川芎嗪对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
作者：雷平 李应续 雷亚宁 王秋桂 胡松林
单位：(咸宁医学院神经组化研究室，咸宁 437100)
关键词：大鼠；缺血/再灌注；丙二醛；腺苷三磷酸类；川芎嗪
咸宁医学院学报000203 摘 要 目的：观察大鼠海马CA—1区缺血再灌注损伤后MDA值和ATPase活性的动态变化及川芎嗪的保护作用。方法：Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭20min，造成不完全性脑缺血，松夹即为再灌注。大鼠随机分为假手术对照组(SOC)、缺血再灌注组(IR)和川芎嗪治疗组(TMP)。结果：① IR组MDA值再灌注6h后恢复对照水平，川芎嗪能显著降低异常增高的MDA值(P<0.01)。②IR组ATPase活性再灌注24h后恢复对照水平，川芎嗪能明显改善酶活性(P<0.01)，且能缩短酶活性恢复时程。结论：川芎嗪能减少大鼠脂质过氧化，改善ATPase功能，减轻海马结构缺血再灌注损伤。
, 百拇医药
中图分类号 R965 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0084-04
Protective Effects of Tetramethylphrazim on Cerebral
Ischemia-Reperfusion Damages in Rats
LEI Ping LI Yingxu LEI Yaning et al
(Department of Neurobiology,Xianning Medical College,Xianning 437100)
ABSTRACT Objective To observe the dynamic changes of malondialehyde(MDA) content and ATPase activity in the hippocampus structure in rat suffering from ischemia-reperfusion damage,and to investigate the protective effects of tetramethylphrazim(TMP).Methods An cerebral ischemia model of Wistar rats was getten by clipping bilatral carotide,and reperfusion was performed when the clips were released.Rats were randomly divided into sham operated control group(SOC),ischemia-reperfusion group(IR) and TMP-treated group(TMP).Rusults ①MDA content came back to the control level 6 hours after reperfusion in IR,and TMP can lower MDA content obviously(P<0.01)；②ATPase activity came back to the control level 24 hours after reperfusion in IR.TMP can improve ATPase activity(P<0.01) and shorten the period of the activity coming back.Conclusion TMP can reduce lipid peroxidation,improve ATPase activity and decrease neuronal damage in the IR injury of hippocampal structure.
, 百拇医药
KEY WORDS Ischemia/Reperfusion；Rats；Malondialehyde；Adenosine triphosphatase；Tetramethylphrazim
缺血—再灌注损伤的急性期，缺血缺氧能引发一系列错综复杂的损伤级联反应，以自由基损害、胞内钙超载和兴奋性毒性为中心环节，导致了离子平衡失调和内环境紊乱，而引起细胞死亡[1]。但有趣的是在轻度缺血再灌注损伤后数小时至24小时内，电解质和一些代谢性物质会恢复自稳态(即处于正常值水平)[2]。本实验试图观察再灌注损伤中的重要物质丙二醛和ATP酶活性的动态变化及自稳态恢复时间，以及川芎嗪的保护作用。
1 材料与方法
1.1动物
成年健康Wistar大鼠88只，雌雄不拘，体重180～220g，由本校动物室提供。
, 百拇医药
1.2 试剂
硫代巴比妥酸为上海化学试剂分装厂产品；丙二醛(Malondiadehyde，MDA)纯度97% ，德国产；ATP为Sigma公司产品；哇巴因(Ovnbain)为E.Mork公司产品；标准蛋白为上海东风试剂厂产品；盐酸川芎嗪注射液，无锡市第七制药厂生产。
1.3 实验方法
