大鼠致畸试验中胎儿发育及骨化问题探讨
作者：朱清华 张 红
单位：同济医科大学 武汉430030
关键词：大鼠胎儿；发育不良；骨化迟缓；孕日龄
数理医药学杂志990229
摘要 经过现行毒理学试验认为20日龄胎鼠体重、胎盘重、尾长均明显低于正常分娩胎鼠，且胸骨、枕骨，骨化不全，与21日龄胎鼠相比明显偏低，建议用21日龄胎鼠或产前剖腹取胎鼠检查指标更合理。
致畸试验是检查受试物是否具有引起胚胎发育不良或畸变现象的试验方法。某些环境因素或营养不良可通过遗传过程，引起生殖细胞中遗传物质的突变，从而造成胎仔的畸形或发育不良。根据大鼠平均妊娠时间为21～22天[1]，也就是说大鼠交配后查到阴栓或精子日作为0天，于分娩前1～2天剖腹取胎，检查胎儿发育不良或畸形。新药毒理学[2]和食品毒理学[3]都要求对大鼠的致畸试验在查到阴栓或精子日为妊娠0天，于第20天处死，剖腹取胎的目的是为了防止母鼠吞食胎仔，所以提前1～2天提前进行剖检。由于我们经多次试验，发现作为阴性对照组的大鼠，于受孕第20天处死所得胎鼠见到头骨、胸骨、骨化不全的胎鼠占50%以上，作为是综合指标内容中又列上受试物对胎仔骨骼发育，包括头颅骨、胸骨等骨化不全程度的指标和胎儿身长，体重等指标，作为正常对照组本身就已达不到正常发育值，那么实验组就缺乏衡量的正常值标准。为此，我们对成年大鼠进行了观察和比较，着重点指标为受孕20天处死和受孕21天处死胎儿的生长发育与骨骼骨化程度进行了比较，以求了解受孕21天处死的可能性是否更合理。
, http://www.100md.com
1 方法与步骤
选用SD大鼠，体重雌性200±20克，雄性210±20克。按雌：雄=2∶1进行交配，下午5点同笼交配，次晨雌雄分笼。每天清晨8～10点，雌鼠阴道冲洗涂片查精子，以查到精子为受孕0天，分成两组，一组于妊娠第20天晨8点剖腹取胎，另一组于第21天晨8：00剖腹取胎，按毒理学常规称量胎鼠体重、胎盘重，量身长、尾长。胎儿编号单数做骨骼畸形检查，双数做内脏畸形检查。
2 结果
2.1 在试验结束日，受孕母鼠在第21天晨宰杀时，少数见到阴道口有少量血性分泌物，但大部孕鼠未见有血性分泌物，未发生孕鼠提前分娩，可能SD大鼠妊娠期是22天为主。解剖时，21天胎鼠较大，且张嘴扭动，但20天胎鼠解剖时未见到胎鼠有张嘴现象。
2.2 各组胎鼠发育见表1、2。
, 百拇医药
表1 两组孕鼠增重及胎仔发育状况比较 (X±S) 观察指标
妊娠20天宰杀组
妊娠21天宰杀组
孕鼠数(个)
13
10
孕期母鼠体重增长(g)
78.3±18.3
146±25.8
胎仔总数(个)
114
85
, http://www.100md.com
平均每窝仔数(个)
8.77
8.50
胎盘平均重(g)
0.54±0.09
0.58±0.09
3.40±0.26
3.55±0.10
1.33±0.16
5.25±0.87*
3.57±0.57
, 百拇医药
1.47±0.18*
注：* 经t检验P<0.01表2 两组胎儿骨骼发育比较 (X±S) 指 标
妊娠20天宰杀组
妊娠21天宰杀组
检查骨骼胎儿数
57
43
39(68.4%)
4(9.3%)
枕骨骨化不全
, http://www.100md.com
9(15.8%)
1(2.3%)
囱门大于3mm
13(22.8%)
1(2.3%)
矢状缝大于2mm
8(14.0%)
1(2.3%)
注：( )指占受检数的%
从实验结果看，21日龄大鼠的胎儿在胎盘重、胎儿体重、尾长均极明显高于20日孕大鼠的胎儿，但身长两组却无明显差异；从胎仔的骨骼发育看，妊娠21日龄的胎儿骨骼钙化明显优于20日龄的胎儿。孕20天剖检胎鼠，胸骨、枕骨骨化不全占总数的50%以上。
