哮喘小鼠气道T淋巴细胞亚群的变化
作者：江慧琳 李燕屏 周太原
单位：江慧琳 李燕屏 周太原 广州医学院第二附属医院(510260)
关键词：哮喘；T淋巴细胞；T淋巴细胞亚群；CD4淋巴细胞计数
实用医学杂志990742 摘 要 目的：研究哮喘小鼠气道组织T淋巴细胞亚群的变化。方法：卵蛋白致敏及激发制成小鼠哮喘模型，免疫组化方法测定小鼠气道组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞。结果：CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞均较正常对照组明显增多(P<0.01)，CD+4/CD+8亦较正常对照组增高(P<0.001)。结论：哮喘时气道T淋巴细胞的活化及浸润，辅助性T淋巴细胞与抑制性T淋巴细胞比例(CD+4/CD+8)的失衡是发生哮喘气道炎症的机制之一。
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支气管哮喘是多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病，浸润气道组织的炎性细胞以嗜酸粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞为主。在炎症过程中，T淋巴细胞起重要调节作用。不同亚群的T淋巴细胞在炎症过程中起不同的作用，它们共同调节免疫炎症过程。了解气道T淋巴细胞的变化是了解哮喘炎症过程的重要环节。因此，我们用免疫组化方法观察哮喘小鼠气道组织T淋巴细胞亚群的变化。
1 材料及方法
1.1 试剂 大鼠抗小鼠CD+4、CD+8单克隆抗体(购自邦定生物医学公司)，大鼠抗小鼠CD+25单克隆抗体(购自德国宝灵曼公司)，生物素标记的羊抗大鼠IgG及碱性磷酸酶标记的链亲和素(购自北京中山生物公司)，卵蛋白(购自美国SIGMA公司)。
1.2 动物模型制备 雄性C 57 BL/6小鼠6～8周龄12只，购自中山医科大学实验动物中心，随机分为哮喘组及正常对照组，每组6只。哮喘组用卵蛋白溶液(卵蛋白10 μg+AL(OH)32 mg+0.2 ml生理盐水)0.2 ml腹腔注射，2周后重复注射1次，第2次注射后14天，置小鼠于密闭容器中雾化吸入1%卵蛋白-生理盐水溶液30分钟，激发哮喘，每天1次共7天。对照组用生理盐水作腹腔注射及雾化吸入。两组最后1次吸入后48小时将小鼠颈椎脱臼处死，开胸取右肺组织，在4%多聚甲醛磷酸盐溶液固定后，分别用15%、30%蔗糖缓冲液脱水处理。恒冷切片机cryocut 1800(英国Reichert-Jung生产)冰冻切片，切片厚度为10 μm。
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1.3 免疫组化 按免疫组化(AEC)法进行肺组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞检测，用坚固红染色，苏木素复染。质控以PBS代替一抗作阴性对照及小鼠脾切片作为阳性对照，每个单抗做两片标本。
1.4 400倍光镜下观察结果 沿支气管粘膜下层计数每个高倍视野的阳性细胞数目，随机选取20个视野，得出阳性细胞数平均值。数据以
±s表示，两组比较采用t检验。
2 结果
经卵蛋白激发的哮喘小鼠气道组织CD+4、CD+8及CD+25T淋巴细胞数目较正常对照组明显增多，且CD+4/CD+8亦高于正常对照组，均有统计学意义(P<0.01)。见表1。
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表1 气道粘膜组织T淋巴细胞变化(±s，个/HP) 组别
例数
CD+4
CD+8
CD+4/CD+8
CD+25
正常组
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6
13.73±1.75
13.27±1.38
1.03±0.04
20.0±1.65
哮喘组
6
31.9±3.84
24.15±3.35
1.32±0.08
51.3±5.86
P<0.001
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P<0.001
P<0.001
P<0.001
3 讨论
