链霉素、庆大霉素和卡那霉素对豚鼠单个离体毛细胞活性影响的比较*
作者：余青松 师洪 汪吉宝 李桂榕
单位：同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022
关键词：毛细胞；抗生素类，氨基糖甙；耳毒性
同济医科大学学报990527 摘要 为比较氨基甙类抗生素对豚鼠单个离体外毛细胞和前庭毛细胞的影响，用酶解加机械分离方法获得单个离体的外毛细胞和前庭毛细胞，置于分别含有1 mmol/L的链霉素、庆大霉素和卡那霉素的培养液中短期培养，并以FDA-PI双染色法鉴定细胞活性。结果发现在仅含上述药物的培养液中，细胞活性无明显改变，而在无钙、镁培养液中3种药物均可引起细胞形态和活性的改变，其中链霉素和庆大霉素对前庭毛细胞活性影响较大，卡那霉素对外毛细胞活性影响较强。临床上链霉素可首选用于经外淋巴灌流治疗梅尼埃病。
中图法分类号 R322.9， R978.1
, 百拇医药
Comparative Studies on the Effect of Streptomycin, Gentamicin and Kanamycin
on Viability of Isolated Inner Ear Hair Cell from the Guinea Pig
Yu Qingsong, Shi Hong, Wang Jibao et al
Department of Otorhinolaryngology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract To compare the different toxicities of aminoglycosides antibiotics on isolated outer hair cell (OHC) and vestibular hair cells (VHC), OHCs and VHCs were isolated from guinea pigs by using collagenase digestion and mechanical dissection. These isolated internal ear hair cells were subjected to a short-term culture in the media containing 1 mmol/L streptomycin, gentamicin, kanamycin HBHBSS respectively, and their viability was identified by using fluorescein diacetate and propidium iodide double staining procedure. The results showed that the viability of the isolated internal ear hair cell in the media containing the above antibiotics had no obvious change, but the cell viability and morphology in free Ca2+/Mg2+ preparations were affected by gentamicin, streptomycin and kanamycin. Streptomycin and gentamicin had more otoxic on VHC than kanamycin, while kanamycin had more otoxic on OHC than streptomycin and gentamicin. These implied that streptomycin was the medicine of choice to treat Meriere's disease by perilymphatic perfusion.
, http://www.100md.com
Key words hair cell; aminoglycosides antibiotics; ototoxicity
国内外倡导用链霉素(SM)或庆大霉素(GM)作外淋巴灌流治疗梅尼埃病，其基本原理是利用它们对前庭终器产生毒性作用的同时，而又尽可能不损伤听终器[1～3]。SM和GM都有较强的前庭终器选择性毒性作用，而卡那霉素(KM)的耳毒性作用较强。为比较它们对前庭毛细胞(VHC)和耳蜗外毛细胞(OHC)的毒性作用，本实验利用前庭和耳蜗的单个离体活性毛细胞在体外短期培养，观察氨基甙类抗生素(AmAn)对它们活性的影响，初步探讨AmAn的耳毒性作用的机理，并为临床选择治疗梅尼埃病的药物提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂配备
①HBHBSS液；②无Ca2+/Mg2+HBHBSS液；③AmAn液：1 mmol/L GM+HBHBSS；1 mmol/L SM+HBHBSS；1 mmol/L KM+HBHBSS；④无Ca2+/Mg2+AmAn液：1 mmol/L GM+无Ca2+/Mg2+液；1 mmol/L SM+无Ca2+/Mg2+液；1 mmol/L KM+无Ca2+/Mg2+液。
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1.2 实验动物分组、细胞分离及处理
健康杂色豚鼠40只(武汉大学实验动物中心提供)，耳廓反射正常，体重200～250 g,雌雄不拘。用酶解加机械分离方法获得单离OHC和VHC，随机分成4组。
第1组：对照组，5只10耳，将OHC和VHC分别置入HBHBSS液中。第2组：对照组，5只10耳，将OHC和VHC分别置入无Ca2+/Mg2+液中。第3组:实验组，15只30耳，将OHC和VHC分别置于1 mmol/L GM+HBHBSS液(5只10耳)；1 mmol/L SM+HBHBSS液(5只10耳)；1 mmol/L KM+HBHBSS液(5只10耳)中。第4组:实验组，15只30耳，将OHC和VHC分别置1 mmol/L GM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)；1 mmol/L SM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)；1 mmol/L KM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)中。
, 百拇医药
1.3 细胞活性的鉴定及计数
根据余青松等[4]FDA-PI双染色法鉴别单离毛细胞活性的方法，在各组液体中加入FDA-PI染色液，在室温下计数分离后10 min及2 h具有活性的OHC和VHC数,并计算各组活性细胞的百分率。
2 结果
在倒置显微镜下分离的单个毛细胞的变性主要表现为细胞的肿胀，也可见萎病变性。FDA-PI双染色后在荧光显微镜下，活性细胞呈绿色，变性或死亡细胞核呈红色。
2.1 各因素对耳蜗OHC活性影响的比较
结果见表1。
表1 各因素对耳蜗OHC活性影响的比较(平均%±s，n=10)
, 百拇医药
.
