HPLC分析庆大霉素发酵液C组份条件的探讨
作者：林小兰
单位：福建卫生学校
关键词：HPLC；庆大霉素发酵液；甲酸；质量控制
海峡药学990483 摘要 系统考察了HPLC分析庆大霉素发酵液C组份中各种因素的影响，如不同型号的ODS柱，不同的流动相配比，用甲酸代替冰醋酸以及不同的发酵液前处理方法等。在上述研究基础上建立的在Waters-Nova-Pak C18 4 μm 3.9×150 mm柱上，以庚烷磺酸钠浓度(5.0 g/L)甲醇∶水∶甲酸＝74∶21∶5为流动相系统，在20 min内即可完成样品分析，且C1峰与相邻杂质峰获得了良好分离。本法首次采用甲酸取代药典规定的流动相中的冰醋酸，使庆大霉素发酵液组份C1峰与相邻杂质峰的分离效果显著，为今后庆大霉素发酵液的质量控制及其质量标准的改进，提供了新的有效途径。
, 百拇医药
Study on the Conditions for HPLC Analysis on Component
C in Gentamicin Fermentation Broth
Lin Xiaolan
(Fujian Health School，Fujian)
Abstract Systematic study on HPLC analysis is carried out for factors，such as different type of ODS cohumn，proportion of mobile phase，using formic acid instead of glacial acetic acid and pre-treatment of fermentation broth，etc.，which impact the component C in gentamicin fermentation broth.Based on the result of above study，the following Waters-Nova-Pak system： Column：C18 4 μm 3.9×150 mm Mobile phase system： 5.0 g/L of heptane-sodium sulphonate methanol∶water∶formic acid＝74∶21∶5 has been established and the sample analysis can been completed within 20 minutes.Furthermore good separation of peak C1 and adjacent impurity peak has been obtained.It use formic acid instead of glacial acetic acid，which is described in pharmacopoeia，and better separation result has been obtaned.This provides a new effective way in quality control over gentamicin fermentation broth and in updating the quality criteria.
, 百拇医药
Key words HPLC Gentamicin Fermentation broth formic acid Quality control
庆大霉素是多组份的氨基糖甙类抗生素，4个主要成份为C1，C1a，C2a和C2。由于各组份具有不同的生物活性，C1组份毒副作用小，不易耐药，但疗效不如C2和C1a，而C2和C1a虽疗效高但毒性大且易耐药，为确保临床疗效，目前英、美、欧州等各国药典均采用HPLC法测定庆大霉素C组份的相对比率[1]。然而，庆大霉素C组份相对比率主要决定于菌种及发酵工艺控制，而与提炼过程关系不大[2]。采用HPLC测定庆大霉素发酵液C组份，其难度在于C1峰与大量的其它杂质峰重叠，影响了组份测定的准确性。本文通过分析各国药典现行庆大霉素C组份的HPLC法，考察了不同型号的ODS柱，流动相醇水比例，用甲酸代替冰醋酸及不同的前处理方法对庆大霉素C组份保留行为的影响，建立了以庚烷磺酸钠(5.0 g/L)[3]CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5为流动相系统成功地测定了庆大霉素发酵液C组份，使C1峰与杂质峰得到良好分离，且重现性好，RSD为C1 0.42%，C1a 0.41%，C2+C2a 0.54%。本法适用于庆大霉素发酵液的质量控制，并为庆大霉素产品质量标准的改进，提供了新的有效手段。
, http://www.100md.com
1 实验方法
1.1 药品与试剂
硫酸庆大霉素标准品(中国药品生物制品检定所)，硫酸庆大霉素(福州抗生素总厂)，庆大霉素发酵液(福州抗生素集团有限公司)，邻苯二醛，硫乙醇酸、庚烷磺酸钠、异丙醇、冰醋酸、甲酸、甲醇均为色谱纯。
1.2 HPLC系统
Beckman118型高效液相色谱仪，Beckman 166型紫外/可见光程控检测器。色谱柱：Waters Nova-Pak C18 4μm 3.9×150 mm。流速：1.0 ml/min。波长：330 nm进样量：20 μl。
