卡铂引起的毛细胞四种酶的活性改变
作者：丁大连 郑向阳 王坚 孙伟 孙虹 Richard J.Salvi
单位：美国纽约州立大学耳聋及听力学研究中心(布法罗)
关键词：细胞化学；卡铂；内耳
听力学及言语疾病杂志990411 【摘要】 目的 探讨卡铂的耳毒性机理。方法 8只灰鼠中5只按100 mg/kg腹腔注射卡铂，3只作正常对照，注药后48小时处死。对分离的耳蜗基底膜进行了不同的细胞化学染色，反应结果在透射电镜下观察。结果 与对照耳相比，卡铂组的内毛细胞显示钙离子激活的ATP酶活性增强，而钠钾离子激活的ATP酶、碱性磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低；外毛细胞则显示钙离子激活的ATP酶和碱性磷酸酶的活性增强，葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低，而钠钾离子激活的ATP酶无明显改变。结论 毛细胞中一系列磷酸酶的活性变化提示卡铂引起的钙离子释放可能导致了离子紊乱和能量代谢的障碍。
, 百拇医药
Mechanisms of Carboplatin Ototoxicity Suggested by Cytochemical Analysis
Ding Dalian, Zheng Xiangyang, Wang Jian ,et al.
(Center for Hearing and Deafness ,State University of New York at Buffalo)
【Abstract】 Objective To examine the mechanisms of carboplatin ototoxicity.Methods Forty- eight hours following administration of Carboplatin(100 mg/kg),5 Carboplatin-treated chinchillas, together with 3controls,were sacrificed.After dissection of the organ of Corti,the samples were processed for a series of cytochemical staining,and observed under transmission electron microscopy.Results Compared to normal ears, the Carboplatin-treated ears showed increased Ca++-ATPase,decreased Na+K+-ATPase,alkaine phosphatase and glucose-6-phosphatase activities in inner cells.The outer hair cells,however,incurred increased activities of Ca++-ATPase and alkaline phosphatase,decreased activity of glucose-6-phosphatase with unchanged activity in Na+K+-ATPase.Conclusion The results suggest that the released calcium may result in ion inbalance and impediment of energy metabolism.
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【Key words】 Cytochemistry Carboplatin Inner ear
卡铂选择性破坏灰鼠内毛细胞的现象已为许多实验所证实[1.2]。最近的研究发现无论在耳蜗还是在前庭，卡铂的早期耳毒性损害都是始发于Ⅰ型传入神经末稍[3，4]。提示内毛细胞的破坏可能与其Ⅰ型传入神经系统的损害有关。另外，卡铂耳毒性早期特异性抑制灰鼠内毛细胞中脱氢酶活性的现象也说明能量代谢障碍可能是造成毛细胞坏死的重要原因[5]。文中用酶细胞化学技术观察了卡铂耳毒性作用早期所引起的毛细胞几种酶的变化。
1 材料与方法
1.1 动物与用药：5只成年灰鼠(体重在534～689 g)按照每公斤体重100 mg的剂量腹腔注射卡铂，用药后48 h处死。另外3只成年灰鼠做为正常对照。麻醉动物被断头后，迅速取出听泡。在蜗尖钻孔并打开蜗窗和前庭窗。从蜗尖孔灌入含1%戊二醛和4%甲醛的0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)，并将耳蜗浸入上述固定液于4℃冰箱内固定1小时。在0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)中分离取出基底膜。将基底膜切成几个片段以分别用于不同的酶细胞化学孵育反应。
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1.2 酶细胞化学反应：
1.2.1 钙离子激活的ATP酶(Ca++-activited ATPase) 孵育液含有80 mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.3)，8%蔗糖、2 mM硝酸铅、1 mM ATP、0.2mM硫酸镁和1 mM氯化钙。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育30 min。另一种基底膜片段浸入不含ATP底物的反应液温育相同的时间作为对照