采用双侧颈总动脉夹闭法，造成简单的不完全大脑缺血模型，松夹即为再灌注。本实验采用10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉，切开颈部皮肤，分离暴露颈总动脉，以动脉夹夹闭20分钟，造成缺血，再松开动脉夹，造成再灌注。根据再灌注时程不同，在相应时间点上处死动物，取出双侧海马结构，解剖显微镜下切取CA—1区。大鼠随机分组为：①假手术对照组(SOC)8只，仅暴露双侧颈总动脉20min而不夹闭，1h后处死动物取材。②缺血—再灌注组(IR)，共40只，分为再灌注1h、6h、12h、24h、48h，每小组8只，各组松夹10min后按1ml/100g腹腔注射生理盐水，按时间点处死大鼠取材。③川芎嗪治疗组(TMP)，共40只，与各IR组相对应。松夹10min后按20mg/100g给予川芎嗪(5%葡萄糖2ml稀释)腹腔注射，按时间点取材。
, 百拇医药
1.4 观察指标
1.4.1 丙二醛(MDA)的测定
将切取的CA1区组织分析天平(上海天平仪器厂)称重后，以1:10(W/V)比例加入生理盐水，冰水浴中匀浆，匀浆置入试管，-20℃冰箱保存待测。具体方法参照Ohkawa[3]和Lowry[4]。
1.4.2 ATP酶(ATPase)的测定
4℃下在50倍体积的50mmol/L Tris盐酸缓冲液(PH7.4)中匀浆，Bradford法测定蛋白含量[5]，参照有关文献方法测定ATPase活性[6,7]，结果以μmol.pi/mg.pro.h表示。
, http://www.100md.com 1.5 数据处理
所有结果均以
±s表示，采用单因素方差分析处理，以P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1脑缺血再灌注损伤后海马CA—1区MDA含量的变化见表1。
IR组再灌注1h后MDA值明显升高(P<0.01)，6h后恢复至对照组水平，以后不再出现明显变化。TMP组与IR组比较，再灌注1h时，能明显降低MDA值(P<0.01)，但仍明显高于对照组水平(P<0.01)，再灌注6h、12h、24h、48h各组MDA值与相应IR组值和对照值比较差别无显著性。
2.2 脑缺血再灌注损伤后海马CA—1区Na+—K+—ATPase和Ca2+—ATPase活性的变化见表2和表3。
, http://www.100md.com
IR组再灌注1h、6h、12h的Na+—K+—ATPase和Ca2+—ATPase活性均明显低于对照值(P<0.05)，且随再灌注时间延续而逐渐恢复，至24h恢复接近对照组水平，以后无明显变化。TMP组再灌注1h后与IR组比较，能明显增强酶活性(P<0.01)，但仍显著低于对照组水平(P<0.01)；再灌注6h，酶活性比相应的IR组高(P<0.05)，较对照组水平低(P<0.05)；再灌注12h，酶活性比相应IR组高(P<0.01)，但已接近SOC组水平；再灌注24h、48h后与对应IR组和SOC组无明显差异。
表1 川芎嗪对海马CA1区MDA的影响(±s，n=8，mmol/ g.wet) 组 别
1h
, 百拇医药 6h
12h
24h
48h
SOC
82.61±12.98
IR
160.52±14.55*
80.11±13.99
80.44±13.01
79.16±12.25
80.30±13.41
, 百拇医药
TMP
108.14±11.42*△
76.52±12.19
77.34±13.27
76.72±11.93
76.87±12.11
与SOC组比较*P<0.01，与同时间点IR组比较△P<0.01表2 川芎嗪对海马CA1区Na+—K+ATPase活性的影响(±s,n=8,μmol.pi/mg.pro.h) 组 别
, 百拇医药
1h
6h
12h
24h
48h
SOC
0.528±0.015
IR
0.403±0.021*
0.458±0.033*
0.499±0.027*
0.534±0.021
, http://www.100md.com
0.529±0.029
TMP
0.459±0.029△*
0.497±0.031△*
0.537±0.018△
0.538±0.025
0.535±0.036
与SOC组比较*P<0.01，与同时间点IR组比较△P<0.01表3 川芎嗪对海马CA1区Ca2+—ATPase的影响(±s，n=8,μmol.pi/mg.pro.h) 组 别
, http://www.100md.com
1h
6h
12h
24h
48h
SOC
0.629±0.037
IR
0.418±0.059*
0.494±0.051*
0.583±0.034*
0.641±0.029
, 百拇医药
0.650±0.031
TMP
0.582±0.033△*
0.591±0.033△*
0.595±0.048
0.639±0.052
0.641±0.039
与SOC组比较*P<0.01，与同时点IR组比较△P<0.01
3 讨 论
氧自由基对细胞的损伤作用主要是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量的变化和组织损伤的程度。
, 百拇医药
