自制复方溶石剂1号的体外溶石及生物学毒性的实验研究
作者：吉毅峥 刘英棣 周明德 季金娣 陈建 刘超美 陈松旺
单位：吉毅峥(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；刘英棣(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；周明德(第二军医大学药学院有机化学教研室)；季金娣(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；陈建(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；刘超美(第二军医大学药学院有机化学教研室)；陈松旺(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)
关键词：介入超声；胆结石；溶石剂
中国医学影像技术000638[摘 要] 目的 评价复方溶石剂1号的溶石效果和毒性作用。方法 体外溶石效果实验和20只兔胆囊注射溶石剂后各时间段的血液生化指标变化及各脏器的病理改变。结果 复方溶石剂1号对500mg的胆固醇结石溶解时间少于25min(21±4.9min)，对动物的血液生化指标影响不大，除胆囊外未对全身其他脏器造成损害。结论 复方溶石剂1号是一种新型、安全、高效、低毒的胆固醇结石直接溶石剂。
, http://www.100md.com
[中图分类号] R445.1 R575.6+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1003-3289(2000)06-0500-03
Experimental Study on Litholytic Compounds No 1-Toxicity Test
on Rabbits and Litholysis Efficacy in Vitro
JI Yi-zheng,LIU Ying-di,ZHOU Ming-de, et al
(Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003, China)
, http://www.100md.com
[Abstract] Objective To evaluate the efficacy of gallstone dissolution in vitro and the toxicity of the No.1 litholytic compounds. Methods Experiments was performed to sutdy the efficacy of gallstone dissolution in vitro,after intra-gallbladder injection of No.1 litholytic compounds,the toxicity was studied both pathological and blood biochemical changes. Results the No.1 litholytic compounds dissolved the cholesterol gallstone(500mg)in no more than 25 min (21.6±4.9 min),less influence to blood biochemical,no harm to the other organs of rabbits except gallbadder. Conclusion The No.1 litholytic compounds is a new and safe cholesterol gallstone contact solvent with efficient and lower toxicity for treatment of cholecystolsithiasis.
, http://www.100md.com
[Key words] Interventional ultrasonography; Gallstone; Solvent of gallstone
胆结石是临床常见病，既往多采用手术疗法，但切除胆囊后可引起腹泻、胃炎、食管返流等症状，且对病人造成的损伤大[1]。因此，从80年代初开始，国内外进行了非手术疗法治疗胆结石的研究，采用的方法是应用介入手段将胆结石溶石剂直接注入胆囊或胆道内溶解胆结石[2]。因为各种介入方法特别是超声引导下胆囊或胆道穿刺置管术具有直观、简便、损伤小等优点，所以高效溶石剂的研制是关键所在。至今投入临床实验阶段的具有代表性的溶石剂如甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二甲基亚砜等都有一定的副作用，存在肺出血、肾损伤及溶石速度较慢等缺点，不能满足临床要求[3-5]。在此基础上我们进行了复方溶石剂1号的研制及体外和动物实验。