1.3 方法[4]
样品经邻苯二醛试剂衍生化，以甲醇∶水∶甲酸＝74∶21∶5配制的庚烷磺酸钠溶液(5.0 g/l)为流动相，经色谱分离，采用归一化法计算各组份的百分数。
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2 结果与讨论
2.1 不同ODS柱的影响
以流动相甲醇∶水∶冰醋酸＝70∶25∶5，流速1.5 ml/min，测定3种不同产家的ODS柱对庆大C组份保留行为的影响(见表1)。
表1 不同ODS柱对庆大C组份保留行为的影响 ODS柱
保留时间(min)
C1
C1a
C2a
C2
, http://www.100md.com Beck man serial C18 5μ 4.6×250 mm
6.37
24.98
34.65
40.16
Waters Nova-Pak C18 4μ 3.9×150 mm
3.99
16.73
24.07
28.30
国产Kromasil C18 5μ 4.6×150 mm
, 百拇医药
5.66
24.45
35.18
41.73
该3种ODS柱对庆大霉素C组份的分离效果相当，但保留时间以Waters柱最合适。可见，采用Waters柱较为理想。
2.2 流动相中醇水比例的影响
庆大霉素C组份对流动相中醇水比例十分敏感(见表2)，甲醇浓度减少可使C1峰与相邻峰较好分离，但分析周期长。随着甲醇浓度增大，分析周期缩短，但C1峰与相邻峰重叠，相对保留时间以甲醇∶水＝74∶21为最佳[1]，分析周期恰当。表2 流动相中醇水比例的影响
, 百拇医药 CH3OH∶H2O
68∶27
70∶25
72∶23
74∶21
76∶19
保留
C1
6.96
5.09
4.11
3.69
, http://www.100md.com
2.64
时间
C1a
30.47
19.41
13.38
9.99
6.05
(min)
C2a
44.72
27.47
, 百拇医药 18.41
13.16
7.62
C2
52.47
32.33
21.63
15.42
8.93
相对
C1
0.13
0.16
, 百拇医药
0.19
0.24
0.30
保留
C1a
0.58
0.60
0.62
0.65
0.68
时间
C2a
0.85
, 百拇医药
0.85
0.85
0.85
0.85
(min)
C2
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
C1与相邻峰
基本分开
, http://www.100md.com
重叠
重叠
重叠
重叠
分离度
(R)
C2a与C2
>1.5
>1.5
>1.5
>1.5
>1.5
2.3 流动相中冰醋酸改为甲酸的影响
, 百拇医药
从流动相中甲醇比例降低有利于C1峰与相邻峰分离得到启发，将冰醋酸改为甲酸以增加流动相极性，达到了预期的分离效果，并分析了庆大霉素实际样品(见表3)。表3 冰醋酸改为甲酸的影响 进样次数
CH3OH∶H2O∶CH3COOH
＝74∶21∶5
CH3OH∶H2O∶HCOOH
＝74∶21∶5
C1
(%)
C1a
, http://www.100md.com
(%)
C2a+C2
(%)
C1
(%)
C1a
(%)
C2a+C2
(%)
1
22.1
29.0
, http://www.100md.com
48.6
26.0
28.4
45.6
2
22.9
28.8
48.3
26.3
28.0
45.7
3
23.1
, http://www.100md.com
28.7
48.2
26.5
28.2
45.3
RSD(%)
2.33
0.55
0.44
0.97
0.71
0.47
在甲醇∶水比例不变的前提下，将冰醋酸改为甲酸，C1峰与相邻峰能完全分开，且重现性好，结果更为准确。
, http://www.100md.com
2.4 庆大霉素发酵液不同前处理方法所测得的组份对照 对同一批发酵液用两种不同的预处理方法(Ⅰ、Ⅱ)进行处理。
方法Ⅰ：发酵液
酸化液过滤→滤液
pH6.8→取滤液适量配成约650 μg/ml的浓度→下同对照品[4]。
方法Ⅱ：发酵液酸化液
过滤滤液加适量活性炭振摇2min→过滤→取滤液适量配成约325 μg/ml的浓度→下同对照品[4]。结果(见表4、图1、2)。
, 百拇医药 表4 不同预处理方法的组份测定
方法C1(%)
C1a(%)
C2a+C2(%)
Ⅰ
30.2
29.9
39.9
Ⅱ
37.9
29.7
32.4
, 百拇医药
图1 发酵液预处理方法Ⅱ
图2 发酵液预处理方法Ⅰ
结果表明，发酵液预处理方法对组份测定影响极大。由图1、2可看出，方法Ⅰ未能把发酵液中足够的杂质除去，C1峰与大量的杂质峰重叠，造成误差大。而方法Ⅱ除去了发酵液中大量杂质，C1峰与相邻峰很好分离，基线回零，测定结果更为准确可靠。
2.5 用甲酸代替冰醋酸对发酵液C组份测定的影响
将发酵液用方法Ⅱ预处理，分别以CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5和CH3OH∶H2O∶CH3COOH＝74∶21∶5为流动相进行测定。结果(见表5、图1、3)。
, 百拇医药