业已证明，T淋巴细胞和嗜酸粒细胞是参与哮喘气道病变的主要炎症细胞，T淋巴细胞在免疫过程中起关键的调控作用。CD+4 T淋巴细胞促进体液免疫和细胞免疫，而CD+8 T淋巴细胞则抑制免疫反应，两者协同调节免疫应答。当T淋巴细胞被抗原激活后表达分化抗原CD+25(即CD+25细胞)，其中CD+4 T淋巴细胞占74%，CD+8 T淋巴细胞占13%[1]，标记T淋巴细胞活化。活化的T淋巴细胞(主要为CD+4细胞)合成并释放IL-4及IL-5等细胞因子，活化炎性细胞和调节其功能，触发炎症级联反应；前者可促进B淋巴细胞释放IgE，同时增加血管内皮细胞粘附因子(VCAM-1)的表达，促使嗜酸细胞向炎症部位浸润；后者则促进嗜酸细胞活化、增殖及募集，并释放各种炎症介质及蛋白酶类，导致气道粘膜损伤及气道高反应性。CD+25T淋巴细胞与疾病的严重程度成正相关[2]。因此，我们的实验选用CD+25T淋巴细胞作为气道炎症程度的标记。
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有实验表明，哮喘患者CD+4及CD+8 T淋巴细胞数目在支气管肺泡灌洗液(简称BAL)及外周血液中并无变化，而BAL的CD+25T淋巴细胞数目则较正常对照组明显增加，但外周血液的CD+25T淋巴细胞无变化[3]。Frew等[4]研究哮喘豚鼠在抗原激发后2～96小时不同时期的T淋巴细胞变化，发现哮喘豚鼠的外周血液和BAL的T淋巴细胞亚群CD+3、CD+8和T 4 BⅡ+(CD+4细胞)T淋巴细胞数目均无明显变化；在抗原激发后17～48小时期间支气管粘膜下层的CD+3及CD+3、CD-8 T淋巴细胞(主要代表CD+4 T淋巴细胞)明显增多，有统计学意义；CD+8 T淋巴细胞虽也增多，却无统计学意义。认为外周血液不能敏感地反映哮喘气道炎症的T淋巴细胞变化，BAL虽能提供气道炎症改变的一些信息，却常局限于反映气道粘膜表面的变化，而观察气道组织的T淋巴细胞浸润情况较能直接反映气道炎症的改变。Bradley等[5]的实验，哮喘患者气道组织标本的CD+3、CD+4、CD+8 T淋巴细胞有多于正常对照组的趋势，但无统计学意义；CD+25T淋巴细胞与EG+2嗜酸粒细胞(活化的嗜酸粒细胞)均明显高于正常对照组，有统计学意义；且CD+25T淋巴细胞与EG+2嗜酸粒细胞呈正相关。在我们的实验中，哮喘小鼠气道组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞数量较正常对照组明显增高，CD+4及CD+8比例较正常对照组明显增加，均有统计学意义。与前述的实验结果相似，说明哮喘炎症过程中辅助调节过度而抑制调节相对减弱。因此，气道组织中T淋巴细胞的活化而浸润，CD+4和CD+8 T淋巴细胞比例失衡是哮喘炎症发生的机制之一。我们推测应用抑制性T淋巴细胞活化及调节CD+4和CD+8 T淋巴细胞比例的药物，有望抑制哮喘气道炎症过程，从而达到治疗哮喘的目的。
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4 参考文献
1 陈海伦. 有关白介素2受体的一些新观点. 国外医学免疫学分册，1994，4：205～207.
2 Corrigan CJ,Kay AB. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Reationship to disease severity and atopic status. Am Rev Respir Dis,1990,141:970～977.
3 Wilson JW,Djukanovic R,Howarth PH,et al. Lymphocyte activation in bronchoalveolar Lavage and Peripheral blood in atopic asthma. Am Rev Respir Dis,1992,145:958～960.
, 百拇医药
4 Frew AJ,Mogbel R,Azzawi M,et al. T lymphocytes and Eosinophil in allergen induced late-phase asthmatic reactions in the guinea pig. Am Rev Respir Dis,1990,141:407～413.