1 资料与方法
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实验动物为新西兰大白兔22只，雌雄各半，体重2.5～3.0kg，由第二军医大学动物实验中心提供。人胆结石样本包括胆固醇、混合性、胆色素结石，重0.15～1.5g，大小0.4～1.8cm,由上海长征医院普外科、江苏武警总队医院、河南偃师市人民医院提供。复方溶石剂1号由长征医院超声科和第二军医大学药学院有机化学教研室合作研制，主要成分为丙酸乙酯和甲基吡啶，呈无色透明液体，脂水双溶性，比重0.922，胆固醇溶解度289g/L(37℃)，pH值7.5；乙基叔丁基醚(ETBE)由第二军医大学药学院制备。血液生化指标由上海长征医院实验科使用美国贝克曼公司系列生化仪和ACX4系列试剂测定。动物脏器标本由第二军医大学病理教研室和上海长海医院病理科提供病理报告和显微照相。
(1)溶石剂体外溶石实验：将重500mg的胆固醇、混合性、胆色素结石各5粒与复方溶石剂1号和ETBE各5ml分别置于37℃水浴箱内的试管内，记录溶石时间。
(2)局部刺激性实验：取大白兔两只，分别将复方溶石剂1号和ETBE两滴点入兔一侧眼结膜囊内，观察记录兔的反应和结膜囊变化。
, 百拇医药
(3)生物学毒性实验：取大白兔20只随机分为对照组(ETBE)和实验组(复方溶石剂1号)，每组10只，术前禁食12小时，用3%戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉后，自耳静脉抽血2ml离心后血清送检，常规备皮、消毒后腹正中切口5cm进入腹腔，暴露胆囊后自底部进针，充分抽吸胆汁后，根据抽出的胆汁量注入溶石剂0.8～1.0ml，检查胆囊无渗漏及脏器无损伤后关腹，苏醒后常规饲养；将每组10只兔子随机分为5个时间段组，分别在术后饲养0.5、1、3、7、14天时同上麻醉后耳静脉取血2ml制血清留验；采用股动脉放血法处死，常规解剖，观察并记录脏器变化，将心、肺、肝、胆囊、胆总管、胃窦、十二指肠、脾、胰、肾、肾上腺、膀胱、睾丸(或卵巢、子宫)等送病检。
2 结果
2.1 复方溶石剂1号对胆固醇结石5min开始溶解，完全溶解最长需25min(21.6±4.9min)；混合性结石从15min表面开始崩解，30min后溶解遗留絮状胆色素残渣，完全溶解则需时2～3h；胆色素结石溶解需38～72h，使用自制直链聚磷酸钠(取白色结晶的磷酸氢二钠置于坩埚内加热至700℃以上呈液体时使其迅速冷却为透明玻璃样即可)处理胆色素结石后，溶解时间可缩短至20～48h。
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2.2 对照组ETBE和复方溶石剂1号滴入兔结膜囊后反应无明显差异，兔均安静，15min出现轻度充血水肿，随时间变化除分泌物增多外病变无进展，角膜无浑浊，未见溃疡形成，20h开始恢复，至48h后兔结膜囊正常。
2.3 复方溶石剂1号灌注胆囊的10只兔解剖后肝、胆囊、肺、心脏及其他脏器大体观无明显变化，腹腔无粘连；ETBE灌注胆囊的十只兔发现肺组织广泛出血，肝可见散在的点片状坏死灶，其余脏器未发现异常；各时间段的兔脏器有病理改变的结果见表1。
2.4 复方溶石剂1号灌注胆囊后血液生化指标中除AST轻度升高外，其他指标均无明显变化(P>0.5)；ETBE组除AKP、TBIL、DBIL、IBIL、CR/BU外，其它指标均有升高(P<0.5)(详见表2)。升高的几项指标三天以后随时间延长逐渐接近正常。
3 讨论
胆结石溶石剂是直接接触胆囊或胆管内结石而起作用，其副作用主要是对局部的刺激性和排入胆道吸收后对组织器官的毒性影响，脂溶性越大的物质越容易透过生物膜，造成的损害就越大。在筛选溶石剂的实验过程中发现脂水双溶的甲基吡啶溶石速度快于目前已发现的所有溶石剂(500mg的胆固醇结石溶解时间平均30min左右)，随后的毒性实验发现单一使用时毒性较大，才促使进行复方的研制。复方溶石剂1号是脂水双溶性的多种物质的复合物，因此其中各单一成分的浓度均较单用时明显降低，并且丙酸乙酯(EP)本身就是一种明显优于甲基叔丁醚(MTBE)和乙基叔丁醚(ETBE)高效低毒的胆固醇溶解剂，所以其毒性也就小的多。复方溶石剂1号的胆固醇溶解度(37℃)289g/L明显高于MTBE 的200g/L和ETBE的180g/L，是目前所知溶石剂中最高的。