1.2.2 钠钾离子激活的ATP酶(Na+K+-activited ATPase) 孵育液含有100 mM Tris-马来酸缓冲液(pH9.0)、20 mM氯化锶、10 mM氯化钾、10 mM氯化镁和5 mM对硝基苯硫酸钠。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育60 min，再用0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次，然后浸入2%硝酸铅溶液5 min，再以含有7.5%蔗糖的0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次。对照染色的基底膜段浸入含有10 mM乌本甘的孵育液温育相同的时间。
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1.2.3 碱性磷酸酶(Alkaine phosphatase) 孵育液含有2 ml 0.2 M Tris-马来酸缓冲液(pH 9.0)，2 ml 1.25%一甘油磷酸钠和1.3 ml 1%硝酸铅。样品在37℃孵育液中温育30 min，再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含β一甘油磷酸钠。
1.2.4 葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase) 孵育液含有40 mM Tris-马来酸缓冲液(pH 6.5)、10 mM葡萄糖-6-磷酸二钠盐、3.6 mM硝酸铅和30 mM蔗糖。样品在37℃孵育液中温育60 min后再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含葡萄糖-6-磷酸二钠盐。
1.3 电镜样品制备 将经细胞化学反应后的样品浸入1%四氧化锇二甲砷酸盐缓冲液后固定60 min再用缓冲液漂洗。然后经梯度酒精脱水后用Epon812包埋。常规制备超薄切片后不再行铅染和铀染，以避免非特异性高电子密度产物。透射电镜下观察酶细胞化学反应产物并摄影。
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2 结果
上述四种酶的对照染色均呈阴性，说明本组染色具有较好的组化反应专一性。钙离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内膜系统。在正常灰鼠的内外毛细胞中很少，而在卡铂耳中毒灰鼠的内外毛细胞中明显增多(图1)。钠钾离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内质网。正常灰鼠和卡铂耳中毒灰鼠的外毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶未见明显不同，但在内毛细胞和血管纹边缘细胞的钠钾离子激活的ATP酶明显减弱(图2)，碱性磷酸酶在卡铂耳中毒灰鼠的内毛细胞明显减弱，但在外毛细胞的内质网却有所增强(图3)，葡萄糖-6-磷酸酶主要定位在内质网和微粒体，卡铂耳中毒内外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶有所减弱(图4)。
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图1 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；C：正常对照灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶
图2 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
C：正常对照灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
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D：卡铂耳中毒灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
图3 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；
C：正常对照灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶；
D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶
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图4 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
C：正常对照灰鼠外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶
3 讨论
