蝮蛇抗栓酶对骨骼肌缺血再灌注损伤保护的实验研究
作者：唐新宇 范里 刘世清 李家元
单位：唐新宇(深圳市中心医院 深圳518036)；范里(深圳市中心医院 深圳518036)；刘世清(深圳市中心医院 深圳518036)；李家元(深圳市中心医院 深圳518036)
关键词：缺血再灌注损伤；微循环；蝮蛇抗栓酶
数理医药学杂志000343
摘 要 为探讨骨骼肌缺血再灌注损伤前后微循环变化及蝮蛇抗检酶(Svate)的保护作用，将24只兔随机分成两组，以气囊止血带造成兔左下肢缺血再灌注损伤模型。实验组分别在缺血前及再灌注前给予Svate静注，对照组给予等量生理盐水，以微循环显微镜观察兔缺血前及再灌注后骨骼肌微循环的变化。结果显示，Svate通过疏通微循环对骨骼 肌缺血再灌注损伤起保护作用。
中图分类号：R 331.3+5 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1004-4337(2000)03-0259-02
在骨科临床工作中，常可遇到骨骼肌缺血再灌注(I/R)损伤的问题。本实验通过微循环显微镜直接观测骨骼肌I/R前后微循环状况的变化及运用蝮蛇抗栓酶(Svate)保护后骨骼肌微循环的变化，探讨骨骼肌I/R损伤的机制，并为临床防治该损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大耳白兔24只，体重1.8～2.4kg，随机分为两组，A组为对照组，B组为实验组。实验组于上止血带前10min和松止血带前10min分钟静注Svate 0.0125U/kg(沈阳第一制药厂)，对照组注射等容量生理盐水。
1.2 实验方法 3%戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下解剖出左趾长伸肌腱肌肉肌腱移行部至斜韧带之间的部分，保证腱系膜完整，用微循环显微镜(WX-753B 型，徐州光学仪器厂生产)观察肌腱系膜微循环状况并录相，以微循环机图像 测量系统(XTW型，北京光电技术公司生产)进行微循环测定分析。观察10min后，在兔左大腿中上段上气囊止血管，驱血后充气至4.0KPa。缺血4h后松开止血带并再次观察肌腱表面微循环状况至再灌注后2h。
, 百拇医药
1.3 检验项目
1.3.1 微循环指标 ①三级微血管血流速度测定 根据微循环显微镜下微血管分布特点：1级为细动脉，2级为后微动脉，3级为真毛细血管；②白细胞附壁；③白色微栓；④红细胞聚集；⑤无复流现象(no-reflow phenomenon)：将微循环各指标分正常、轻、中、重四度[1,2]。
1.3.2 组织病理学检查 电镜。
1.4 统计学处理 各组数据以均数±标准差(
±s)描述，采用SPSS统计软件进行检验(t检验和q检验)。
2 结果
2.1 微循环变化。
, 百拇医药
表1 兔左后肢I/R前后微循环变化(n=24) 检测指标
A 组
B 组
T0
T1
T2
T0
T1
T2
白细胞聚集
±
, 百拇医药
+
±
±
+
白细胞附壁
-
+
-
±
+
白色微栓
, 百拇医药
-
+
-
-
+
渗出
-
+
-
-
+
, 百拇医药 渗血
-
-
+
-
-
-
无复流
±
±
+
, 百拇医药
注：(-)无；(+)轻度；()中度；()重度
2.1.1 缺血前(T0) 两组微血管血流快，血细胞聚集不明显，偶见白色微栓和少量白细胞附壁，极少有无复流(no-reflow)现象，未见渗出及渗血。
2.1.2 缺血4h，再灌注后10min(T1) A组：微血管血流减慢，红细胞中度聚集，有较多白细胞附壁及少量白色微栓，部分微血管出现无复流，轻度渗出，无渗血。B组：红细胞聚集不明显，仅真毛细血管血流减缓，但仍明显快于A组，白细胞附壁、白色微栓及无复流现象较少，无明显渗出和渗血。
2.1.3 缺血4h再灌注2h(T2) A组：红细胞重度聚集，血流进一步减慢，有中度白细胞附壁和较多的白色微栓，无复流现象加重，少数细静脉、毛细血管渗血。B组：血流亦减慢，但各级血管流速明显快于A组，红细胞轻度聚集，白细胞附壁及白色微栓量少于A组，无复流现象较轻，有轻度渗出，无渗血。
, 百拇医药
2.2 电镜
A组：线粒体极度肿胀，结构不清，甚至崩解，嵴减少甚至消失，多处肌丝溶解，糖原消失，有散在局限性坏死灶，少量肌细胞核浓缩边集。B组：线粒体肿胀，嵴减少，无坏死灶及肌丝溶解，糖原减少，少量肌丝断裂，肌细胞核无异常。
表2 兔左后肢I/R后各级微血管血流速度变化(n=24,mm/s,±s) 血管
分级
A 组
B 组
T0
T1
, 百拇医药
T2
T0
T1
T2
1级