5 Bradley BL,Azzawi M,Jacobson M,et al. Eosinophils T-lymphocytes,matecells,neutrephils,and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma:Comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol,1991,88:661～673., 百拇医药
单位：江慧琳 李燕屏 周太原 广州医学院第二附属医院(510260)
关键词：哮喘；T淋巴细胞；T淋巴细胞亚群；CD4淋巴细胞计数
实用医学杂志990742 摘 要 目的：研究哮喘小鼠气道组织T淋巴细胞亚群的变化。方法：卵蛋白致敏及激发制成小鼠哮喘模型，免疫组化方法测定小鼠气道组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞。结果：CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞均较正常对照组明显增多(P<0.01)，CD+4/CD+8亦较正常对照组增高(P<0.001)。结论：哮喘时气道T淋巴细胞的活化及浸润，辅助性T淋巴细胞与抑制性T淋巴细胞比例(CD+4/CD+8)的失衡是发生哮喘气道炎症的机制之一。
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支气管哮喘是多种炎性细胞参与的气道慢性炎症性疾病，浸润气道组织的炎性细胞以嗜酸粒细胞、淋巴细胞和肥大细胞为主。在炎症过程中，T淋巴细胞起重要调节作用。不同亚群的T淋巴细胞在炎症过程中起不同的作用，它们共同调节免疫炎症过程。了解气道T淋巴细胞的变化是了解哮喘炎症过程的重要环节。因此，我们用免疫组化方法观察哮喘小鼠气道组织T淋巴细胞亚群的变化。
1 材料及方法
1.1 试剂 大鼠抗小鼠CD+4、CD+8单克隆抗体(购自邦定生物医学公司)，大鼠抗小鼠CD+25单克隆抗体(购自德国宝灵曼公司)，生物素标记的羊抗大鼠IgG及碱性磷酸酶标记的链亲和素(购自北京中山生物公司)，卵蛋白(购自美国SIGMA公司)。
1.2 动物模型制备 雄性C 57 BL/6小鼠6～8周龄12只，购自中山医科大学实验动物中心，随机分为哮喘组及正常对照组，每组6只。哮喘组用卵蛋白溶液(卵蛋白10 μg+AL(OH)32 mg+0.2 ml生理盐水)0.2 ml腹腔注射，2周后重复注射1次，第2次注射后14天，置小鼠于密闭容器中雾化吸入1%卵蛋白-生理盐水溶液30分钟，激发哮喘，每天1次共7天。对照组用生理盐水作腹腔注射及雾化吸入。两组最后1次吸入后48小时将小鼠颈椎脱臼处死，开胸取右肺组织，在4%多聚甲醛磷酸盐溶液固定后，分别用15%、30%蔗糖缓冲液脱水处理。恒冷切片机cryocut 1800(英国Reichert-Jung生产)冰冻切片，切片厚度为10 μm。
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1.3 免疫组化 按免疫组化(AEC)法进行肺组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞检测，用坚固红染色，苏木素复染。质控以PBS代替一抗作阴性对照及小鼠脾切片作为阳性对照，每个单抗做两片标本。
1.4 400倍光镜下观察结果 沿支气管粘膜下层计数每个高倍视野的阳性细胞数目，随机选取20个视野，得出阳性细胞数平均值。数据以
±s表示，两组比较采用t检验。2 结果
经卵蛋白激发的哮喘小鼠气道组织CD+4、CD+8及CD+25T淋巴细胞数目较正常对照组明显增多，且CD+4/CD+8亦高于正常对照组，均有统计学意义(P<0.01)。见表1。
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表1 气道粘膜组织T淋巴细胞变化(
±s，个/HP) 组别例数
CD+4
CD+8
CD+4/CD+8
CD+25
正常组
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6
13.73±1.75
13.27±1.38
1.03±0.04
20.0±1.65
哮喘组
6
31.9±3.84
24.15±3.35
1.32±0.08
51.3±5.86
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3 讨论