A
B
C
D
E
F
G
H
分离后10 min
88±9.3
86±7.2*
85±4.2*
, http://www.100md.com
86±5.6
85±5.5
85±4.8*□
84±4.6*
86±4.2□
分离后2 h
80±4.5
77±6.5*
76±4.4*
76±4.8
74±5.6
, 百拇医药
48±7.5*□
40±8.3*
23±7.6□
A: HBHBSS B: 1 mmol/L GM HBHBSS
C: 1 mmol/L SM HBHBSS D: 1 mmol/L KM HBHBSS
E: 无Ca2+/Mg2+HBHBSS F: 1 mmol/L SM无Ca2+/Mg2+HBHBSS
G: 1 mmol/L GM无Ca2+/Mg2+HBHBSS H: 1 mmol/L KM无Ca2+/Mg2+HBHBSS
, 百拇医药
B组与G组，C组与F组比较 *P<0.05；D组与H组比较**P<0.01；F组与H组比较□P<0.05
2.2 各因素对VHC活性影响的比较
结果见表2。
表2 各因素对VHC活性影响的比较(平均% ±s, n=10)
.
A
B
C
D
E
, 百拇医药
F
G
H
分离后10min
89±7.5
87±6.8**
86±5.2**
89±5.2
85±4.8
85±4.2**□
87±5.6**
, 百拇医药 85±5.6□
分离后2h
81±6.0
78±5.6**
75±4.8**
81±4.8
75±3.6
28±9.6**□
27±8.7**
52±7.6□
A、B、C、D、E、F、G、H意义同表1。B组与G组、C组与F组比较 **P<0.01；D组与H组比较 *P<0.05；
, 百拇医药
F组与H组比较□P<0.05
2.3 无Ca2+/Mg2+AmAn液对OHC和VHC活性影响的比较
结果见表3。
表3 无Ca2+/Mg2+ AmAn液对OHC和VHC活性影响的比较(平均%±s, n=10)
细胞种类
无Ca2+/Mg2+SM液
无Ca2+/Mg2+GM液
无Ca2+/Mg2+KM液
, 百拇医药
VHC
分离后10min
8.5±4.2
87±5.6
85±5.6
.
分离后2h
28±9.6**
28±8.7*
52±7.8**
OHC
分离后10min
, http://www.100md.com
85±4.8
84±4.6
86±4.2
.
