利用2.2.1.5细胞株筛选中草药抗HBV活性的实验研究
作者：陈茜 孙爱民 王和平 陈洪涛 汲振余
单位：陈茜(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 孙爱民(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 王和平(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 陈洪涛(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 汲振余(河南省医学科学研究所 郑州450052)
关键词：乙肝病毒；药物筛选；2.2.1.5细胞株
数理医药学杂志000111
摘 要：为建立体外抗HBV药物筛选的技术，应用乙肝病毒(HBV)DNA转染细胞株2.2.1.5细胞培养上清中HBsAg和HBeAg滴度作为药物抗HBV效果的评价指标，对4种中药制剂的抗HBV作用进行了评价。同时，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法检测药物的细胞毒性。结果显示，从中草药中挖掘抗HBV的药物具有较大的潜力，而将HBV DNA转染细胞株用于抗HBV药物体外筛选，是一个简单易行的方法。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 373.2
文章编号：1004-4337(2000)01-0023-02▲
乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性病毒性肝炎的主要病原体之一，故寻找有效的抗HBV药物是当务之急。目前临床已有不少用中草药治疗乙型肝炎的观察[1]，但尚缺乏研究依据，而HBV DNA转染细胞株的建立为抗HBV药物的筛选提供了手段[2]。本研究利用HBV的体外培养系统2.2.1.5细胞系对4种中药制剂进行了抗HBV活性观察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 2.2.1.5细胞 以带有HBV DNA全基因组的重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2获得，能向培养上清中稳定地排泌HBsAg、HBeAg和完整HBV颗粒。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 DMEM干粉、胎牛血清、G418(Geneticin)均为美国GIBCO公司提供；HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂由中国华美生物工程公司提供；HBV DNA检测试剂由上海医科大学预防医学研究所提供。
1.1.3 药物 抗纤粗制剂与精制提取液由本所药理室提供，抗肝丸由本室提供，板兰根注射液为市售。以Ara-A为阳性实验对照药物。
1.2 方法
1.2.1 2.2.1.5细胞培养及抗病毒药物的应用 用含10%胎牛血清，380μg/ml G418,0.03%青霉素，以5%NaHCO3调PH至7的DMEM培养基，将2.2.1.5细胞按1.2×105/孔接种于24孔板，每孔1.5ml，在5%CO2孵育箱37℃培养48h，弃上清，加含不同药物浓度的培养液，每个药物浓度设4个平行孔，同时设阴阳性对照。同样条件下培养15天，每5天换药培养液1次，换出的细胞上清-20℃保存。
, 百拇医药
1.2.2 药物作用后细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测 用ELISA法分别测得每孔HBsAg、HBeAg的P/N值，根据公式(对照孔P/N—实验孔P/N)/(对照孔P/N-2.1)×100%即为该浓度药物对HBsAg和HBeAg的抑制率，以抑制率大于50%为有抑制作用。
用斑点杂交法检测培养液中的HBV DNA，按操作说明进行，HBV DNA结果用阴性或阳性判断。
1.2.3 药物的细胞毒性试验 根据Mosmann[3]方法，于用药第5、10、15天，在收取细胞上清液的同时，用MTT比色分析检测细胞吸光度值，与相应对照孔的吸光度值(存活细胞100%)比较，计算存活细胞百分比，对细胞毒性进行动态观察。
1.2.4 药物抗HBV效果以治疗指数(T)评价 T=CD50/ID50,T>2为有效，T=1为有毒有效，T<1为毒性作用。
, 百拇医药
2 结果
用2.2.1.5细胞系作为体外实验模型，以Ara-A作为抗-HBV阳性对照药物，对4种中草药制剂及提取物进行抗HBV体外实验研究，结果如下：
2.1 4种中药制剂的体外抗HBV作用 抗肝丸与板兰根对HBsAg和HBeAg均有抑制作用，而抗肝丸对HBeAg的抑制作用大于对HBsAg的抑制作用。抗纤粗制剂与精制提取液对HBsAg和HBeAg抑制作用均小于50%，且粗制剂较精制剂对细胞毒性大，见表1、2。
表1 抗肝丸、板兰根药物的抗HBV效果* 药 物
药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