0.515±0.023
0.370±0.023*
0.311±0.014**
0.505±0.025
0.526±0.030
0.509±0.038△
, http://www.100md.com
2级A
0.404±0.020
0.291±0.021*
0.250±0.027**
0.393±0.023
0.398±0.044
0.321±0.033△**
V
0.270±0.017
0.221±0.017*
, 百拇医药 0.201±0.015**
0.268±0.020
0.255±0.021
0.239±0.017△
3级
0.279±0.022
0.212±0.020*
0.139±0.020**
0.297±0.021
0.257±0.019*
, 百拇医药
0.230±0.028△**
注：自身对照：*与T0相比，P<0.01,**与T1相比，P<0.01；组间对照：△BT2与AT2相比，P<0.013 讨论
缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury)是临床中常见的一种复杂病理生理变化，可导致局部甚至远处组织或器官的损伤，其损伤机制目前研究较多的是氧自由基学说、脂质过氧化学说、白细胞损伤学说以及最近提出的细胞凋亡学说等等，本实验证实微循环损伤学说也是缺血再灌注损伤的机制之一。
再灌注损伤可造成红细胞膜膜磷脂分子过氧化损伤，从而引起红细胞膜流动性乃至整个细胞变形性的明显恶化[3]。同时，再灌注损伤可引起纤维蛋白原(Fib)增高，Fib能吸附于红细胞表面，使红细胞间的静电斥力降低，红细胞聚集性增加[4]。微循环血流缓慢，切变率降低，亦可促使红细胞聚集。
, 百拇医药
本实验观察到大量白细胞附壁，有学者认为缺血再灌注损伤是由白细胞聚集、粘附于血管内皮而引发的[5]。再灌注后产生的白细胞粘附分子Mac-1可促进白细胞粘附于骨骼肌微循环的内皮，减少肌肉血流量并释放氧自由基和蛋白水解酶致组织损伤[6]。白细胞粘附于血管壁可释放血栓素A2(TxA2)[7]，TxA2是一种血小板趋化剂，可促进血小板聚集，聚集的血小板可释放ADP、TxA2等又引起更多的血小板聚集，最终激活凝血酶，导致白色微检形成。
再灌注损伤可引起无复流(no-reflow)现象，肌肉组织在缺血1～3h后很容易灌注再通，而缺血5h后只有40～50%可以灌注再通。无复流现象多由机械性阻塞所致，与以下因素有关：①白细胞附壁；②血小板聚集、白色微栓形成；③红细胞聚集、红细胞变形能力下降；④毛细血管内皮细胞、肿胀；⑤血液粘度增高及流速减慢，再灌注后以上因素逐渐加重，导致no-reflow现象加重。
, http://www.100md.com
本实验中I/R损伤所致的红细胞聚集、白细胞附壁、白色微栓的形成均可使血液粘度增高、血液流速减慢，而血粘度增高、流速减慢又可进一步促进红细胞聚集、白色微栓形成，这种恶性循环可解释再灌注后随时间的推移，微循环障碍逐渐加重。另外，聚集的红细胞携氧能力下降，加之血流缓慢、无复流现象加重，使骨骼肌仍处于一种缺血缺氧状态。
Svate中含有类凝血酶，它可切除血浆Fib中的纤维蛋白肽A，但不激活凝血因子XⅢ，所以其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交链，易被纤维蛋白酶降解，导致体内Fib浓度降低而表现出抗凝效应[8]。Svate通过降低Fib，增强红细胞间的静电斥力，降低其聚集力，使红细胞解聚、血液粘度下降，从而改善血液流动性，加快血液流动。Svate中含有A型磷酯酶A2(A-PLA2)，是血小板聚集抑制剂，可使血浆中PGI2含量增加、TxA2浓度降低，从而预防白色微栓的形成。红细胞变形是微循环保持有效灌注的必要条件，Svate可增加红细胞的变形能力，使红细胞与组织间物质与气体的交换面积增大，从而增加组织供氧。
, 百拇医药
白细胞附壁与再灌注损伤关系密切，Crinnion应用抗Mac-1抑制白细胞附壁，可减轻肌肉坏死，改善肌肉微循环灌注[6]。本实验观察到Svate可使再灌注后白细胞附壁量明显下降，Svate抑制白细胞附壁的机制可能与增加血液流速、减轻红细胞聚集、降低血液粘度及血管内皮损伤有关。
总之，Svate通过降低血液粘度、加快血液流速、防止红细胞聚集、增强红细胞变形能力、抑制白细胞附壁抑制血小板聚集、预防白色微栓形成、减少no-reflow发生，从而改善骨骼肌微循环状况，对骨骼肌缺血再灌注损伤起到保护作用。
参考文献
1，李向红.常用微循环基本名词和容易混淆的概念.临床微循环检查手册.第一版.中国医药科技出版社，1992，165.