表5 不同流动相组成的组份测定 进样针数
C1(%)
C1a(%)
C2a+C2(%)
CH3COOH
HCOOH
CH3COOH
HCOOH
CH3COOH
HCOOH
, http://www.100md.com
1
34.7
38.0
30.2
29.7
35.1
32.3
2
36.9
37.9
29.7
29.5
33.4
, 百拇医药
32.6
3
35.7
38.2
29.8
29.6
34.5
32.2
4
37.0
38.1
29.3
29.7
, 百拇医药
33.7
32.2
5
37.3
37.8
29.1
29.8
33.6
32.4
RSD(%)
3.01
0.42
1.46
, http://www.100md.com
0.41
2.10
0.54
图3 发酵液预处理方法Ⅱ
由表5、图1、3可看出，将流动相组成冰醋酸改为甲酸对庆大霉素发酵液C组份测定，C1峰与相邻峰完全分开，基线回零，且重现性好，RSD为C1 0.42% C2a 0.41% C2a+C2 0.54%，因而结果更为可靠。
3 小结
以庚烷磺酸钠(5.0 g/L)CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5为流动相系统，对庆大霉素样品及发酵液中C组份相对比率的测定，即可使C1峰与其相邻峰分开，又可使分析周期适当，20 min内可完成样品分析，且重现性好，结果准确可靠，为庆大霉素发酵液质量控制及其质量标准的改进，提供了新的有效途径。 参考文献
1.胡昌勤等：高效液相色谱流动相对庆大霉素C组份保留行为的影响 中国抗生素杂志 1994；19(1)∶21～24
2.陈梅玉等：庆大霉素中间体的HPLC测定 中国医药工业杂志 1994；25(2)∶66～68
3.陶巧凤等：HPLC分析庆大霉素组分条件的系统研究 现代应用药学 1994；11(6)∶31～33
4.中国药典 HPLC分析庆大霉素组分条件的系统研究 1995；二部：903, 百拇医药
单位：福建卫生学校
关键词：HPLC；庆大霉素发酵液；甲酸；质量控制
海峡药学990483 摘要 系统考察了HPLC分析庆大霉素发酵液C组份中各种因素的影响，如不同型号的ODS柱，不同的流动相配比，用甲酸代替冰醋酸以及不同的发酵液前处理方法等。在上述研究基础上建立的在Waters-Nova-Pak C18 4 μm 3.9×150 mm柱上，以庚烷磺酸钠浓度(5.0 g/L)甲醇∶水∶甲酸＝74∶21∶5为流动相系统，在20 min内即可完成样品分析，且C1峰与相邻杂质峰获得了良好分离。本法首次采用甲酸取代药典规定的流动相中的冰醋酸，使庆大霉素发酵液组份C1峰与相邻杂质峰的分离效果显著，为今后庆大霉素发酵液的质量控制及其质量标准的改进，提供了新的有效途径。
, 百拇医药
Study on the Conditions for HPLC Analysis on Component
C in Gentamicin Fermentation Broth
Lin Xiaolan
(Fujian Health School，Fujian)
Abstract Systematic study on HPLC analysis is carried out for factors，such as different type of ODS cohumn，proportion of mobile phase，using formic acid instead of glacial acetic acid and pre-treatment of fermentation broth，etc.，which impact the component C in gentamicin fermentation broth.Based on the result of above study，the following Waters-Nova-Pak system： Column：C18 4 μm 3.9×150 mm Mobile phase system： 5.0 g/L of heptane-sodium sulphonate methanol∶water∶formic acid＝74∶21∶5 has been established and the sample analysis can been completed within 20 minutes.Furthermore good separation of peak C1 and adjacent impurity peak has been obtained.It use formic acid instead of glacial acetic acid，which is described in pharmacopoeia，and better separation result has been obtaned.This provides a new effective way in quality control over gentamicin fermentation broth and in updating the quality criteria.