, http://www.100md.com
(%)
HBeAg抑制率
(%)
细胞存活
(%)
抗肝丸
40
17
21
90
80
30
32
, http://www.100md.com
82
160
45
48
70
320
51
60
64
ID50
310
170
CD50
, 百拇医药
370
370
T
1.19
2.17
板兰根
0.25
24.5
20.5
95
0.5
30.67
27.46
, http://www.100md.com
88
2.5
40.87
36.66
76
5
51.87
48.31
65
ID50
4.5
5.2
CD50
, http://www.100md.com
8.3
8.3
T
1.84
1.60
注：* 均为用药第15天结果，下同
表2 抗纤粗制剂与精制提取液抗HBV效果 药 物
药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
(%)
HBeAg抑制率
, 百拇医药
(%)
细胞存活
(%)
抗纤粗
制 剂
40
80
14
20
17
21
60
45
, 百拇医药 160
32
28
39
320
39
37
30
ID50
370
380
CD50
75
, 百拇医药
75
T
0.203
0.197
抗纤精
制提取
液
40
80
160
22
34
40
, http://www.100md.com 20
35
41
70
62
50
320
46
45
42
ID50
350
350
, 百拇医药
CD50
160
160
T
0.457
0.457
2.2 斑点杂交检测HBV DNA 阳性对照药物Ara-A对HBV DNA有明显抑制，而对HBsAg、HBeAg有较强的抑制作用，见表3。抗肝丸、板兰根在用药第15天时对HBV DNA有一定抑制作用，结果显示弱阳性。抗纤粗、精制剂对HBV DNA均无抑制作用。表3 Ara-A的抗HBV效果 药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
, 百拇医药
(%)
HBeAg抑制率
(%)
细胞存活
(%)
40
30
10
92
80
42
22
85
, 百拇医药
160
45
53
70
320
75
80
66
ID50
190
150
CD50
400
, 百拇医药
400
T
2.1
2.67
2.3 药物的毒性作用 抗肝丸与板兰根对细胞毒性较小，抗纤粗制剂对细胞毒性最大，而抗纤精制提取液较粗制剂对细胞毒性小。
3 讨论
2.2.1.5细胞能长期稳定地向培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒[1]，是体外抗HBV药物筛选很好的模型。我们利用这一模型对几种中草药制剂及提取液进行了抗HBV观察，并采用了目前应用于很多嗜肝DNA病毒模型[4]和临床试验治疗观察[5]，并被认为在治疗期间能有效地抑制HBV的药物Ara-A作为阳性对照，结果显示Ara-A、抗肝丸、板兰根对HBsAg、HBeAg以及HBV DNA有不同程度的抑制作用，且细胞毒性较小。Ara-A和抗肝丸对HBeAg的抑制作用较对HBsAg的抑制作用大，而板兰根对HBsAg的抑制作用稍大于对HBeAg的抑制作用。抗纤粗制剂及精制提取液虽对HBsAg、HBeAg的抑制作用小于50%，但精制提取液对HBsAg、HBeAg的抑制作用大于粗制剂，提示进一步提取药物的有效成份，有可能提高药物的抗病毒作用。然而这些药物有一个共同特点，即随着药物浓度的提高，对细胞的毒性亦加大。从治疗指数T看，有效药物的T值为1.19～2.17，无效药物的T值均小于1。
, http://www.100md.com
目前，对HBV感染尚无理想的治疗药物，而寻找高效，低毒的抗HBV药物是临床急待解决的问题，将HBV DNA转染细胞株用于抗HBV药物体外筛选，这是一个简单易行的方法，为抗HBV药物筛选和指导临床用药提供了理论根据。■
参考文献：
[1] 李淑平.中医药治疗乙型肝炎病毒感染指标近况.广西中西药，1989，12：43.
[2] 唐红，赵连三，王锦容等.利用体外细胞培养系统筛选抗HBV活性中草药的初步研究.中华传染病杂志，1993，(10)4：22.
[3] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J-Immunol-Methods. 1983,65:55.
, http://www.100md.com
[4] Hirota K, Sherker AH; Omata M; et al. Effects of adenine arabinoside on serum and intrahepatic replicative forms of duck hepatitis B virus in chronic infection. Hepatology. 1987,7:24.
[5] Pollard RB; Smith JL, Neal A et al. Effect of vidarabine on chronic hepatitis B virus infection. JAMA. 1978,239:1648.