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表1 两组各时间段有病变脏器的病理结果 时间段(天)
实验组
对照组
0.5
胆囊壁轻度局部出血坏死性炎，限于黏膜层
肺支气管淋巴结增生，胆囊腔内渗出，黏膜局部出血坏死性炎，肝小叶炎，胆管周围炎
1
胆囊黏膜层轻度出血伴炎细胞浸润
肺片状出血伴支气管淋巴结增生，胆囊局部出血坏死，腔内浆液渗出，肝片状出血坏死，胆管周围炎
3
, 百拇医药
胆囊局部出血伴浆液渗入囊腔
肺出血伴支气管淋巴结增生，胆囊壁灶性坏死伴囊内浆液渗出，肝轻度间质炎、小灶性炎伴小片状坏死，胆管炎伴纤维增生
7
胆囊黏膜基底部增生性修复
肺灶性出血伴支气管淋巴结增生，胆囊腔内浆液渗出，肝胆管轻度炎
14
肺淤血伴支气管淋巴结增生
表2 兔胆囊灌注溶石剂前与实验、对照组血液生化检验结果(单位：U/L) 项目
实验前
实验组
, 百拇医药
对照组
AST
25.79±14.17
37±29.8
50.28±61.08
AKP
63.27±33.53
67.31±35.21
61±33.57
TBIL
9.19±4.37
, 百拇医药 7.8±2.04
7.5±3.55
DBIL
3.29±3.15
3.25±2.91
3.34±3.26
IBIL
4.71±1.38
4.87±1.86
4.92±1.67
ALT
36.21±18.16
, http://www.100md.com
38±24.39
76.42±65.37
BUN
8.51±1.37
8.19±5.11
10.85±9.35
CREI
98.37±21.46
98.3±41.97
101±64.94
CR/BU
, http://www.100md.com
11.07±3.44
12.11±4.78
9.88±2.64
AMY
229.88±85.78
192.8±80.26
258±54.29
注：为P<0.5该数据与胆囊灌注前对比有明显差异
从实验结果来看，复方溶石剂1号的溶石效果是明显的，不但能快速溶解胆固醇结石，同时还具有一定的混合性结石和胆色素结石的溶解能力，这样就改善了以往溶石剂的单一功能。溶石速度明显快于甲基叔丁醚(MTBE)和乙基叔丁醚(ETBE)溶石所需的数小时；也快于单一丙酸乙酯溶解胆固醇结石的38～55min。
, 百拇医药
对脏器的毒性损害方面，复方溶石剂1号完全避免了肺出血、肾损伤和对十二指肠黏膜的腐蚀作用，仅对胆囊的黏膜层造成轻度的局灶性出血坏死性炎，而且7天时开始恢复性修复，14天恢复正常。ETBE对照组除对胆囊造成的损伤同实验组无明显差异外，在实验中形成的肝脏散在的局灶性坏死和广泛的肺组织出血与以往的文献报道不一致，前者在7天时基本恢复，但肺出血在14天时仍然存在；血液生化指标的结果表明相对于对照组，复方溶石剂1号是安全的，对其影响很小。对兔结膜囊的局部刺激结果显示两组溶石剂的腐蚀作用是有限的且恢复很快。
因为动物实验胆囊灌注溶石剂后最终全部被吸收，毒性相对来说是最大的。因此，我们设想溶石剂应用于临床时，在介入超声的引导监视下观察溶石效果，溶石剂在更换过程中顺胆道排出被吸收的量，在有限的时间内同样是有限的，并且最终胆囊内的溶石剂是完全被抽出的。如果在溶石的同时采用扩充血容量、利尿和缓泻等措施，相信毒性损害会较动物实验更低。
作者简介：吉毅峥(1964—)，男，河南人，在读硕士研究生，主治医师。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] A Hellstern,M Leuschner,H Frenk,et al. Gallstone dissolution with MTBE: How to avoid complications[J]. Gut,1990,31,922-925.
[2] 张志坚.内镜下逆行胆囊插管及直接溶石疗法[J].国外医学内科分册，1993，20(4)：150.
[3] 靳大川.胆结石直接溶石剂的研究进展[J].临床荟萃，1995，10(6)：246.
[4] S.F Zakko,J. C Scirica,C.F Guttermuth,et al. EP for GS dissolution:more effective and less cytotoxic than MTBE[J]. Gastroenterology,1992,102(4):A339.
[5] 郭绍红，张圣道，施瑞庭，等.乙基叔丁醚：新的胆固醇结石灌注溶解药物[J].中华消化杂志，1990，10(3)：143.