2，范里，刘世清.骨骼肌缺血再灌注损伤后血液流变性及微循环变化.微循环学杂志，1999，9(1)：13～15.
, 百拇医药
3，Huang YM, Zhao H, Yu X, et al. Damaging mechanism of free radical to the membrane molecules of red blood cell. Acta Biophys Sin. 1997,13(2):315～323.
4，满昌军，董香玉，朱传安.高血脂和高纤维蛋白原对红细胞电泳时间的影响.微循环学杂志，1998，8(1)：48.
5，Dahouk S, Plappert U, Gerngross H, et al. Systemic genotoxic effect caused by ischemia reperfusion. Surgical trauma of the lower extremity-detection of DNA chain breaks in leukocytes with the comet assay. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd. 1997,114:601～254.
, http://www.100md.com
6，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Role of neutrophil-endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury. Br J Surg. 1996,83(2):251～254.
7，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Neutrophils and the endothelium in post-ischemic alterations in skeletal muscle blood flow. Ann NY Acad Sci. 1994,723:442～443.
8，Ewart ME, Hatton MW, Basford JM, et al. The proteolytic action of Arvin on human fibrinogen, Biochem J. 1970,118:603～609.
收稿日期：1999-12-18, 百拇医药
单位：唐新宇(深圳市中心医院 深圳518036)；范里(深圳市中心医院 深圳518036)；刘世清(深圳市中心医院 深圳518036)；李家元(深圳市中心医院 深圳518036)
关键词：缺血再灌注损伤；微循环；蝮蛇抗栓酶
数理医药学杂志000343
摘 要 为探讨骨骼肌缺血再灌注损伤前后微循环变化及蝮蛇抗检酶(Svate)的保护作用，将24只兔随机分成两组，以气囊止血带造成兔左下肢缺血再灌注损伤模型。实验组分别在缺血前及再灌注前给予Svate静注，对照组给予等量生理盐水，以微循环显微镜观察兔缺血前及再灌注后骨骼肌微循环的变化。结果显示，Svate通过疏通微循环对骨骼 肌缺血再灌注损伤起保护作用。
中图分类号：R 331.3+5 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1004-4337(2000)03-0259-02
在骨科临床工作中，常可遇到骨骼肌缺血再灌注(I/R)损伤的问题。本实验通过微循环显微镜直接观测骨骼肌I/R前后微循环状况的变化及运用蝮蛇抗栓酶(Svate)保护后骨骼肌微循环的变化，探讨骨骼肌I/R损伤的机制，并为临床防治该损伤提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰大耳白兔24只，体重1.8～2.4kg，随机分为两组，A组为对照组，B组为实验组。实验组于上止血带前10min和松止血带前10min分钟静注Svate 0.0125U/kg(沈阳第一制药厂)，对照组注射等容量生理盐水。
1.2 实验方法 3%戊巴比妥钠(1ml/kg)耳缘静脉注射麻醉，无菌条件下解剖出左趾长伸肌腱肌肉肌腱移行部至斜韧带之间的部分，保证腱系膜完整，用微循环显微镜(WX-753B 型，徐州光学仪器厂生产)观察肌腱系膜微循环状况并录相，以微循环机图像 测量系统(XTW型，北京光电技术公司生产)进行微循环测定分析。观察10min后，在兔左大腿中上段上气囊止血管，驱血后充气至4.0KPa。缺血4h后松开止血带并再次观察肌腱表面微循环状况至再灌注后2h。
, 百拇医药
1.3 检验项目
1.3.1 微循环指标 ①三级微血管血流速度测定 根据微循环显微镜下微血管分布特点：1级为细动脉，2级为后微动脉，3级为真毛细血管；②白细胞附壁；③白色微栓；④红细胞聚集；⑤无复流现象(no-reflow phenomenon)：将微循环各指标分正常、轻、中、重四度[1,2]。
1.3.2 组织病理学检查 电镜。
1.4 统计学处理 各组数据以均数±标准差(
±s)描述，采用SPSS统计软件进行检验(t检验和q检验)。2 结果