本实验发现脑缺血后大鼠海马CA1区组织Na+—K+—ATPase、Ca2+—ATPase早期活性明显降低。ATPase主要存在于神经元膜上和线粒体内，通过水解ATP逆电化学梯度进行离子转运，是维持神经元兴奋传导，突触体传递和离子内环境稳定的物质基础。脑缺血后海马CA1区组织ATPase活性抑制可引起神经元细胞内的Na+、Ca2+聚积，K+流失，离子内环境紊乱，从而导致神经元损害[8,9]。近年来，Ca2+在神经元损害过程中的作用已日益受到重视，许多学者认为细胞内Ca2+超载是缺血性神经死亡的最后共同通路。细胞内Ca2+聚积可激活磷脂酶A2，导致膜磷脂降解产生游离脂肪酸，继而由花生四烯酸衍生为前列腺素和白三烯等活性物质破坏细胞功能；Ca2+增高还可以使Ca2+—CaM复合物调节的蛋白激酶，腺苷酸环化酶等功能失调，线粒体氧化磷酸化失偶联，能量生成减少，导致神经元代谢紊乱[8,9]。用川芎嗪治疗后，可以显著改善ATPase的功能，从而减轻海马结构缺血再灌注损伤。
, 百拇医药
实验观察到MDA值再灌注6h即恢复自稳态，以后不再显著变化；ATPase活性再灌注24h恢复至对照水平，以后不再明显变化，这些物质为什么会出现自稳态恢复现象，原因不甚明确，但有一点可以肯定，临床上提到的治疗缺血性脑损伤的“机会窗”与自稳态恢复时程密切相关[10]。在缺血缺氧损伤时，电解质和一些代谢物质浓度早期会异常紊乱，如果不用药物干涉，让其自然恢复稳态，在恢复过程中，可能已经启动了继发的损伤级联反应, 兴奋性毒性—梗死周围去极化—炎症—细胞凋亡[11]。即使紊乱的物质恢复了稳态，损伤已不可避免地启动并发展下去。神经保护药物如果能够缩短紊乱物质恢复自稳态的时程，减少引发损伤级联反应的机会，将会起到良好的神经保护作用。本实验所用川芎嗪给药时间为再灌注10min，完全处在各物质恢复自稳态之前，即处于治疗的最佳“机会窗”，可以清除氧自由基，减少缺血再灌注损伤时的脂质过氧化，增强ATPase活性，拮抗Ca2+超载，更重要的是它缩短了紊乱物质恢复自稳态的时程，有较好的脑保护效果。
收稿2000-02-12
, 百拇医药
单位：(咸宁医学院神经组化研究室，咸宁 437100)
关键词：大鼠；缺血/再灌注；丙二醛；腺苷三磷酸类；川芎嗪
咸宁医学院学报000203 摘 要 目的：观察大鼠海马CA—1区缺血再灌注损伤后MDA值和ATPase活性的动态变化及川芎嗪的保护作用。方法：Wistar大鼠双侧颈总动脉夹闭20min，造成不完全性脑缺血，松夹即为再灌注。大鼠随机分为假手术对照组(SOC)、缺血再灌注组(IR)和川芎嗪治疗组(TMP)。结果：① IR组MDA值再灌注6h后恢复对照水平，川芎嗪能显著降低异常增高的MDA值(P<0.01)。②IR组ATPase活性再灌注24h后恢复对照水平，川芎嗪能明显改善酶活性(P<0.01)，且能缩短酶活性恢复时程。结论：川芎嗪能减少大鼠脂质过氧化，改善ATPase功能，减轻海马结构缺血再灌注损伤。
, 百拇医药
中图分类号 R965 文献标识码 A
文章编号 1008-0635(2000)02-0084-04
Protective Effects of Tetramethylphrazim on Cerebral
Ischemia-Reperfusion Damages in Rats
LEI Ping LI Yingxu LEI Yaning et al
(Department of Neurobiology,Xianning Medical College,Xianning 437100)
ABSTRACT Objective To observe the dynamic changes of malondialehyde(MDA) content and ATPase activity in the hippocampus structure in rat suffering from ischemia-reperfusion damage,and to investigate the protective effects of tetramethylphrazim(TMP).Methods An cerebral ischemia model of Wistar rats was getten by clipping bilatral carotide,and reperfusion was performed when the clips were released.Rats were randomly divided into sham operated control group(SOC),ischemia-reperfusion group(IR) and TMP-treated group(TMP).Rusults ①MDA content came back to the control level 6 hours after reperfusion in IR,and TMP can lower MDA content obviously(P<0.01)；②ATPase activity came back to the control level 24 hours after reperfusion in IR.TMP can improve ATPase activity(P<0.01) and shorten the period of the activity coming back.Conclusion TMP can reduce lipid peroxidation,improve ATPase activity and decrease neuronal damage in the IR injury of hippocampal structure.
