鼠；②亚急性试验：被检物的给与量与急性试验相同，但这个量是在5天中连续给与雄性小鼠；③慢性试验：以被检物中最大允许量，至少在3个月间连续经口给予与雄鼠。本试验雄性小鼠腹腔注射连续给药10天，相当于亚急性试验。
, 百拇医药
从致死突变指数和负二项分布法统计分析来看，虽然两者分析结果一致，但其意义却不同。致死突变指数是以总着床数为基础的分析方法，总着床数的多少对致死突变指数的高低有相当影响，而总着床数又与非遗传因素有关，如母鼠受到感染后，也能影响总着床数，故用显性致死突变指数来分析被检物有无致死突变作用是有一定的局限性。
同时，显性致死突变的主要观察指标是胚胎死亡，如果把胚胎死亡数的频数编制分布图，往往呈极偏态分布。仅用一般统计计算就不能合理地进行分析比较，只有采用适当的统计模型，才能正确的反映出被检物对显性致死突变作用的影响有无显著性差异。实验结果表明，胚胎死亡的频数大多数集合在频分布表的上侧(正偏倚)，且方差大于均数，故本试验采用负二项分布分析，能较客观的反映氯醚避孕针对显性致死突变作用的影响。
参考文献
1 Schelner, CA. Toxicology and Applied Pharma cology, 1997; (3):487.
2 刘明哲等.遗传学报，1978；5(4)：330.
3 吴亦帆等.药物分析杂志，1982，2(3).
4 Eric Williammn et al. Table of the Negative Binomial Probability Distribuion, 1963.
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药
单位：湖北省药品检验所 武汉430064
关键词：氯醚避孕针；显性致死突变；小鼠；显性致死突变指数；负二项分布
数理医药学杂志990220
摘要 用昆明种小鼠对氯醚避孕针进行显性致死突变的研究。实验结果表明，用显性致死突变指数分析与用负二项分布分析，氯醚避孕针均无显性致死突变作用。
致突变物可以引起哺乳动物双亲中某一方面的配子的基因组发生变化。配子基因组的这种变化，不是表现为基因某个特定部位所发生的变化，而是几乎到处都能发生的染色体畸变，因此，往往不能再与异性生殖细胞结合或者结合后会出现胚胎的早期吸收或胚胎死亡。显性致死突变试验就是根据这个原理来检验受试物是否具有致突变性。由于这种方法是在实验动物体内进行的，所以能较全面的反映受试物的致突变性[1]。
, 百拇医药
氯醚避孕针是由氯地孕酮和醋炔醚两种孕激素组成的一种长效注射避孕药，经临床使用效果良好。
1 材料与方法
1.1 实验动物 昆明种小鼠，雌鼠为处女鼠，体重25～28g，雄鼠体重25～30g。由湖北省医学实验动物中心提供。
1.2 饲料 全价普鼠颗粒饲料，由湖北省医学实验动物中心饲料厂提供。
1.3 实验动物管理 每个标准塑料饲育盒饲养1对小鼠，小鼠食全价颗粒饲料，饮水为自来水，饮水与饲料均不限量。室温为25±3℃，湿度为60%，采用12：12h明暗光照，自然通风。每周更换二次垫底木屑，每周消毒1次饲育盒与清洗1次给水瓶。
1.4 药品 氯醚避孕针，由武汉健民制药厂提供。
1.5 方法 取昆明种雄性小鼠80只，随机分组，每组20只。实验组分为高剂量组(醋炔醚7.5mg*kg-1氯地孕酮2.5mg*kg-1)，中剂量组(醋炔醚3.75mg*kg-1氯地孕酮1.25mg*kg-1)，低剂量组(醋炔醚1.87mg*kg-1氯地孕酮1.25mg*kg-1)，并设生理盐水对照组。经腹腔注射氯醚避孕针，连续注射10天，停药。在停药后第1周，第2周，第3周，第4周，第5周，第6周与正常雌鼠(处女鼠)交配，七天后，雌鼠与雄鼠分开饲养。在交配后翌日，检查阴道栓，以确定受孕时间，受孕后第13～15天剖检孕鼠，统计子宫内的活胎数、死胎数(包括早期吸收胎)和总着床数。
, 百拇医药
对照组以上述同样方式进行交配，作为平行对照。
2 结果与分析
2.1 用显性致死突变指数分析[2，3]
把各组胚胎死亡数、总着床数按下列公式进行计算：
显性致死突变指数=(胚胎死亡数+早期胚胎吸收数)/(总着床数)×100
实验结果见表1。
表1 氯醚避孕针对小鼠显性致死突变指数的影响 组