, 百拇医药
Key words HPLC Gentamicin Fermentation broth formic acid Quality control
庆大霉素是多组份的氨基糖甙类抗生素，4个主要成份为C1，C1a，C2a和C2。由于各组份具有不同的生物活性，C1组份毒副作用小，不易耐药，但疗效不如C2和C1a，而C2和C1a虽疗效高但毒性大且易耐药，为确保临床疗效，目前英、美、欧州等各国药典均采用HPLC法测定庆大霉素C组份的相对比率[1]。然而，庆大霉素C组份相对比率主要决定于菌种及发酵工艺控制，而与提炼过程关系不大[2]。采用HPLC测定庆大霉素发酵液C组份，其难度在于C1峰与大量的其它杂质峰重叠，影响了组份测定的准确性。本文通过分析各国药典现行庆大霉素C组份的HPLC法，考察了不同型号的ODS柱，流动相醇水比例，用甲酸代替冰醋酸及不同的前处理方法对庆大霉素C组份保留行为的影响，建立了以庚烷磺酸钠(5.0 g/L)[3]CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5为流动相系统成功地测定了庆大霉素发酵液C组份，使C1峰与杂质峰得到良好分离，且重现性好，RSD为C1 0.42%，C1a 0.41%，C2+C2a 0.54%。本法适用于庆大霉素发酵液的质量控制，并为庆大霉素产品质量标准的改进，提供了新的有效手段。
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1 实验方法
1.1 药品与试剂
硫酸庆大霉素标准品(中国药品生物制品检定所)，硫酸庆大霉素(福州抗生素总厂)，庆大霉素发酵液(福州抗生素集团有限公司)，邻苯二醛，硫乙醇酸、庚烷磺酸钠、异丙醇、冰醋酸、甲酸、甲醇均为色谱纯。
1.2 HPLC系统
Beckman118型高效液相色谱仪，Beckman 166型紫外/可见光程控检测器。色谱柱：Waters Nova-Pak C18 4μm 3.9×150 mm。流速：1.0 ml/min。波长：330 nm进样量：20 μl。
1.3 方法[4]
样品经邻苯二醛试剂衍生化，以甲醇∶水∶甲酸＝74∶21∶5配制的庚烷磺酸钠溶液(5.0 g/l)为流动相，经色谱分离，采用归一化法计算各组份的百分数。
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2 结果与讨论
2.1 不同ODS柱的影响
以流动相甲醇∶水∶冰醋酸＝70∶25∶5，流速1.5 ml/min，测定3种不同产家的ODS柱对庆大C组份保留行为的影响(见表1)。
表1 不同ODS柱对庆大C组份保留行为的影响 ODS柱
保留时间(min)
C1
C1a
C2a
C2
, http://www.100md.com Beck man serial C18 5μ 4.6×250 mm
6.37
24.98
34.65
40.16
Waters Nova-Pak C18 4μ 3.9×150 mm
3.99
16.73
24.07
28.30
国产Kromasil C18 5μ 4.6×150 mm
, 百拇医药
5.66
24.45
35.18
41.73
该3种ODS柱对庆大霉素C组份的分离效果相当，但保留时间以Waters柱最合适。可见，采用Waters柱较为理想。
2.2 流动相中醇水比例的影响
庆大霉素C组份对流动相中醇水比例十分敏感(见表2)，甲醇浓度减少可使C1峰与相邻峰较好分离，但分析周期长。随着甲醇浓度增大，分析周期缩短，但C1峰与相邻峰重叠，相对保留时间以甲醇∶水＝74∶21为最佳[1]，分析周期恰当。表2 流动相中醇水比例的影响
, 百拇医药 CH3OH∶H2O
68∶27
70∶25
72∶23
74∶21
76∶19
保留
C1
6.96
5.09
4.11
3.69
, http://www.100md.com
2.64
时间
C1a
30.47
19.41
13.38
9.99
6.05
(min)
C2a
44.72
27.47
, 百拇医药 18.41
13.16
7.62
C2
52.47
32.33
21.63
15.42
8.93
相对
C1
0.13
0.16
, 百拇医药
0.19
0.24
0.30
保留
C1a
0.58
0.60
0.62
0.65
0.68
时间
C2a
0.85
, 百拇医药
0.85
0.85
0.85
0.85
(min)
C2
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
C1与相邻峰
基本分开
, http://www.100md.com
重叠
重叠
重叠
重叠
分离度