, 百拇医药
KEY WORDS Ischemia/Reperfusion；Rats；Malondialehyde；Adenosine triphosphatase；Tetramethylphrazim
缺血—再灌注损伤的急性期，缺血缺氧能引发一系列错综复杂的损伤级联反应，以自由基损害、胞内钙超载和兴奋性毒性为中心环节，导致了离子平衡失调和内环境紊乱，而引起细胞死亡[1]。但有趣的是在轻度缺血再灌注损伤后数小时至24小时内，电解质和一些代谢性物质会恢复自稳态(即处于正常值水平)[2]。本实验试图观察再灌注损伤中的重要物质丙二醛和ATP酶活性的动态变化及自稳态恢复时间，以及川芎嗪的保护作用。
1 材料与方法
1.1动物
成年健康Wistar大鼠88只，雌雄不拘，体重180～220g，由本校动物室提供。
, 百拇医药
1.2 试剂
硫代巴比妥酸为上海化学试剂分装厂产品；丙二醛(Malondiadehyde，MDA)纯度97% ，德国产；ATP为Sigma公司产品；哇巴因(Ovnbain)为E.Mork公司产品；标准蛋白为上海东风试剂厂产品；盐酸川芎嗪注射液，无锡市第七制药厂生产。
1.3 实验方法
采用双侧颈总动脉夹闭法，造成简单的不完全大脑缺血模型，松夹即为再灌注。本实验采用10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉，切开颈部皮肤，分离暴露颈总动脉，以动脉夹夹闭20分钟，造成缺血，再松开动脉夹，造成再灌注。根据再灌注时程不同，在相应时间点上处死动物，取出双侧海马结构，解剖显微镜下切取CA—1区。大鼠随机分组为：①假手术对照组(SOC)8只，仅暴露双侧颈总动脉20min而不夹闭，1h后处死动物取材。②缺血—再灌注组(IR)，共40只，分为再灌注1h、6h、12h、24h、48h，每小组8只，各组松夹10min后按1ml/100g腹腔注射生理盐水，按时间点处死大鼠取材。③川芎嗪治疗组(TMP)，共40只，与各IR组相对应。松夹10min后按20mg/100g给予川芎嗪(5%葡萄糖2ml稀释)腹腔注射，按时间点取材。
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1.4 观察指标
1.4.1 丙二醛(MDA)的测定
将切取的CA1区组织分析天平(上海天平仪器厂)称重后，以1:10(W/V)比例加入生理盐水，冰水浴中匀浆，匀浆置入试管，-20℃冰箱保存待测。具体方法参照Ohkawa[3]和Lowry[4]。
1.4.2 ATP酶(ATPase)的测定
4℃下在50倍体积的50mmol/L Tris盐酸缓冲液(PH7.4)中匀浆，Bradford法测定蛋白含量[5]，参照有关文献方法测定ATPase活性[6,7]，结果以μmol.pi/mg.pro.h表示。
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所有结果均以
±s表示，采用单因素方差分析处理，以P<0.05为有统计学意义。2 结 果
2.1脑缺血再灌注损伤后海马CA—1区MDA含量的变化见表1。
IR组再灌注1h后MDA值明显升高(P<0.01)，6h后恢复至对照组水平，以后不再出现明显变化。TMP组与IR组比较，再灌注1h时，能明显降低MDA值(P<0.01)，但仍明显高于对照组水平(P<0.01)，再灌注6h、12h、24h、48h各组MDA值与相应IR组值和对照值比较差别无显著性。
2.2 脑缺血再灌注损伤后海马CA—1区Na+—K+—ATPase和Ca2+—ATPase活性的变化见表2和表3。
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IR组再灌注1h、6h、12h的Na+—K+—ATPase和Ca2+—ATPase活性均明显低于对照值(P<0.05)，且随再灌注时间延续而逐渐恢复，至24h恢复接近对照组水平，以后无明显变化。TMP组再灌注1h后与IR组比较，能明显增强酶活性(P<0.01)，但仍显著低于对照组水平(P<0.01)；再灌注6h，酶活性比相应的IR组高(P<0.05)，较对照组水平低(P<0.05)；再灌注12h，酶活性比相应IR组高(P<0.01)，但已接近SOC组水平；再灌注24h、48h后与对应IR组和SOC组无明显差异。
表1 川芎嗪对海马CA1区MDA的影响(
±s，n=8，mmol/ g.wet) 组 别1h
, 百拇医药 6h
12h
24h
48h
SOC
82.61±12.98
IR
160.52±14.55*