收稿日期：1999-02-22, 百拇医药
单位：陈茜(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 孙爱民(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 王和平(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 陈洪涛(河南省医学科学研究所 郑州450052)； 汲振余(河南省医学科学研究所 郑州450052)
关键词：乙肝病毒；药物筛选；2.2.1.5细胞株
数理医药学杂志000111
摘 要：为建立体外抗HBV药物筛选的技术，应用乙肝病毒(HBV)DNA转染细胞株2.2.1.5细胞培养上清中HBsAg和HBeAg滴度作为药物抗HBV效果的评价指标，对4种中药制剂的抗HBV作用进行了评价。同时，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色分析法检测药物的细胞毒性。结果显示，从中草药中挖掘抗HBV的药物具有较大的潜力，而将HBV DNA转染细胞株用于抗HBV药物体外筛选，是一个简单易行的方法。
, http://www.100md.com
中图分类号：R 373.2
文章编号：1004-4337(2000)01-0023-02▲
乙型肝炎病毒(HBV)是引起急、慢性病毒性肝炎的主要病原体之一，故寻找有效的抗HBV药物是当务之急。目前临床已有不少用中草药治疗乙型肝炎的观察[1]，但尚缺乏研究依据，而HBV DNA转染细胞株的建立为抗HBV药物的筛选提供了手段[2]。本研究利用HBV的体外培养系统2.2.1.5细胞系对4种中药制剂进行了抗HBV活性观察。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 2.2.1.5细胞 以带有HBV DNA全基因组的重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2获得，能向培养上清中稳定地排泌HBsAg、HBeAg和完整HBV颗粒。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 DMEM干粉、胎牛血清、G418(Geneticin)均为美国GIBCO公司提供；HBsAg、HBeAg ELISA检测试剂由中国华美生物工程公司提供；HBV DNA检测试剂由上海医科大学预防医学研究所提供。
1.1.3 药物 抗纤粗制剂与精制提取液由本所药理室提供，抗肝丸由本室提供，板兰根注射液为市售。以Ara-A为阳性实验对照药物。
1.2 方法
1.2.1 2.2.1.5细胞培养及抗病毒药物的应用 用含10%胎牛血清，380μg/ml G418,0.03%青霉素，以5%NaHCO3调PH至7的DMEM培养基，将2.2.1.5细胞按1.2×105/孔接种于24孔板，每孔1.5ml，在5%CO2孵育箱37℃培养48h，弃上清，加含不同药物浓度的培养液，每个药物浓度设4个平行孔，同时设阴阳性对照。同样条件下培养15天，每5天换药培养液1次，换出的细胞上清-20℃保存。
, 百拇医药
1.2.2 药物作用后细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA检测 用ELISA法分别测得每孔HBsAg、HBeAg的P/N值，根据公式(对照孔P/N—实验孔P/N)/(对照孔P/N-2.1)×100%即为该浓度药物对HBsAg和HBeAg的抑制率，以抑制率大于50%为有抑制作用。
用斑点杂交法检测培养液中的HBV DNA，按操作说明进行，HBV DNA结果用阴性或阳性判断。
1.2.3 药物的细胞毒性试验 根据Mosmann[3]方法，于用药第5、10、15天，在收取细胞上清液的同时，用MTT比色分析检测细胞吸光度值，与相应对照孔的吸光度值(存活细胞100%)比较，计算存活细胞百分比，对细胞毒性进行动态观察。
1.2.4 药物抗HBV效果以治疗指数(T)评价 T=CD50/ID50,T>2为有效，T=1为有毒有效，T<1为毒性作用。
, 百拇医药
2 结果
用2.2.1.5细胞系作为体外实验模型，以Ara-A作为抗-HBV阳性对照药物，对4种中草药制剂及提取物进行抗HBV体外实验研究，结果如下：
2.1 4种中药制剂的体外抗HBV作用 抗肝丸与板兰根对HBsAg和HBeAg均有抑制作用，而抗肝丸对HBeAg的抑制作用大于对HBsAg的抑制作用。抗纤粗制剂与精制提取液对HBsAg和HBeAg抑制作用均小于50%，且粗制剂较精制剂对细胞毒性大，见表1、2。
表1 抗肝丸、板兰根药物的抗HBV效果* 药 物
药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
, http://www.100md.com
(%)
HBeAg抑制率
(%)
细胞存活
(%)
抗肝丸
40
17
21
90
80
30
32
, http://www.100md.com
82
160
45
48
70