(收稿日期：2000-01-21), http://www.100md.com
单位：吉毅峥(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；刘英棣(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；周明德(第二军医大学药学院有机化学教研室)；季金娣(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；陈建(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)；刘超美(第二军医大学药学院有机化学教研室)；陈松旺(第二军医大学长征医院超声科，上海 200003)
关键词：介入超声；胆结石；溶石剂
中国医学影像技术000638[摘 要] 目的 评价复方溶石剂1号的溶石效果和毒性作用。方法 体外溶石效果实验和20只兔胆囊注射溶石剂后各时间段的血液生化指标变化及各脏器的病理改变。结果 复方溶石剂1号对500mg的胆固醇结石溶解时间少于25min(21±4.9min)，对动物的血液生化指标影响不大，除胆囊外未对全身其他脏器造成损害。结论 复方溶石剂1号是一种新型、安全、高效、低毒的胆固醇结石直接溶石剂。
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[中图分类号] R445.1 R575.6+2 [文献标识码] A
[文章编号] 1003-3289(2000)06-0500-03
Experimental Study on Litholytic Compounds No 1-Toxicity Test
on Rabbits and Litholysis Efficacy in Vitro
JI Yi-zheng,LIU Ying-di,ZHOU Ming-de, et al
(Changzheng Hospital,Second Military Medical University,Shanghai 200003, China)
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[Abstract] Objective To evaluate the efficacy of gallstone dissolution in vitro and the toxicity of the No.1 litholytic compounds. Methods Experiments was performed to sutdy the efficacy of gallstone dissolution in vitro,after intra-gallbladder injection of No.1 litholytic compounds,the toxicity was studied both pathological and blood biochemical changes. Results the No.1 litholytic compounds dissolved the cholesterol gallstone(500mg)in no more than 25 min (21.6±4.9 min),less influence to blood biochemical,no harm to the other organs of rabbits except gallbadder. Conclusion The No.1 litholytic compounds is a new and safe cholesterol gallstone contact solvent with efficient and lower toxicity for treatment of cholecystolsithiasis.
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[Key words] Interventional ultrasonography; Gallstone; Solvent of gallstone