已经证实顺铂对内耳、肾脏、胃肠道、骨髓、性腺、外周神经系统和免疫系统有明显的毒性作用。卡铂做为抗肿瘤铂制剂的第二代产品，其耳毒性和肾毒性虽较其第一代产品顺铂轻，但仍然具有与顺铂相似的抗肿瘤作用和其它毒副作用。卡铂的耳毒性机理是目前尚未解决的热门课题之一。近来研究揭示了卡铂耳中毒的迅速发生不仅与Ⅰ型传入神经系统有关，而且与内毛细胞的能量代谢障碍有着密切的关系[5]。已经证实顺铂可以作用于肾脏导致血钙过低，由此抑制神经递质的释放并解聚收缩蛋白，造成离子代谢紊乱而导致某些组织中的细胞变性坏死[6]。本实验发现的一系列依赖于离子激活的水解酶的变化可能正是与细胞内的离子代谢紊乱有关。Aggarwal发现铂制剂在低氯浓度的水解过程可以引起氧化磷酸化解偶联而导致钙离子从线粒体自发性释放[6]。被释放出的钙离子可以引起细胞内的钙浓度升高，这种高钙环境势必抑制ATP的合成。本实验发现钙离子激活的ATP酶在卡铂注射后第二天明显增强。推测其原因之一可能是在卡铂早期耳中毒过程中，毛细胞内的高钙浓度激发了更强的钙离子激活的ATP酶的活性如同一种应激反应，其原因之二可能是在ATP合成障碍的情况下，底物的缺乏也反馈性激发了更强的酶活性。因此认为细胞内的高钙浓度和低ATP水平可能是造成钙离子激活的ATP酶活性在中毒早期有所增强的重要原因。
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内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶在卡铂注射后第二天明显减弱，但外毛细胞中未见明显改变。结合卡铂特异性抑制内毛细胞中脱氢酶活性的现象[5]，推测内毛细胞中能量的产生和利用环节可能均被抑制，能量危机可能是造成内毛细胞变性坏死的主要原因。在卡铂耳中毒早期内外毛细胞中钙离子激活的ATP酶活性有增强的表现，其中内毛细胞的改变较外毛细胞为重，但这种可能继发于细胞内钙离子浓度增高的现象显然仅仅影响了内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶系统，说明内毛细胞中的ATP水平在卡铂早期病变过程中可能十分低下，而外毛细胞的ATP水平可能无明显改变，提示钠钾离子激活的ATP酶并不是卡铂的特异性靶目标。本实验还发现血管纹边缘细胞内的钠钾离子激活的ATP酶活性在注药后第二天亦明显减弱，这有助于解释卡铂引起的血管纹的病理改变[1]。围绕Corti器的钾离子循环有内外两条途径，其外侧径路为从内毛细胞及其底部的神经末梢经外侧螺旋沟到达血管纹再循环到中阶，内侧径路为从内毛细胞及其内侧放射神经经内缘细胞、内侧螺旋沟细胞和齿间细胞再循环进入内淋巴[7]。从本实验中内毛细胞和血管纹中钠钾离子激活的ATP酶的改变可以看出耳蜗钾离子循环的内侧和外侧途径均被阻断，因此在卡铂耳中毒过程中可能发生的耳蜗内环境的改变也是一个不容忽视的问题。
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碱性磷酸酶催化各种醇和酚的磷酸酯水解。与细胞内磷酸浓度的维持和经膜吸收及转运的过程密切相关。实验发现在卡铂耳中毒早期，内毛细胞中的碱性磷酸酶活性明显减弱。鉴于此反应产物并非来自某一单一酶，而是与许多在碱性条件下催化磷酸单酯的磷酸酶有关。提示内毛细胞中可能有一系列在碱性环境下工作的磷酸酶被卡铂所抑制，这也许是内毛细胞被卡铂选择性破坏的原因之一。而外毛细胞中的碱性磷酸酶活性增强的现象则可能是由于离子紊乱而引起的相应的应激反应，或许有助于解释外毛细胞未被卡铂破坏的原因。
葡萄糖-6-磷酸酶是具有水解活性和变化活性的多机能酶，主要与微粒体结合定位于光面内质网，是糖代谢的关键酶。已经证实顺铂可以引起肾小管细胞中葡萄糖-6-磷酸酶的活性低下[6]。本实验在毛细胞中亦发现相同的现象，说明毛细胞中的糖代谢亦受到卡铂的影响。提示卡铂引起的氧化磷酸化解偶联可能是导致毛细胞中葡萄糖-6-磷酸酶活性变化的原因之一。
综上所述，卡铂引起毛细胞中一系列磷酸酶的变化，说明毛细胞的代谢改变早于其形态破坏。提示毛细胞内的离子代谢紊乱可能是一个重要的病变过程，尤其钙离子的活动很可能扮演了非常重要的角色，而能量代谢特别是糖代谢障碍显然也是一系列酶活性变化的重要原因。
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4 参考文献
1 Wake M,Takeno S,Tbrahim D,er al:Carboplatin ototoxicity:an animal model.J Laryngol Otol,1993,107:585.
2 Trautwein P, Hofstetter P, Wang J,et al.Selective inner hair cell loss does not alter distortion product otoacoustic emisseons.Hearing Res,1996,96:71.
3 Ding DL,Wang J,Hofstetter P,er al.Early damage in the chinchilla vestibular seneory epithelium from carboplatin.Audiology and Neuro-Otology,1997,2:155.
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4 丁大连，王坚，郑向阳，等.卡铂对灰鼠螺旋神经节的早期损害。听力学及言语疾病杂志，1998，6：65.
5 丁大连，王坚，胡博华，等.灰鼠耳蜗毛细胞脱氢酶活性在卡铂耳中毒的早期变化.听力学及言语疾病杂志，1998，6：20.
6 Aggarwal SK.A histochemical approach to the machanism of action of cisplatin and its analogues.J Histochem Cytochem,1993,41:1053.