320
51
60
64
ID50
310
170
CD50
, 百拇医药
370
370
T
1.19
2.17
板兰根
0.25
24.5
20.5
95
0.5
30.67
27.46
, http://www.100md.com
88
2.5
40.87
36.66
76
5
51.87
48.31
65
ID50
4.5
5.2
CD50
, http://www.100md.com
8.3
8.3
T
1.84
1.60
注：* 均为用药第15天结果，下同
表2 抗纤粗制剂与精制提取液抗HBV效果 药 物
药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
(%)
HBeAg抑制率
, 百拇医药
(%)
细胞存活
(%)
抗纤粗
制 剂
40
80
14
20
17
21
60
45
, 百拇医药 160
32
28
39
320
39
37
30
ID50
370
380
CD50
75
, 百拇医药
75
T
0.203
0.197
抗纤精
制提取
液
40
80
160
22
34
40
, http://www.100md.com 20
35
41
70
62
50
320
46
45
42
ID50
350
350
, 百拇医药
CD50
160
160
T
0.457
0.457
2.2 斑点杂交检测HBV DNA 阳性对照药物Ara-A对HBV DNA有明显抑制，而对HBsAg、HBeAg有较强的抑制作用，见表3。抗肝丸、板兰根在用药第15天时对HBV DNA有一定抑制作用，结果显示弱阳性。抗纤粗、精制剂对HBV DNA均无抑制作用。表3 Ara-A的抗HBV效果 药物浓度
(mg/ml)
HBsAg抑制率
, 百拇医药
(%)
HBeAg抑制率
(%)
细胞存活
(%)
40
30
10
92
80
42
22
85
, 百拇医药
160
45
53
70
320
75
80
66
ID50
190
150
CD50
400
, 百拇医药
400
T
2.1
2.67
2.3 药物的毒性作用 抗肝丸与板兰根对细胞毒性较小，抗纤粗制剂对细胞毒性最大，而抗纤精制提取液较粗制剂对细胞毒性小。
3 讨论
2.2.1.5细胞能长期稳定地向培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和HBV颗粒[1]，是体外抗HBV药物筛选很好的模型。我们利用这一模型对几种中草药制剂及提取液进行了抗HBV观察，并采用了目前应用于很多嗜肝DNA病毒模型[4]和临床试验治疗观察[5]，并被认为在治疗期间能有效地抑制HBV的药物Ara-A作为阳性对照，结果显示Ara-A、抗肝丸、板兰根对HBsAg、HBeAg以及HBV DNA有不同程度的抑制作用，且细胞毒性较小。Ara-A和抗肝丸对HBeAg的抑制作用较对HBsAg的抑制作用大，而板兰根对HBsAg的抑制作用稍大于对HBeAg的抑制作用。抗纤粗制剂及精制提取液虽对HBsAg、HBeAg的抑制作用小于50%，但精制提取液对HBsAg、HBeAg的抑制作用大于粗制剂，提示进一步提取药物的有效成份，有可能提高药物的抗病毒作用。然而这些药物有一个共同特点，即随着药物浓度的提高，对细胞的毒性亦加大。从治疗指数T看，有效药物的T值为1.19～2.17，无效药物的T值均小于1。
, http://www.100md.com
目前，对HBV感染尚无理想的治疗药物，而寻找高效，低毒的抗HBV药物是临床急待解决的问题，将HBV DNA转染细胞株用于抗HBV药物体外筛选，这是一个简单易行的方法，为抗HBV药物筛选和指导临床用药提供了理论根据。■
参考文献：
[1] 李淑平.中医药治疗乙型肝炎病毒感染指标近况.广西中西药，1989，12：43.
[2] 唐红，赵连三，王锦容等.利用体外细胞培养系统筛选抗HBV活性中草药的初步研究.中华传染病杂志，1993，(10)4：22.
[3] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and surrival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J-Immunol-Methods. 1983,65:55.
, http://www.100md.com
[4] Hirota K, Sherker AH; Omata M; et al. Effects of adenine arabinoside on serum and intrahepatic replicative forms of duck hepatitis B virus in chronic infection. Hepatology. 1987,7:24.
[5] Pollard RB; Smith JL, Neal A et al. Effect of vidarabine on chronic hepatitis B virus infection. JAMA. 1978,239:1648.
收稿日期：1999-02-22, 百拇医药