胆结石是临床常见病，既往多采用手术疗法，但切除胆囊后可引起腹泻、胃炎、食管返流等症状，且对病人造成的损伤大[1]。因此，从80年代初开始，国内外进行了非手术疗法治疗胆结石的研究，采用的方法是应用介入手段将胆结石溶石剂直接注入胆囊或胆道内溶解胆结石[2]。因为各种介入方法特别是超声引导下胆囊或胆道穿刺置管术具有直观、简便、损伤小等优点，所以高效溶石剂的研制是关键所在。至今投入临床实验阶段的具有代表性的溶石剂如甲基叔丁基醚、乙基叔丁基醚、二甲基亚砜等都有一定的副作用，存在肺出血、肾损伤及溶石速度较慢等缺点，不能满足临床要求[3-5]。在此基础上我们进行了复方溶石剂1号的研制及体外和动物实验。
1 资料与方法
, http://www.100md.com
实验动物为新西兰大白兔22只，雌雄各半，体重2.5～3.0kg，由第二军医大学动物实验中心提供。人胆结石样本包括胆固醇、混合性、胆色素结石，重0.15～1.5g，大小0.4～1.8cm,由上海长征医院普外科、江苏武警总队医院、河南偃师市人民医院提供。复方溶石剂1号由长征医院超声科和第二军医大学药学院有机化学教研室合作研制，主要成分为丙酸乙酯和甲基吡啶，呈无色透明液体，脂水双溶性，比重0.922，胆固醇溶解度289g/L(37℃)，pH值7.5；乙基叔丁基醚(ETBE)由第二军医大学药学院制备。血液生化指标由上海长征医院实验科使用美国贝克曼公司系列生化仪和ACX4系列试剂测定。动物脏器标本由第二军医大学病理教研室和上海长海医院病理科提供病理报告和显微照相。
(1)溶石剂体外溶石实验：将重500mg的胆固醇、混合性、胆色素结石各5粒与复方溶石剂1号和ETBE各5ml分别置于37℃水浴箱内的试管内，记录溶石时间。
(2)局部刺激性实验：取大白兔两只，分别将复方溶石剂1号和ETBE两滴点入兔一侧眼结膜囊内，观察记录兔的反应和结膜囊变化。
, 百拇医药
(3)生物学毒性实验：取大白兔20只随机分为对照组(ETBE)和实验组(复方溶石剂1号)，每组10只，术前禁食12小时，用3%戊巴比妥钠1ml/kg静脉麻醉后，自耳静脉抽血2ml离心后血清送检，常规备皮、消毒后腹正中切口5cm进入腹腔，暴露胆囊后自底部进针，充分抽吸胆汁后，根据抽出的胆汁量注入溶石剂0.8～1.0ml，检查胆囊无渗漏及脏器无损伤后关腹，苏醒后常规饲养；将每组10只兔子随机分为5个时间段组，分别在术后饲养0.5、1、3、7、14天时同上麻醉后耳静脉取血2ml制血清留验；采用股动脉放血法处死，常规解剖，观察并记录脏器变化，将心、肺、肝、胆囊、胆总管、胃窦、十二指肠、脾、胰、肾、肾上腺、膀胱、睾丸(或卵巢、子宫)等送病检。
2 结果
2.1 复方溶石剂1号对胆固醇结石5min开始溶解，完全溶解最长需25min(21.6±4.9min)；混合性结石从15min表面开始崩解，30min后溶解遗留絮状胆色素残渣，完全溶解则需时2～3h；胆色素结石溶解需38～72h，使用自制直链聚磷酸钠(取白色结晶的磷酸氢二钠置于坩埚内加热至700℃以上呈液体时使其迅速冷却为透明玻璃样即可)处理胆色素结石后，溶解时间可缩短至20～48h。
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2.2 对照组ETBE和复方溶石剂1号滴入兔结膜囊后反应无明显差异，兔均安静，15min出现轻度充血水肿，随时间变化除分泌物增多外病变无进展，角膜无浑浊，未见溃疡形成，20h开始恢复，至48h后兔结膜囊正常。
2.3 复方溶石剂1号灌注胆囊的10只兔解剖后肝、胆囊、肺、心脏及其他脏器大体观无明显变化，腹腔无粘连；ETBE灌注胆囊的十只兔发现肺组织广泛出血，肝可见散在的点片状坏死灶，其余脏器未发现异常；各时间段的兔脏器有病理改变的结果见表1。
2.4 复方溶石剂1号灌注胆囊后血液生化指标中除AST轻度升高外，其他指标均无明显变化(P>0.5)；ETBE组除AKP、TBIL、DBIL、IBIL、CR/BU外，其它指标均有升高(P<0.5)(详见表2)。升高的几项指标三天以后随时间延长逐渐接近正常。
3 讨论
胆结石溶石剂是直接接触胆囊或胆管内结石而起作用，其副作用主要是对局部的刺激性和排入胆道吸收后对组织器官的毒性影响，脂溶性越大的物质越容易透过生物膜，造成的损害就越大。在筛选溶石剂的实验过程中发现脂水双溶的甲基吡啶溶石速度快于目前已发现的所有溶石剂(500mg的胆固醇结石溶解时间平均30min左右)，随后的毒性实验发现单一使用时毒性较大，才促使进行复方的研制。复方溶石剂1号是脂水双溶性的多种物质的复合物，因此其中各单一成分的浓度均较单用时明显降低，并且丙酸乙酯(EP)本身就是一种明显优于甲基叔丁醚(MTBE)和乙基叔丁醚(ETBE)高效低毒的胆固醇溶解剂，所以其毒性也就小的多。复方溶石剂1号的胆固醇溶解度(37℃)289g/L明显高于MTBE 的200g/L和ETBE的180g/L，是目前所知溶石剂中最高的。