(R)
C2a与C2
>1.5
>1.5
>1.5
>1.5
>1.5
2.3 流动相中冰醋酸改为甲酸的影响
, 百拇医药
从流动相中甲醇比例降低有利于C1峰与相邻峰分离得到启发，将冰醋酸改为甲酸以增加流动相极性，达到了预期的分离效果，并分析了庆大霉素实际样品(见表3)。表3 冰醋酸改为甲酸的影响 进样次数
CH3OH∶H2O∶CH3COOH
＝74∶21∶5
CH3OH∶H2O∶HCOOH
＝74∶21∶5
C1
(%)
C1a
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(%)
C2a+C2
(%)
C1
(%)
C1a
(%)
C2a+C2
(%)
1
22.1
29.0
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48.6
26.0
28.4
45.6
2
22.9
28.8
48.3
26.3
28.0
45.7
3
23.1
, http://www.100md.com
28.7
48.2
26.5
28.2
45.3
RSD(%)
2.33
0.55
0.44
0.97
0.71
0.47
在甲醇∶水比例不变的前提下，将冰醋酸改为甲酸，C1峰与相邻峰能完全分开，且重现性好，结果更为准确。
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2.4 庆大霉素发酵液不同前处理方法所测得的组份对照 对同一批发酵液用两种不同的预处理方法(Ⅰ、Ⅱ)进行处理。
方法Ⅰ：发酵液
酸化液过滤→滤液pH6.8→取滤液适量配成约650 μg/ml的浓度→下同对照品[4]。方法Ⅱ：发酵液
酸化液过滤滤液加适量活性炭振摇2min→过滤→取滤液适量配成约325 μg/ml的浓度→下同对照品[4]。结果(见表4、图1、2)。, 百拇医药 表4 不同预处理方法的组份测定
方法C1(%)
C1a(%)
C2a+C2(%)
Ⅰ
30.2
29.9
39.9
Ⅱ
37.9
29.7
32.4
, 百拇医药
图1 发酵液预处理方法Ⅱ
图2 发酵液预处理方法Ⅰ
结果表明，发酵液预处理方法对组份测定影响极大。由图1、2可看出，方法Ⅰ未能把发酵液中足够的杂质除去，C1峰与大量的杂质峰重叠，造成误差大。而方法Ⅱ除去了发酵液中大量杂质，C1峰与相邻峰很好分离，基线回零，测定结果更为准确可靠。
2.5 用甲酸代替冰醋酸对发酵液C组份测定的影响
将发酵液用方法Ⅱ预处理，分别以CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5和CH3OH∶H2O∶CH3COOH＝74∶21∶5为流动相进行测定。结果(见表5、图1、3)。
, 百拇医药
表5 不同流动相组成的组份测定 进样针数
C1(%)
C1a(%)
C2a+C2(%)
CH3COOH
HCOOH
CH3COOH
HCOOH
CH3COOH
HCOOH
, http://www.100md.com
1
34.7
38.0
30.2
29.7
35.1
32.3
2
36.9
37.9
29.7
29.5
33.4
, 百拇医药
32.6
3
35.7
38.2
29.8
29.6
34.5
32.2
4
37.0
38.1
29.3
29.7
, 百拇医药
33.7
32.2
5
37.3
37.8
29.1
29.8
33.6
32.4
RSD(%)
3.01
0.42
1.46
, http://www.100md.com
0.41
2.10
0.54
图3 发酵液预处理方法Ⅱ
由表5、图1、3可看出，将流动相组成冰醋酸改为甲酸对庆大霉素发酵液C组份测定，C1峰与相邻峰完全分开，基线回零，且重现性好，RSD为C1 0.42% C2a 0.41% C2a+C2 0.54%，因而结果更为可靠。
3 小结
以庚烷磺酸钠(5.0 g/L)CH3OH∶H2O∶HCOOH＝74∶21∶5为流动相系统，对庆大霉素样品及发酵液中C组份相对比率的测定，即可使C1峰与其相邻峰分开，又可使分析周期适当，20 min内可完成样品分析，且重现性好，结果准确可靠，为庆大霉素发酵液质量控制及其质量标准的改进，提供了新的有效途径。 参考文献
1.胡昌勤等：高效液相色谱流动相对庆大霉素C组份保留行为的影响 中国抗生素杂志 1994；19(1)∶21～24
2.陈梅玉等：庆大霉素中间体的HPLC测定 中国医药工业杂志 1994；25(2)∶66～68
3.陶巧凤等：HPLC分析庆大霉素组分条件的系统研究 现代应用药学 1994；11(6)∶31～33
4.中国药典 HPLC分析庆大霉素组分条件的系统研究 1995；二部：903, 百拇医药