别
交
配
, 百拇医药
次
序
动物数
活胎数
胚
胎
死
亡
数
总
着
床
数
显突
, http://www.100md.com
性变
致指
死数
P值
高
剂
量
组
1
20
132
13
145
8.97
, 百拇医药
>0.05
2
20
89
11
100
11.00
3
20
111
19
130
14.62
, 百拇医药 4
20
101
4
105
3.81
5
20
69
6
75
8.00
6
20
, 百拇医药
42
1
43
2.33
低
剂
量
组
1
20
148
15
163
9.20
, 百拇医药
>0.05
2
20
109
9
118
7.63
3
20
104
7
111
6.31
, 百拇医药 4
20
106
7
113
6.19
5
20
94
7
101
6.93
6
20
, 百拇医药
38
8
106
7.55
中
剂
量
组
1
20
150
19
169
11.24
, http://www.100md.com
>0.05
2
20
124
11
135
8.25
3
20
96
3
99
3.03
, http://www.100md.com 4
20
133
11
144
7.64
5
20
63
5
68
7.35
6
20
, 百拇医药
54
1
55
1.82
生
理
盐
水
对
照
组
1
20
93
, 百拇医药
7
100
7.00
2
20
97
12
109
11.01
3
20
139
10
149
, 百拇医药
6.71
4
20
89
4
93
4.30
5
20
71
2
73
2.74
6
, 百拇医药
20
71
2
73
2.74
实验结果表明，氯醚避孕针各剂量组与生理盐水对照组的显性致死突变指数分别在2.33～14.62%，6.19～9.20%，1.82～11.24%和2.74～11.01%范围内变动。经统计学处理，氯醚避孕针各剂量组与生理盐水组比较均无显著性差异(P>0.05)。故氯醚避孕针无明显的显性致死突变作用。
2.2 用负二项分布分析[4]
在同一显性致死突变试验中，每只实验小鼠的胚胎死亡数均不相同，而被认为是与分布的随机变量，在总体内发生不定形的胚胎死亡分布，胚胎死亡数的频数大多数集合在频数分布表的上侧(正偏倚)，且方差大于均数，那么负二项分布是最优配合式。用矩法求出K值，然后用负二项分布式配合理论频数，并用χ2检验测定其适合度。实验结果见表2。表2 小鼠胚胎死亡理论频数与观察频数比较 胚胎
, 百拇医药
死亡数
观 察 频 数
理论频数(矩法)
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
0
32
, http://www.100md.com
44
33
41
31.44
44.12
32.68
41.56
1
18
20
26
16
19.60
, http://www.100md.com
18.93
27.16
13.75
2
9
6
10
3
7.68
7.43
8.49
5.22
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, 百拇医药
2
2
1
2
2.41
2.83
1.19
2.06
4
1
3
1
0.65
1.08
, http://www.100md.com
0.83
5
1
0.34
适合度检验χ2
0.63
3.99
1.04
2.63
自由度
2
2
1
, 百拇医药
3
P
>0.70
>0.10
>0.30
>0.30
从表2中可见，用负二项分布式配合的理论频数与观察频数的差别无显著性差异，所以用负二项分布是适当的。
在进行各实验组的毒性比较时， 经常发现同一实验的各种结果，用负二项分布式配合理论频数时，有相似的参数K值，分布的平均数是反映毒性影响的最好测量值，故可先估计一个共同的Kc值。
i和S2i是第i个组样本均数和方差，用最小二乘法从i2对S2i-i的回归分析中估计共同Kc值。
(1), 百拇医药
得出共同Kc值后，进行方差稳定性转换，并用一般参数的检验假定来测定其处理效果，把Xi转换为Yi的公式为
Yi=1n(Xi+1/2Kc) (2)