7 Spicer SS,Schulte BA.Evidence for a medial K+recycling pathway from inner hair cells.Heraing Res,1998,98:1.
(1998-10-09收稿 1999-02-03修回), 百拇医药
单位：美国纽约州立大学耳聋及听力学研究中心(布法罗)
关键词：细胞化学；卡铂；内耳
听力学及言语疾病杂志990411 【摘要】 目的 探讨卡铂的耳毒性机理。方法 8只灰鼠中5只按100 mg/kg腹腔注射卡铂，3只作正常对照，注药后48小时处死。对分离的耳蜗基底膜进行了不同的细胞化学染色，反应结果在透射电镜下观察。结果 与对照耳相比，卡铂组的内毛细胞显示钙离子激活的ATP酶活性增强，而钠钾离子激活的ATP酶、碱性磷酸酶和葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低；外毛细胞则显示钙离子激活的ATP酶和碱性磷酸酶的活性增强，葡萄糖-6-磷酸酶的活性降低，而钠钾离子激活的ATP酶无明显改变。结论 毛细胞中一系列磷酸酶的活性变化提示卡铂引起的钙离子释放可能导致了离子紊乱和能量代谢的障碍。
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Ding Dalian, Zheng Xiangyang, Wang Jian ,et al.
(Center for Hearing and Deafness ,State University of New York at Buffalo)
【Abstract】 Objective To examine the mechanisms of carboplatin ototoxicity.Methods Forty- eight hours following administration of Carboplatin(100 mg/kg),5 Carboplatin-treated chinchillas, together with 3controls,were sacrificed.After dissection of the organ of Corti,the samples were processed for a series of cytochemical staining,and observed under transmission electron microscopy.Results Compared to normal ears, the Carboplatin-treated ears showed increased Ca++-ATPase,decreased Na+K+-ATPase,alkaine phosphatase and glucose-6-phosphatase activities in inner cells.The outer hair cells,however,incurred increased activities of Ca++-ATPase and alkaline phosphatase,decreased activity of glucose-6-phosphatase with unchanged activity in Na+K+-ATPase.Conclusion The results suggest that the released calcium may result in ion inbalance and impediment of energy metabolism.
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【Key words】 Cytochemistry Carboplatin Inner ear
卡铂选择性破坏灰鼠内毛细胞的现象已为许多实验所证实[1.2]。最近的研究发现无论在耳蜗还是在前庭，卡铂的早期耳毒性损害都是始发于Ⅰ型传入神经末稍[3，4]。提示内毛细胞的破坏可能与其Ⅰ型传入神经系统的损害有关。另外，卡铂耳毒性早期特异性抑制灰鼠内毛细胞中脱氢酶活性的现象也说明能量代谢障碍可能是造成毛细胞坏死的重要原因[5]。文中用酶细胞化学技术观察了卡铂耳毒性作用早期所引起的毛细胞几种酶的变化。
1 材料与方法
1.1 动物与用药：5只成年灰鼠(体重在534～689 g)按照每公斤体重100 mg的剂量腹腔注射卡铂，用药后48 h处死。另外3只成年灰鼠做为正常对照。麻醉动物被断头后，迅速取出听泡。在蜗尖钻孔并打开蜗窗和前庭窗。从蜗尖孔灌入含1%戊二醛和4%甲醛的0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)，并将耳蜗浸入上述固定液于4℃冰箱内固定1小时。在0.1 M二甲砷酸盐缓冲液(4℃)中分离取出基底膜。将基底膜切成几个片段以分别用于不同的酶细胞化学孵育反应。
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1.2 酶细胞化学反应：
1.2.1 钙离子激活的ATP酶(Ca++-activited ATPase) 孵育液含有80 mM Tris-马来酸缓冲液(pH7.3)，8%蔗糖、2 mM硝酸铅、1 mM ATP、0.2mM硫酸镁和1 mM氯化钙。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育30 min。另一种基底膜片段浸入不含ATP底物的反应液温育相同的时间作为对照