, 百拇医药
3 讨论
从胎儿发育及骨骼的钙化来看，两组之间虽然只差一天，但其成熟程度有极明显差异。从评价标准来看，正常对照组理所应当发育达到正常水平，才能够作为正常值参考，如正常发育尚不够成熟，则不能作为正常值标准，但毒理学方法上都提出要提前一天剖腹取胎，其主要原因是考虑到第21天孕鼠可能分娩，母鼠有可能将畸胎儿吞食，影响实验数据，所以规定提前一天是为了保证得到全部胎儿的数据。
根据黄幸舒[4]等认为发育迟缓不是真正的畸形，吕伯钦[5]等认为胸骨减少或骨化不良，这些改变被认为是正常的变异，但这与评价致畸的规定综合指标中所列观察内容有矛盾。因此我们建议，为提供阴性对照组动物的正常值，考虑建议采用临产前(或见阴道有血性分泌物时)或孕第21天，对孕鼠进行剖腹检查更合理。
4 小结
本文对毒理学程序中致畸试验规定孕鼠于受孕第20天剖腹取胎检查与孕21天剖腹取胎检查比较，证明孕20天宰杀的胎鼠，发育状况及骨骼钙化迟缓明显比孕21天宰的胎鼠差，并建议采用临产前或孕21天宰杀法，对胎儿生长发育、骨化程度更理想，符合健康正常胎鼠指标和要求。
, http://www.100md.com
参考文献
1 环毒教研室编.环境毒理学.武汉医学院，1982，11.
2 中华人民共和国卫生部药政局编.新药临床前研究指导原则汇编，1993.
3 中华人民共和国标准.食品安全性毒理学评价程序和方法(GB15193-94)，1994.
4 黄幸舒，陈星若主编.环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法.浙江科技出版社，1985.
5 吕伯钦等译.实验毒理学基础.北京人民卫生出版社，1987.
收稿日期：1998-10-15, http://www.100md.com
单位：同济医科大学 武汉430030
关键词：大鼠胎儿；发育不良；骨化迟缓；孕日龄
数理医药学杂志990229
摘要 经过现行毒理学试验认为20日龄胎鼠体重、胎盘重、尾长均明显低于正常分娩胎鼠，且胸骨、枕骨，骨化不全，与21日龄胎鼠相比明显偏低，建议用21日龄胎鼠或产前剖腹取胎鼠检查指标更合理。
致畸试验是检查受试物是否具有引起胚胎发育不良或畸变现象的试验方法。某些环境因素或营养不良可通过遗传过程，引起生殖细胞中遗传物质的突变，从而造成胎仔的畸形或发育不良。根据大鼠平均妊娠时间为21～22天[1]，也就是说大鼠交配后查到阴栓或精子日作为0天，于分娩前1～2天剖腹取胎，检查胎儿发育不良或畸形。新药毒理学[2]和食品毒理学[3]都要求对大鼠的致畸试验在查到阴栓或精子日为妊娠0天，于第20天处死，剖腹取胎的目的是为了防止母鼠吞食胎仔，所以提前1～2天提前进行剖检。由于我们经多次试验，发现作为阴性对照组的大鼠，于受孕第20天处死所得胎鼠见到头骨、胸骨、骨化不全的胎鼠占50%以上，作为是综合指标内容中又列上受试物对胎仔骨骼发育，包括头颅骨、胸骨等骨化不全程度的指标和胎儿身长，体重等指标，作为正常对照组本身就已达不到正常发育值，那么实验组就缺乏衡量的正常值标准。为此，我们对成年大鼠进行了观察和比较，着重点指标为受孕20天处死和受孕21天处死胎儿的生长发育与骨骼骨化程度进行了比较，以求了解受孕21天处死的可能性是否更合理。
, http://www.100md.com
1 方法与步骤