两组比较用t检验，两组以上比较用方差分析。
下面用频数计算法进行分析，具体计算步骤如下：
① 按表2中的观察频数fi及胚胎死亡数Xi分别计算以下数值(见表3);
② 按公式(1)计算共同Kc值;
③ 按公式(2)把Xi转换为Yi(见表4);
④ 进行方差分析，计算平方和、均方及F值，结果见表5。
, 百拇医药 表3 i Si2 Ki记录表
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
∑fi
62
75
70
64
∑fiXi
46
50
, http://www.100md.com
49
37
∑fii
88
110
75
87
i
0.7419
0.6667
0.70
0.5781
Si2
, http://www.100md.com
0.8831
1.0360
0.5899
1.0414
i2
0.5504
0.4445
0.49
0.3342
Si2-i
0.1412
0.3693
, 百拇医药
-0.1101
0.4633
Ki
3.8980
1.2036
-4.4504
0.7213
表4 转换计算结果 胚胎死亡数
Xi
Yi=1n(Xi+0.4475)
观 察 频 数(fi)
合计
, http://www.100md.com
高剂量组
中剂量组
低剂量组
对照组
0
-0.8041
32
44
33
41
1
0.3698
18
, http://www.100md.com
20
26
16
2
0.8951
9
6
10
3
3
1.2376
2
2
1
, 百拇医药
2
4
1.4923
1
3
1
5
1.6952
1
∑fi
62
75
70
64
, http://www.100md.com
271
∑fiyi
35.6504
41.2819
34.4363
39.2652
150.6338
∑fiyi2
-7.0514
-15.6653
-6.7310
-18.7033
, 百拇医药
-48.1510
表5 方差分析 变异来源
平方和
自由度
均 方
F
P
总变异
142.0784
271
组间变异
1.6316
3
, 百拇医药
0.5439
1.0380
>0.05
组内变异
140.4468
268
0.5240
根据计算结果，F=1.3080,P>0.05,可认为各组之间的胚胎死亡水平无显著性差异。从负二项分布计算结果来看，进一步表明氯醚避孕针无明显的显性致死突变作用。
3 讨论
显性致死突变试验给药方法有：①急性试验：按被检物LD50的1/5量，一次经口或非经口给与雄性小鼠；②亚急性试验：被检物的给与量与急性试验相同，但这个量是在5天中连续给与雄性小鼠；③慢性试验：以被检物中最大允许量，至少在3个月间连续经口给予与雄鼠。本试验雄性小鼠腹腔注射连续给药10天，相当于亚急性试验。
, 百拇医药
从致死突变指数和负二项分布法统计分析来看，虽然两者分析结果一致，但其意义却不同。致死突变指数是以总着床数为基础的分析方法，总着床数的多少对致死突变指数的高低有相当影响，而总着床数又与非遗传因素有关，如母鼠受到感染后，也能影响总着床数，故用显性致死突变指数来分析被检物有无致死突变作用是有一定的局限性。
同时，显性致死突变的主要观察指标是胚胎死亡，如果把胚胎死亡数的频数编制分布图，往往呈极偏态分布。仅用一般统计计算就不能合理地进行分析比较，只有采用适当的统计模型，才能正确的反映出被检物对显性致死突变作用的影响有无显著性差异。实验结果表明，胚胎死亡的频数大多数集合在频分布表的上侧(正偏倚)，且方差大于均数，故本试验采用负二项分布分析，能较客观的反映氯醚避孕针对显性致死突变作用的影响。
参考文献
1 Schelner, CA. Toxicology and Applied Pharma cology, 1997; (3):487.
2 刘明哲等.遗传学报，1978；5(4)：330.
3 吴亦帆等.药物分析杂志，1982，2(3).
4 Eric Williammn et al. Table of the Negative Binomial Probability Distribuion, 1963.
收稿日期：1998-10-15, 百拇医药