2.1 微循环变化。
, 百拇医药
表1 兔左后肢I/R前后微循环变化(n=24) 检测指标
A 组
B 组
T0
T1
T2
T0
T1
T2
白细胞聚集
±
, 百拇医药
+
±
±
+
白细胞附壁
-
+
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白色微栓
, 百拇医药
-
+
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渗出
-
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, 百拇医药 渗血
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无复流
±
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注：(-)无；(+)轻度；(
)中度；()重度2.1.1 缺血前(T0) 两组微血管血流快，血细胞聚集不明显，偶见白色微栓和少量白细胞附壁，极少有无复流(no-reflow)现象，未见渗出及渗血。
2.1.2 缺血4h，再灌注后10min(T1) A组：微血管血流减慢，红细胞中度聚集，有较多白细胞附壁及少量白色微栓，部分微血管出现无复流，轻度渗出，无渗血。B组：红细胞聚集不明显，仅真毛细血管血流减缓，但仍明显快于A组，白细胞附壁、白色微栓及无复流现象较少，无明显渗出和渗血。
2.1.3 缺血4h再灌注2h(T2) A组：红细胞重度聚集，血流进一步减慢，有中度白细胞附壁和较多的白色微栓，无复流现象加重，少数细静脉、毛细血管渗血。B组：血流亦减慢，但各级血管流速明显快于A组，红细胞轻度聚集，白细胞附壁及白色微栓量少于A组，无复流现象较轻，有轻度渗出，无渗血。
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2.2 电镜
A组：线粒体极度肿胀，结构不清，甚至崩解，嵴减少甚至消失，多处肌丝溶解，糖原消失，有散在局限性坏死灶，少量肌细胞核浓缩边集。B组：线粒体肿胀，嵴减少，无坏死灶及肌丝溶解，糖原减少，少量肌丝断裂，肌细胞核无异常。
表2 兔左后肢I/R后各级微血管血流速度变化(n=24,mm/s,
±s) 血管分级
A 组
B 组
T0
T1
, 百拇医药
T2
T0
T1
T2
1级
0.515±0.023
0.370±0.023*
0.311±0.014**
0.505±0.025
0.526±0.030
0.509±0.038△
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2级A
0.404±0.020
0.291±0.021*
0.250±0.027**
0.393±0.023
0.398±0.044
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V
0.270±0.017
0.221±0.017*
, 百拇医药 0.201±0.015**
0.268±0.020
0.255±0.021
0.239±0.017△
3级
0.279±0.022
0.212±0.020*
0.139±0.020**
0.297±0.021
0.257±0.019*
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0.230±0.028△**
注：自身对照：*与T0相比，P<0.01,**与T1相比，P<0.01；组间对照：△BT2与AT2相比，P<0.013 讨论
缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury)是临床中常见的一种复杂病理生理变化，可导致局部甚至远处组织或器官的损伤，其损伤机制目前研究较多的是氧自由基学说、脂质过氧化学说、白细胞损伤学说以及最近提出的细胞凋亡学说等等，本实验证实微循环损伤学说也是缺血再灌注损伤的机制之一。
再灌注损伤可造成红细胞膜膜磷脂分子过氧化损伤，从而引起红细胞膜流动性乃至整个细胞变形性的明显恶化[3]。同时，再灌注损伤可引起纤维蛋白原(Fib)增高，Fib能吸附于红细胞表面，使红细胞间的静电斥力降低，红细胞聚集性增加[4]。微循环血流缓慢，切变率降低，亦可促使红细胞聚集。
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本实验观察到大量白细胞附壁，有学者认为缺血再灌注损伤是由白细胞聚集、粘附于血管内皮而引发的[5]。再灌注后产生的白细胞粘附分子Mac-1可促进白细胞粘附于骨骼肌微循环的内皮，减少肌肉血流量并释放氧自由基和蛋白水解酶致组织损伤[6]。白细胞粘附于血管壁可释放血栓素A2(TxA2)[7]，TxA2是一种血小板趋化剂，可促进血小板聚集，聚集的血小板可释放ADP、TxA2等又引起更多的血小板聚集，最终激活凝血酶，导致白色微检形成。