选用SD大鼠，体重雌性200±20克，雄性210±20克。按雌：雄=2∶1进行交配，下午5点同笼交配，次晨雌雄分笼。每天清晨8～10点，雌鼠阴道冲洗涂片查精子，以查到精子为受孕0天，分成两组，一组于妊娠第20天晨8点剖腹取胎，另一组于第21天晨8：00剖腹取胎，按毒理学常规称量胎鼠体重、胎盘重，量身长、尾长。胎儿编号单数做骨骼畸形检查，双数做内脏畸形检查。
2 结果
2.1 在试验结束日，受孕母鼠在第21天晨宰杀时，少数见到阴道口有少量血性分泌物，但大部孕鼠未见有血性分泌物，未发生孕鼠提前分娩，可能SD大鼠妊娠期是22天为主。解剖时，21天胎鼠较大，且张嘴扭动，但20天胎鼠解剖时未见到胎鼠有张嘴现象。
2.2 各组胎鼠发育见表1、2。
, 百拇医药
表1 两组孕鼠增重及胎仔发育状况比较 (X±S) 观察指标
妊娠20天宰杀组
妊娠21天宰杀组
孕鼠数(个)
13
10
孕期母鼠体重增长(g)
78.3±18.3
146±25.8
胎仔总数(个)
114
85
, http://www.100md.com
平均每窝仔数(个)
8.77
8.50
胎盘平均重(g)
0.54±0.09
0.58±0.09
3.40±0.26
3.55±0.10
1.33±0.16
5.25±0.87*
3.57±0.57
, 百拇医药
1.47±0.18*
注：* 经t检验P<0.01表2 两组胎儿骨骼发育比较 (X±S) 指 标
妊娠20天宰杀组
妊娠21天宰杀组
检查骨骼胎儿数
57
43
39(68.4%)
4(9.3%)
枕骨骨化不全
, http://www.100md.com
9(15.8%)
1(2.3%)
囱门大于3mm
13(22.8%)
1(2.3%)
矢状缝大于2mm
8(14.0%)
1(2.3%)
注：( )指占受检数的%
从实验结果看，21日龄大鼠的胎儿在胎盘重、胎儿体重、尾长均极明显高于20日孕大鼠的胎儿，但身长两组却无明显差异；从胎仔的骨骼发育看，妊娠21日龄的胎儿骨骼钙化明显优于20日龄的胎儿。孕20天剖检胎鼠，胸骨、枕骨骨化不全占总数的50%以上。
, 百拇医药
3 讨论
从胎儿发育及骨骼的钙化来看，两组之间虽然只差一天，但其成熟程度有极明显差异。从评价标准来看，正常对照组理所应当发育达到正常水平，才能够作为正常值参考，如正常发育尚不够成熟，则不能作为正常值标准，但毒理学方法上都提出要提前一天剖腹取胎，其主要原因是考虑到第21天孕鼠可能分娩，母鼠有可能将畸胎儿吞食，影响实验数据，所以规定提前一天是为了保证得到全部胎儿的数据。
根据黄幸舒[4]等认为发育迟缓不是真正的畸形，吕伯钦[5]等认为胸骨减少或骨化不良，这些改变被认为是正常的变异，但这与评价致畸的规定综合指标中所列观察内容有矛盾。因此我们建议，为提供阴性对照组动物的正常值，考虑建议采用临产前(或见阴道有血性分泌物时)或孕第21天，对孕鼠进行剖腹检查更合理。
4 小结
本文对毒理学程序中致畸试验规定孕鼠于受孕第20天剖腹取胎检查与孕21天剖腹取胎检查比较，证明孕20天宰杀的胎鼠，发育状况及骨骼钙化迟缓明显比孕21天宰的胎鼠差，并建议采用临产前或孕21天宰杀法，对胎儿生长发育、骨化程度更理想，符合健康正常胎鼠指标和要求。
, http://www.100md.com
参考文献
1 环毒教研室编.环境毒理学.武汉医学院，1982，11.
2 中华人民共和国卫生部药政局编.新药临床前研究指导原则汇编，1993.
3 中华人民共和国标准.食品安全性毒理学评价程序和方法(GB15193-94)，1994.
4 黄幸舒，陈星若主编.环境化学物致突变、致畸、致癌试验方法.浙江科技出版社，1985.
5 吕伯钦等译.实验毒理学基础.北京人民卫生出版社，1987.
收稿日期：1998-10-15, http://www.100md.com