业已证明，T淋巴细胞和嗜酸粒细胞是参与哮喘气道病变的主要炎症细胞，T淋巴细胞在免疫过程中起关键的调控作用。CD+4 T淋巴细胞促进体液免疫和细胞免疫，而CD+8 T淋巴细胞则抑制免疫反应，两者协同调节免疫应答。当T淋巴细胞被抗原激活后表达分化抗原CD+25(即CD+25细胞)，其中CD+4 T淋巴细胞占74%，CD+8 T淋巴细胞占13%[1]，标记T淋巴细胞活化。活化的T淋巴细胞(主要为CD+4细胞)合成并释放IL-4及IL-5等细胞因子，活化炎性细胞和调节其功能，触发炎症级联反应；前者可促进B淋巴细胞释放IgE，同时增加血管内皮细胞粘附因子(VCAM-1)的表达，促使嗜酸细胞向炎症部位浸润；后者则促进嗜酸细胞活化、增殖及募集，并释放各种炎症介质及蛋白酶类，导致气道粘膜损伤及气道高反应性。CD+25T淋巴细胞与疾病的严重程度成正相关[2]。因此，我们的实验选用CD+25T淋巴细胞作为气道炎症程度的标记。
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有实验表明，哮喘患者CD+4及CD+8 T淋巴细胞数目在支气管肺泡灌洗液(简称BAL)及外周血液中并无变化，而BAL的CD+25T淋巴细胞数目则较正常对照组明显增加，但外周血液的CD+25T淋巴细胞无变化[3]。Frew等[4]研究哮喘豚鼠在抗原激发后2～96小时不同时期的T淋巴细胞变化，发现哮喘豚鼠的外周血液和BAL的T淋巴细胞亚群CD+3、CD+8和T 4 BⅡ+(CD+4细胞)T淋巴细胞数目均无明显变化；在抗原激发后17～48小时期间支气管粘膜下层的CD+3及CD+3、CD-8 T淋巴细胞(主要代表CD+4 T淋巴细胞)明显增多，有统计学意义；CD+8 T淋巴细胞虽也增多，却无统计学意义。认为外周血液不能敏感地反映哮喘气道炎症的T淋巴细胞变化，BAL虽能提供气道炎症改变的一些信息，却常局限于反映气道粘膜表面的变化，而观察气道组织的T淋巴细胞浸润情况较能直接反映气道炎症的改变。Bradley等[5]的实验，哮喘患者气道组织标本的CD+3、CD+4、CD+8 T淋巴细胞有多于正常对照组的趋势，但无统计学意义；CD+25T淋巴细胞与EG+2嗜酸粒细胞(活化的嗜酸粒细胞)均明显高于正常对照组，有统计学意义；且CD+25T淋巴细胞与EG+2嗜酸粒细胞呈正相关。在我们的实验中，哮喘小鼠气道组织CD+4、CD+8、CD+25T淋巴细胞数量较正常对照组明显增高，CD+4及CD+8比例较正常对照组明显增加，均有统计学意义。与前述的实验结果相似，说明哮喘炎症过程中辅助调节过度而抑制调节相对减弱。因此，气道组织中T淋巴细胞的活化而浸润，CD+4和CD+8 T淋巴细胞比例失衡是哮喘炎症发生的机制之一。我们推测应用抑制性T淋巴细胞活化及调节CD+4和CD+8 T淋巴细胞比例的药物，有望抑制哮喘气道炎症过程，从而达到治疗哮喘的目的。
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4 参考文献
1 陈海伦. 有关白介素2受体的一些新观点. 国外医学免疫学分册，1994，4：205～207.
2 Corrigan CJ,Kay AB. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma. Reationship to disease severity and atopic status. Am Rev Respir Dis,1990,141:970～977.
3 Wilson JW,Djukanovic R,Howarth PH,et al. Lymphocyte activation in bronchoalveolar Lavage and Peripheral blood in atopic asthma. Am Rev Respir Dis,1992,145:958～960.
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4 Frew AJ,Mogbel R,Azzawi M,et al. T lymphocytes and Eosinophil in allergen induced late-phase asthmatic reactions in the guinea pig. Am Rev Respir Dis,1990,141:407～413.
5 Bradley BL,Azzawi M,Jacobson M,et al. Eosinophils T-lymphocytes,matecells,neutrephils,and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma:Comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness. J Allergy Clin Immunol,1991,88:661～673., 百拇医药