再灌注损伤可引起无复流(no-reflow)现象，肌肉组织在缺血1～3h后很容易灌注再通，而缺血5h后只有40～50%可以灌注再通。无复流现象多由机械性阻塞所致，与以下因素有关：①白细胞附壁；②血小板聚集、白色微栓形成；③红细胞聚集、红细胞变形能力下降；④毛细血管内皮细胞、肿胀；⑤血液粘度增高及流速减慢，再灌注后以上因素逐渐加重，导致no-reflow现象加重。
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本实验中I/R损伤所致的红细胞聚集、白细胞附壁、白色微栓的形成均可使血液粘度增高、血液流速减慢，而血粘度增高、流速减慢又可进一步促进红细胞聚集、白色微栓形成，这种恶性循环可解释再灌注后随时间的推移，微循环障碍逐渐加重。另外，聚集的红细胞携氧能力下降，加之血流缓慢、无复流现象加重，使骨骼肌仍处于一种缺血缺氧状态。
Svate中含有类凝血酶，它可切除血浆Fib中的纤维蛋白肽A，但不激活凝血因子XⅢ，所以其水解产生的纤维蛋白凝块的侧链不能交链，易被纤维蛋白酶降解，导致体内Fib浓度降低而表现出抗凝效应[8]。Svate通过降低Fib，增强红细胞间的静电斥力，降低其聚集力，使红细胞解聚、血液粘度下降，从而改善血液流动性，加快血液流动。Svate中含有A型磷酯酶A2(A-PLA2)，是血小板聚集抑制剂，可使血浆中PGI2含量增加、TxA2浓度降低，从而预防白色微栓的形成。红细胞变形是微循环保持有效灌注的必要条件，Svate可增加红细胞的变形能力，使红细胞与组织间物质与气体的交换面积增大，从而增加组织供氧。
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白细胞附壁与再灌注损伤关系密切，Crinnion应用抗Mac-1抑制白细胞附壁，可减轻肌肉坏死，改善肌肉微循环灌注[6]。本实验观察到Svate可使再灌注后白细胞附壁量明显下降，Svate抑制白细胞附壁的机制可能与增加血液流速、减轻红细胞聚集、降低血液粘度及血管内皮损伤有关。
总之，Svate通过降低血液粘度、加快血液流速、防止红细胞聚集、增强红细胞变形能力、抑制白细胞附壁抑制血小板聚集、预防白色微栓形成、减少no-reflow发生，从而改善骨骼肌微循环状况，对骨骼肌缺血再灌注损伤起到保护作用。
参考文献
1，李向红.常用微循环基本名词和容易混淆的概念.临床微循环检查手册.第一版.中国医药科技出版社，1992，165.
2，范里，刘世清.骨骼肌缺血再灌注损伤后血液流变性及微循环变化.微循环学杂志，1999，9(1)：13～15.
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3，Huang YM, Zhao H, Yu X, et al. Damaging mechanism of free radical to the membrane molecules of red blood cell. Acta Biophys Sin. 1997,13(2):315～323.
4，满昌军，董香玉，朱传安.高血脂和高纤维蛋白原对红细胞电泳时间的影响.微循环学杂志，1998，8(1)：48.
5，Dahouk S, Plappert U, Gerngross H, et al. Systemic genotoxic effect caused by ischemia reperfusion. Surgical trauma of the lower extremity-detection of DNA chain breaks in leukocytes with the comet assay. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd. 1997,114:601～254.
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6，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Role of neutrophil-endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injury. Br J Surg. 1996,83(2):251～254.
7，Crinnion JN, Homer-Vanniasinkam S, Parkin SM, et al. Neutrophils and the endothelium in post-ischemic alterations in skeletal muscle blood flow. Ann NY Acad Sci. 1994,723:442～443.
8，Ewart ME, Hatton MW, Basford JM, et al. The proteolytic action of Arvin on human fibrinogen, Biochem J. 1970,118:603～609.
收稿日期：1999-12-18, 百拇医药