1.2.2 钠钾离子激活的ATP酶(Na+K+-activited ATPase) 孵育液含有100 mM Tris-马来酸缓冲液(pH9.0)、20 mM氯化锶、10 mM氯化钾、10 mM氯化镁和5 mM对硝基苯硫酸钠。将基底膜片段浸入上述孵育液在37℃恒温箱内温育60 min，再用0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次，然后浸入2%硝酸铅溶液5 min，再以含有7.5%蔗糖的0.2 M Tris-马来酸缓冲液漂洗标本3次。对照染色的基底膜段浸入含有10 mM乌本甘的孵育液温育相同的时间。
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1.2.3 碱性磷酸酶(Alkaine phosphatase) 孵育液含有2 ml 0.2 M Tris-马来酸缓冲液(pH 9.0)，2 ml 1.25%一甘油磷酸钠和1.3 ml 1%硝酸铅。样品在37℃孵育液中温育30 min，再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含β一甘油磷酸钠。
1.2.4 葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase) 孵育液含有40 mM Tris-马来酸缓冲液(pH 6.5)、10 mM葡萄糖-6-磷酸二钠盐、3.6 mM硝酸铅和30 mM蔗糖。样品在37℃孵育液中温育60 min后再用0.1 M二甲砷酸盐缓冲液漂洗。对照染色孵育液中不含葡萄糖-6-磷酸二钠盐。
1.3 电镜样品制备 将经细胞化学反应后的样品浸入1%四氧化锇二甲砷酸盐缓冲液后固定60 min再用缓冲液漂洗。然后经梯度酒精脱水后用Epon812包埋。常规制备超薄切片后不再行铅染和铀染，以避免非特异性高电子密度产物。透射电镜下观察酶细胞化学反应产物并摄影。
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2 结果
上述四种酶的对照染色均呈阴性，说明本组染色具有较好的组化反应专一性。钙离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内膜系统。在正常灰鼠的内外毛细胞中很少，而在卡铂耳中毒灰鼠的内外毛细胞中明显增多(图1)。钠钾离子激活的ATP酶主要定位在毛细胞的质膜和内质网。正常灰鼠和卡铂耳中毒灰鼠的外毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶未见明显不同，但在内毛细胞和血管纹边缘细胞的钠钾离子激活的ATP酶明显减弱(图2)，碱性磷酸酶在卡铂耳中毒灰鼠的内毛细胞明显减弱，但在外毛细胞的内质网却有所增强(图3)，葡萄糖-6-磷酸酶主要定位在内质网和微粒体，卡铂耳中毒内外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶有所减弱(图4)。
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图1 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；C：正常对照灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶；D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的钙离子激活的ATP酶
图2 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
C：正常对照灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
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D：卡铂耳中毒灰鼠血管纹细胞中的钠钾离子激活的ATP酶；
图3 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的碱性磷酸酶；
C：正常对照灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶；
D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的碱性磷酸酶
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图4 A：正常对照灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
B：卡铂耳中毒灰鼠内毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
C：正常对照灰鼠外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶；
D：卡铂耳中毒灰鼠外毛细胞中的葡萄糖-6-磷酸酶
3 讨论