分离后2h
48±7.5**
40±8.3*
23±7.6**
VHC与OHC分离10 min与2 h差的比较 *P<0.05 **P<0.01
从以上三表经统计学处理后可得出，OHC和 VHC在含有GM、SM和KM的培养液中活性无明显影响，而在无Ca2+/Mg2+培养液中其活性受AmAn的影响，GM和SM对VHC影响大，它们之间无显著差异，KM对OHC影响较大。
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3 讨论
传统的动物在体模式对AmAn可能的耳毒机制的研究已有大量报道，但由于在体模式易受多种因素影响，且对细胞膜上的离子通道检测受到限制，所以AmAn的耳毒作用机制至今尚未阐明。自1967年Goldstein等[5]首次分离出保持活性的内耳毛细胞以来，离体内耳组织和单个细胞作为一种新的模式被用来研究AmAn的耳毒性作用。
Dulon等[6]将分离的单个外毛细胞置入含5 mmol/L的新霉素HBHBSS中，在光学显微镜下观察6 h，发现细胞活性无明显改变。本实验结果与之相似。Richardson[7]认为这可能是由于在细胞分离过程中底周的OHC不易分离及易受损伤，细胞悬液中所含的活性细胞大部分是顶周的OHC，而其对氨基甙类抗生素不敏感。Schacht[8]则认为引起毛细胞损伤的主要因素是AmAn的肝后代谢的中间产物，用AmAn直接作用于内耳毛细胞，不能引起细胞活性的改变。
, http://www.100md.com
近年来Schach等[8]研究发现，AmAn引起内耳毒性是经过多种环节的: 首先AmAn与内耳毛细胞膜以静电结合并中和膜上的静电，但这种作用可被二价阳离子抵消；第二步，AmAn与二价阳离子竞争细胞膜上的离子通道，使细胞结构发生改变；第三步，进入细胞内的药物与胞内的二磷酸磷脂肌醇(PIP2)结合并阻止其被特异性解脂酶C水解，由于细胞内的许多代谢过程依赖于磷酸肌醇的次级降解产物，这样AmAn进入细胞内，干扰了细胞的正常代谢，可引起细胞变性或死亡。
Dulon等[6]运用膜片钳技术测试，AmAn可影响毛细胞的钙离子通道。Richardson[7]用含1 mmol/L新霉素的低钙、低镁和高钙、高镁培养液作用于内耳毛细胞1 h，在光学显微镜下观察发现，在低钙、低镁时，AmAn可引起细胞形态和活性发生明显改变。而高钙、高镁时AmAn对细胞活性影响则不十分明显，AmAn引起毛细胞活性的改变能被钙、镁所抵消。Meyer等[9]动物实验研究也发现，膜迷路积水时，内、外淋巴液中的钙离子浓度可发生改变，而AmAn可使钙代谢紊乱而产生耳毒作用，两者可使耳毒性增强。
, 百拇医药
本实验在含有1 mmol/L AmAn的无钙、镁培养液中，观察药物对豚鼠单离OHC和VHC活性的影响来比较GM、SM、KM对耳锅及前庭的毒性作用，发现GM和SM对前庭毛细胞的活性影响较强，对外毛细胞活性影响较弱，而KM则相反，说明庆大霉素和链霉素有明显的前庭毒性，同时链霉素对耳蜗OHC影响较庆大霉素较弱，因此，链霉素可首选用于临床经外淋巴灌流治疗梅尼埃病。
*国家自然科学基金资助项目(No.39370734)
作者简介:余青松, 男, 1963年生, 副教授, 副主任医师。
参考文献
1 Yamashita T, Amano H, Harada N et al. Calcium distribution and mobilization during depolarization in single cochlear hair cells imaging microscopy and fura-z. Acta Otolaryngol, 1990,109:256
, 百拇医药
2 Ohmon H. Studies of ionic current in the isolated vestibular hair cell of the chick. J Physiol, 1984,350:561
3 Alfred L. Acute perilymphatic perfusion of the guinea pig cochlear. Hear Res, 1982,6:207
4 余青松, 师 洪, 汪吉宝. 双醋酸荧光素-碘化丙淀法鉴定单个离体毛细胞活性. 中华耳鼻咽喉杂志, 1995,30(3):152
5 Goldstein A J, Mizukoshi O. Separation of the organ of corti into its component cells. Ann Otol Rhinol Laryngol,1967,76:414
, 百拇医药
6 Dulon O, Zajic G, Aran J-M et al. Aminoglycosides antobiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res, 1989,24:338
7 Richardson G P, Russell I J. Cochlear cultures as a model system for study aminoglycosides induced ototoxicity. Hear Res, 1991,53:293