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表1 两组各时间段有病变脏器的病理结果 时间段(天)
实验组
对照组
0.5
胆囊壁轻度局部出血坏死性炎，限于黏膜层
肺支气管淋巴结增生，胆囊腔内渗出，黏膜局部出血坏死性炎，肝小叶炎，胆管周围炎
1
胆囊黏膜层轻度出血伴炎细胞浸润
肺片状出血伴支气管淋巴结增生，胆囊局部出血坏死，腔内浆液渗出，肝片状出血坏死，胆管周围炎
3
, 百拇医药
胆囊局部出血伴浆液渗入囊腔
肺出血伴支气管淋巴结增生，胆囊壁灶性坏死伴囊内浆液渗出，肝轻度间质炎、小灶性炎伴小片状坏死，胆管炎伴纤维增生
7
胆囊黏膜基底部增生性修复
肺灶性出血伴支气管淋巴结增生，胆囊腔内浆液渗出，肝胆管轻度炎
14
肺淤血伴支气管淋巴结增生
表2 兔胆囊灌注溶石剂前与实验、对照组血液生化检验结果(单位：U/L) 项目
实验前
实验组
, 百拇医药
对照组
AST
25.79±14.17
37±29.8
50.28±61.08
AKP
63.27±33.53
67.31±35.21
61±33.57
TBIL
9.19±4.37
, 百拇医药 7.8±2.04
7.5±3.55
DBIL
3.29±3.15
3.25±2.91
3.34±3.26
IBIL
4.71±1.38
4.87±1.86
4.92±1.67
ALT
36.21±18.16
, http://www.100md.com
38±24.39
76.42±65.37
BUN
8.51±1.37
8.19±5.11
10.85±9.35
CREI
98.37±21.46
98.3±41.97
101±64.94
CR/BU
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11.07±3.44
12.11±4.78
9.88±2.64
AMY
229.88±85.78
192.8±80.26
258±54.29
注：为P<0.5该数据与胆囊灌注前对比有明显差异
从实验结果来看，复方溶石剂1号的溶石效果是明显的，不但能快速溶解胆固醇结石，同时还具有一定的混合性结石和胆色素结石的溶解能力，这样就改善了以往溶石剂的单一功能。溶石速度明显快于甲基叔丁醚(MTBE)和乙基叔丁醚(ETBE)溶石所需的数小时；也快于单一丙酸乙酯溶解胆固醇结石的38～55min。
, 百拇医药
对脏器的毒性损害方面，复方溶石剂1号完全避免了肺出血、肾损伤和对十二指肠黏膜的腐蚀作用，仅对胆囊的黏膜层造成轻度的局灶性出血坏死性炎，而且7天时开始恢复性修复，14天恢复正常。ETBE对照组除对胆囊造成的损伤同实验组无明显差异外，在实验中形成的肝脏散在的局灶性坏死和广泛的肺组织出血与以往的文献报道不一致，前者在7天时基本恢复，但肺出血在14天时仍然存在；血液生化指标的结果表明相对于对照组，复方溶石剂1号是安全的，对其影响很小。对兔结膜囊的局部刺激结果显示两组溶石剂的腐蚀作用是有限的且恢复很快。
因为动物实验胆囊灌注溶石剂后最终全部被吸收，毒性相对来说是最大的。因此，我们设想溶石剂应用于临床时，在介入超声的引导监视下观察溶石效果，溶石剂在更换过程中顺胆道排出被吸收的量，在有限的时间内同样是有限的，并且最终胆囊内的溶石剂是完全被抽出的。如果在溶石的同时采用扩充血容量、利尿和缓泻等措施，相信毒性损害会较动物实验更低。
作者简介：吉毅峥(1964—)，男，河南人，在读硕士研究生，主治医师。
, 百拇医药
[参考文献]
[1] A Hellstern,M Leuschner,H Frenk,et al. Gallstone dissolution with MTBE: How to avoid complications[J]. Gut,1990,31,922-925.
[2] 张志坚.内镜下逆行胆囊插管及直接溶石疗法[J].国外医学内科分册，1993，20(4)：150.
[3] 靳大川.胆结石直接溶石剂的研究进展[J].临床荟萃，1995，10(6)：246.
[4] S.F Zakko,J. C Scirica,C.F Guttermuth,et al. EP for GS dissolution:more effective and less cytotoxic than MTBE[J]. Gastroenterology,1992,102(4):A339.
[5] 郭绍红，张圣道，施瑞庭，等.乙基叔丁醚：新的胆固醇结石灌注溶解药物[J].中华消化杂志，1990，10(3)：143.
(收稿日期：2000-01-21), http://www.100md.com