80.11±13.99
80.44±13.01
79.16±12.25
80.30±13.41
, 百拇医药
TMP
108.14±11.42*△
76.52±12.19
77.34±13.27
76.72±11.93
76.87±12.11
与SOC组比较*P<0.01，与同时间点IR组比较△P<0.01表2 川芎嗪对海马CA1区Na+—K+ATPase活性的影响(
±s,n=8,μmol.pi/mg.pro.h) 组 别, 百拇医药
1h
6h
12h
24h
48h
SOC
0.528±0.015
IR
0.403±0.021*
0.458±0.033*
0.499±0.027*
0.534±0.021
, http://www.100md.com
0.529±0.029
TMP
0.459±0.029△*
0.497±0.031△*
0.537±0.018△
0.538±0.025
0.535±0.036
与SOC组比较*P<0.01，与同时间点IR组比较△P<0.01表3 川芎嗪对海马CA1区Ca2+—ATPase的影响(
±s，n=8,μmol.pi/mg.pro.h) 组 别, http://www.100md.com
1h
6h
12h
24h
48h
SOC
0.629±0.037
IR
0.418±0.059*
0.494±0.051*
0.583±0.034*
0.641±0.029
, 百拇医药
0.650±0.031
TMP
0.582±0.033△*
0.591±0.033△*
0.595±0.048
0.639±0.052
0.641±0.039
与SOC组比较*P<0.01，与同时点IR组比较△P<0.01
3 讨 论
氧自由基对细胞的损伤作用主要是引起生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，MDA作为氧自由基与生物膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的代谢产物，其含量的变化可间接地反映组织中氧自由基含量的变化和组织损伤的程度。
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本实验发现脑缺血后大鼠海马CA1区组织Na+—K+—ATPase、Ca2+—ATPase早期活性明显降低。ATPase主要存在于神经元膜上和线粒体内，通过水解ATP逆电化学梯度进行离子转运，是维持神经元兴奋传导，突触体传递和离子内环境稳定的物质基础。脑缺血后海马CA1区组织ATPase活性抑制可引起神经元细胞内的Na+、Ca2+聚积，K+流失，离子内环境紊乱，从而导致神经元损害[8,9]。近年来，Ca2+在神经元损害过程中的作用已日益受到重视，许多学者认为细胞内Ca2+超载是缺血性神经死亡的最后共同通路。细胞内Ca2+聚积可激活磷脂酶A2，导致膜磷脂降解产生游离脂肪酸，继而由花生四烯酸衍生为前列腺素和白三烯等活性物质破坏细胞功能；Ca2+增高还可以使Ca2+—CaM复合物调节的蛋白激酶，腺苷酸环化酶等功能失调，线粒体氧化磷酸化失偶联，能量生成减少，导致神经元代谢紊乱[8,9]。用川芎嗪治疗后，可以显著改善ATPase的功能，从而减轻海马结构缺血再灌注损伤。
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实验观察到MDA值再灌注6h即恢复自稳态，以后不再显著变化；ATPase活性再灌注24h恢复至对照水平，以后不再明显变化，这些物质为什么会出现自稳态恢复现象，原因不甚明确，但有一点可以肯定，临床上提到的治疗缺血性脑损伤的“机会窗”与自稳态恢复时程密切相关[10]。在缺血缺氧损伤时，电解质和一些代谢物质浓度早期会异常紊乱，如果不用药物干涉，让其自然恢复稳态，在恢复过程中，可能已经启动了继发的损伤级联反应, 兴奋性毒性—梗死周围去极化—炎症—细胞凋亡[11]。即使紊乱的物质恢复了稳态，损伤已不可避免地启动并发展下去。神经保护药物如果能够缩短紊乱物质恢复自稳态的时程，减少引发损伤级联反应的机会，将会起到良好的神经保护作用。本实验所用川芎嗪给药时间为再灌注10min，完全处在各物质恢复自稳态之前，即处于治疗的最佳“机会窗”，可以清除氧自由基，减少缺血再灌注损伤时的脂质过氧化，增强ATPase活性，拮抗Ca2+超载，更重要的是它缩短了紊乱物质恢复自稳态的时程，有较好的脑保护效果。
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