8 Schacht J. Molecular mechanisms of drug-induced hearing loss. Hear Res, 1986,22:297
9 Meyer Z, Kaufmann R. Is an Imbalanced calcium-homeostasis responsible for the expesimentally induced endolymphatic hydzops? Acta Otolaryngol, 1986,102:93
收稿日期:1998-12-31, http://www.100md.com
单位：同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022
关键词：毛细胞；抗生素类，氨基糖甙；耳毒性
同济医科大学学报990527 摘要 为比较氨基甙类抗生素对豚鼠单个离体外毛细胞和前庭毛细胞的影响，用酶解加机械分离方法获得单个离体的外毛细胞和前庭毛细胞，置于分别含有1 mmol/L的链霉素、庆大霉素和卡那霉素的培养液中短期培养，并以FDA-PI双染色法鉴定细胞活性。结果发现在仅含上述药物的培养液中，细胞活性无明显改变，而在无钙、镁培养液中3种药物均可引起细胞形态和活性的改变，其中链霉素和庆大霉素对前庭毛细胞活性影响较大，卡那霉素对外毛细胞活性影响较强。临床上链霉素可首选用于经外淋巴灌流治疗梅尼埃病。
中图法分类号 R322.9， R978.1
, 百拇医药
Comparative Studies on the Effect of Streptomycin, Gentamicin and Kanamycin
on Viability of Isolated Inner Ear Hair Cell from the Guinea Pig
Yu Qingsong, Shi Hong, Wang Jibao et al
Department of Otorhinolaryngology, Xiehe Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
Abstract To compare the different toxicities of aminoglycosides antibiotics on isolated outer hair cell (OHC) and vestibular hair cells (VHC), OHCs and VHCs were isolated from guinea pigs by using collagenase digestion and mechanical dissection. These isolated internal ear hair cells were subjected to a short-term culture in the media containing 1 mmol/L streptomycin, gentamicin, kanamycin HBHBSS respectively, and their viability was identified by using fluorescein diacetate and propidium iodide double staining procedure. The results showed that the viability of the isolated internal ear hair cell in the media containing the above antibiotics had no obvious change, but the cell viability and morphology in free Ca2+/Mg2+ preparations were affected by gentamicin, streptomycin and kanamycin. Streptomycin and gentamicin had more otoxic on VHC than kanamycin, while kanamycin had more otoxic on OHC than streptomycin and gentamicin. These implied that streptomycin was the medicine of choice to treat Meriere's disease by perilymphatic perfusion.
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Key words hair cell; aminoglycosides antibiotics; ototoxicity
国内外倡导用链霉素(SM)或庆大霉素(GM)作外淋巴灌流治疗梅尼埃病，其基本原理是利用它们对前庭终器产生毒性作用的同时，而又尽可能不损伤听终器[1～3]。SM和GM都有较强的前庭终器选择性毒性作用，而卡那霉素(KM)的耳毒性作用较强。为比较它们对前庭毛细胞(VHC)和耳蜗外毛细胞(OHC)的毒性作用，本实验利用前庭和耳蜗的单个离体活性毛细胞在体外短期培养，观察氨基甙类抗生素(AmAn)对它们活性的影响，初步探讨AmAn的耳毒性作用的机理，并为临床选择治疗梅尼埃病的药物提供依据。