已经证实顺铂对内耳、肾脏、胃肠道、骨髓、性腺、外周神经系统和免疫系统有明显的毒性作用。卡铂做为抗肿瘤铂制剂的第二代产品，其耳毒性和肾毒性虽较其第一代产品顺铂轻，但仍然具有与顺铂相似的抗肿瘤作用和其它毒副作用。卡铂的耳毒性机理是目前尚未解决的热门课题之一。近来研究揭示了卡铂耳中毒的迅速发生不仅与Ⅰ型传入神经系统有关，而且与内毛细胞的能量代谢障碍有着密切的关系[5]。已经证实顺铂可以作用于肾脏导致血钙过低，由此抑制神经递质的释放并解聚收缩蛋白，造成离子代谢紊乱而导致某些组织中的细胞变性坏死[6]。本实验发现的一系列依赖于离子激活的水解酶的变化可能正是与细胞内的离子代谢紊乱有关。Aggarwal发现铂制剂在低氯浓度的水解过程可以引起氧化磷酸化解偶联而导致钙离子从线粒体自发性释放[6]。被释放出的钙离子可以引起细胞内的钙浓度升高，这种高钙环境势必抑制ATP的合成。本实验发现钙离子激活的ATP酶在卡铂注射后第二天明显增强。推测其原因之一可能是在卡铂早期耳中毒过程中，毛细胞内的高钙浓度激发了更强的钙离子激活的ATP酶的活性如同一种应激反应，其原因之二可能是在ATP合成障碍的情况下，底物的缺乏也反馈性激发了更强的酶活性。因此认为细胞内的高钙浓度和低ATP水平可能是造成钙离子激活的ATP酶活性在中毒早期有所增强的重要原因。
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内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶在卡铂注射后第二天明显减弱，但外毛细胞中未见明显改变。结合卡铂特异性抑制内毛细胞中脱氢酶活性的现象[5]，推测内毛细胞中能量的产生和利用环节可能均被抑制，能量危机可能是造成内毛细胞变性坏死的主要原因。在卡铂耳中毒早期内外毛细胞中钙离子激活的ATP酶活性有增强的表现，其中内毛细胞的改变较外毛细胞为重，但这种可能继发于细胞内钙离子浓度增高的现象显然仅仅影响了内毛细胞中的钠钾离子激活的ATP酶系统，说明内毛细胞中的ATP水平在卡铂早期病变过程中可能十分低下，而外毛细胞的ATP水平可能无明显改变，提示钠钾离子激活的ATP酶并不是卡铂的特异性靶目标。本实验还发现血管纹边缘细胞内的钠钾离子激活的ATP酶活性在注药后第二天亦明显减弱，这有助于解释卡铂引起的血管纹的病理改变[1]。围绕Corti器的钾离子循环有内外两条途径，其外侧径路为从内毛细胞及其底部的神经末梢经外侧螺旋沟到达血管纹再循环到中阶，内侧径路为从内毛细胞及其内侧放射神经经内缘细胞、内侧螺旋沟细胞和齿间细胞再循环进入内淋巴[7]。从本实验中内毛细胞和血管纹中钠钾离子激活的ATP酶的改变可以看出耳蜗钾离子循环的内侧和外侧途径均被阻断，因此在卡铂耳中毒过程中可能发生的耳蜗内环境的改变也是一个不容忽视的问题。
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碱性磷酸酶催化各种醇和酚的磷酸酯水解。与细胞内磷酸浓度的维持和经膜吸收及转运的过程密切相关。实验发现在卡铂耳中毒早期，内毛细胞中的碱性磷酸酶活性明显减弱。鉴于此反应产物并非来自某一单一酶，而是与许多在碱性条件下催化磷酸单酯的磷酸酶有关。提示内毛细胞中可能有一系列在碱性环境下工作的磷酸酶被卡铂所抑制，这也许是内毛细胞被卡铂选择性破坏的原因之一。而外毛细胞中的碱性磷酸酶活性增强的现象则可能是由于离子紊乱而引起的相应的应激反应，或许有助于解释外毛细胞未被卡铂破坏的原因。
葡萄糖-6-磷酸酶是具有水解活性和变化活性的多机能酶，主要与微粒体结合定位于光面内质网，是糖代谢的关键酶。已经证实顺铂可以引起肾小管细胞中葡萄糖-6-磷酸酶的活性低下[6]。本实验在毛细胞中亦发现相同的现象，说明毛细胞中的糖代谢亦受到卡铂的影响。提示卡铂引起的氧化磷酸化解偶联可能是导致毛细胞中葡萄糖-6-磷酸酶活性变化的原因之一。
综上所述，卡铂引起毛细胞中一系列磷酸酶的变化，说明毛细胞的代谢改变早于其形态破坏。提示毛细胞内的离子代谢紊乱可能是一个重要的病变过程，尤其钙离子的活动很可能扮演了非常重要的角色，而能量代谢特别是糖代谢障碍显然也是一系列酶活性变化的重要原因。
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4 参考文献
1 Wake M,Takeno S,Tbrahim D,er al:Carboplatin ototoxicity:an animal model.J Laryngol Otol,1993,107:585.
2 Trautwein P, Hofstetter P, Wang J,et al.Selective inner hair cell loss does not alter distortion product otoacoustic emisseons.Hearing Res,1996,96:71.
3 Ding DL,Wang J,Hofstetter P,er al.Early damage in the chinchilla vestibular seneory epithelium from carboplatin.Audiology and Neuro-Otology,1997,2:155.
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4 丁大连，王坚，郑向阳，等.卡铂对灰鼠螺旋神经节的早期损害。听力学及言语疾病杂志，1998，6：65.
5 丁大连，王坚，胡博华，等.灰鼠耳蜗毛细胞脱氢酶活性在卡铂耳中毒的早期变化.听力学及言语疾病杂志，1998，6：20.
6 Aggarwal SK.A histochemical approach to the machanism of action of cisplatin and its analogues.J Histochem Cytochem,1993,41:1053.
7 Spicer SS,Schulte BA.Evidence for a medial K+recycling pathway from inner hair cells.Heraing Res,1998,98:1.
(1998-10-09收稿 1999-02-03修回), 百拇医药