1 材料和方法
1.1 试剂配备
①HBHBSS液；②无Ca2+/Mg2+HBHBSS液；③AmAn液：1 mmol/L GM+HBHBSS；1 mmol/L SM+HBHBSS；1 mmol/L KM+HBHBSS；④无Ca2+/Mg2+AmAn液：1 mmol/L GM+无Ca2+/Mg2+液；1 mmol/L SM+无Ca2+/Mg2+液；1 mmol/L KM+无Ca2+/Mg2+液。
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1.2 实验动物分组、细胞分离及处理
健康杂色豚鼠40只(武汉大学实验动物中心提供)，耳廓反射正常，体重200～250 g,雌雄不拘。用酶解加机械分离方法获得单离OHC和VHC，随机分成4组。
第1组：对照组，5只10耳，将OHC和VHC分别置入HBHBSS液中。第2组：对照组，5只10耳，将OHC和VHC分别置入无Ca2+/Mg2+液中。第3组:实验组，15只30耳，将OHC和VHC分别置于1 mmol/L GM+HBHBSS液(5只10耳)；1 mmol/L SM+HBHBSS液(5只10耳)；1 mmol/L KM+HBHBSS液(5只10耳)中。第4组:实验组，15只30耳，将OHC和VHC分别置1 mmol/L GM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)；1 mmol/L SM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)；1 mmol/L KM无Ca2+/Mg2+液(5只10耳)中。
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1.3 细胞活性的鉴定及计数
根据余青松等[4]FDA-PI双染色法鉴别单离毛细胞活性的方法，在各组液体中加入FDA-PI染色液，在室温下计数分离后10 min及2 h具有活性的OHC和VHC数,并计算各组活性细胞的百分率。
2 结果
在倒置显微镜下分离的单个毛细胞的变性主要表现为细胞的肿胀，也可见萎病变性。FDA-PI双染色后在荧光显微镜下，活性细胞呈绿色，变性或死亡细胞核呈红色。
2.1 各因素对耳蜗OHC活性影响的比较
结果见表1。
表1 各因素对耳蜗OHC活性影响的比较(平均%±s，n=10)
, 百拇医药
.
A
B
C
D
E
F
G
H
分离后10 min
88±9.3
86±7.2*
85±4.2*
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86±5.6
85±5.5
85±4.8*□
84±4.6*
86±4.2□
分离后2 h
80±4.5
77±6.5*
76±4.4*
76±4.8
74±5.6
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48±7.5*□
40±8.3*
23±7.6□
A: HBHBSS B: 1 mmol/L GM HBHBSS
C: 1 mmol/L SM HBHBSS D: 1 mmol/L KM HBHBSS
E: 无Ca2+/Mg2+HBHBSS F: 1 mmol/L SM无Ca2+/Mg2+HBHBSS
G: 1 mmol/L GM无Ca2+/Mg2+HBHBSS H: 1 mmol/L KM无Ca2+/Mg2+HBHBSS
, 百拇医药
B组与G组，C组与F组比较 *P<0.05；D组与H组比较**P<0.01；F组与H组比较□P<0.05
2.2 各因素对VHC活性影响的比较
结果见表2。
表2 各因素对VHC活性影响的比较(平均% ±s, n=10)
.
A
B
C
D
E
, 百拇医药
F
G
H
分离后10min
89±7.5
87±6.8**
86±5.2**
89±5.2
85±4.8
85±4.2**□
87±5.6**
, 百拇医药 85±5.6□
分离后2h
81±6.0
78±5.6**
75±4.8**
81±4.8
75±3.6
28±9.6**□
27±8.7**
52±7.6□
A、B、C、D、E、F、G、H意义同表1。B组与G组、C组与F组比较 **P<0.01；D组与H组比较 *P<0.05；
, 百拇医药
F组与H组比较□P<0.05
2.3 无Ca2+/Mg2+AmAn液对OHC和VHC活性影响的比较
结果见表3。
表3 无Ca2+/Mg2+ AmAn液对OHC和VHC活性影响的比较(平均%±s, n=10)
细胞种类
无Ca2+/Mg2+SM液
无Ca2+/Mg2+GM液
无Ca2+/Mg2+KM液
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VHC
分离后10min
8.5±4.2
87±5.6
85±5.6
.
分离后2h
28±9.6**
28±8.7*
52±7.8**
OHC
分离后10min
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85±4.8
84±4.6
86±4.2
.
分离后2h
48±7.5**
40±8.3*
23±7.6**
VHC与OHC分离10 min与2 h差的比较 *P<0.05 **P<0.01
从以上三表经统计学处理后可得出，OHC和 VHC在含有GM、SM和KM的培养液中活性无明显影响，而在无Ca2+/Mg2+培养液中其活性受AmAn的影响，GM和SM对VHC影响大，它们之间无显著差异，KM对OHC影响较大。
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3 讨论
传统的动物在体模式对AmAn可能的耳毒机制的研究已有大量报道，但由于在体模式易受多种因素影响，且对细胞膜上的离子通道检测受到限制，所以AmAn的耳毒作用机制至今尚未阐明。自1967年Goldstein等[5]首次分离出保持活性的内耳毛细胞以来，离体内耳组织和单个细胞作为一种新的模式被用来研究AmAn的耳毒性作用。
Dulon等[6]将分离的单个外毛细胞置入含5 mmol/L的新霉素HBHBSS中，在光学显微镜下观察6 h，发现细胞活性无明显改变。本实验结果与之相似。Richardson[7]认为这可能是由于在细胞分离过程中底周的OHC不易分离及易受损伤，细胞悬液中所含的活性细胞大部分是顶周的OHC，而其对氨基甙类抗生素不敏感。Schacht[8]则认为引起毛细胞损伤的主要因素是AmAn的肝后代谢的中间产物，用AmAn直接作用于内耳毛细胞，不能引起细胞活性的改变。
, http://www.100md.com
近年来Schach等[8]研究发现，AmAn引起内耳毒性是经过多种环节的: 首先AmAn与内耳毛细胞膜以静电结合并中和膜上的静电，但这种作用可被二价阳离子抵消；第二步，AmAn与二价阳离子竞争细胞膜上的离子通道，使细胞结构发生改变；第三步，进入细胞内的药物与胞内的二磷酸磷脂肌醇(PIP2)结合并阻止其被特异性解脂酶C水解，由于细胞内的许多代谢过程依赖于磷酸肌醇的次级降解产物，这样AmAn进入细胞内，干扰了细胞的正常代谢，可引起细胞变性或死亡。
Dulon等[6]运用膜片钳技术测试，AmAn可影响毛细胞的钙离子通道。Richardson[7]用含1 mmol/L新霉素的低钙、低镁和高钙、高镁培养液作用于内耳毛细胞1 h，在光学显微镜下观察发现，在低钙、低镁时，AmAn可引起细胞形态和活性发生明显改变。而高钙、高镁时AmAn对细胞活性影响则不十分明显，AmAn引起毛细胞活性的改变能被钙、镁所抵消。Meyer等[9]动物实验研究也发现，膜迷路积水时，内、外淋巴液中的钙离子浓度可发生改变，而AmAn可使钙代谢紊乱而产生耳毒作用，两者可使耳毒性增强。
, 百拇医药
本实验在含有1 mmol/L AmAn的无钙、镁培养液中，观察药物对豚鼠单离OHC和VHC活性的影响来比较GM、SM、KM对耳锅及前庭的毒性作用，发现GM和SM对前庭毛细胞的活性影响较强，对外毛细胞活性影响较弱，而KM则相反，说明庆大霉素和链霉素有明显的前庭毒性，同时链霉素对耳蜗OHC影响较庆大霉素较弱，因此，链霉素可首选用于临床经外淋巴灌流治疗梅尼埃病。
*国家自然科学基金资助项目(No.39370734)
作者简介:余青松, 男, 1963年生, 副教授, 副主任医师。
参考文献
1 Yamashita T, Amano H, Harada N et al. Calcium distribution and mobilization during depolarization in single cochlear hair cells imaging microscopy and fura-z. Acta Otolaryngol, 1990,109:256
, 百拇医药
2 Ohmon H. Studies of ionic current in the isolated vestibular hair cell of the chick. J Physiol, 1984,350:561
3 Alfred L. Acute perilymphatic perfusion of the guinea pig cochlear. Hear Res, 1982,6:207
4 余青松, 师 洪, 汪吉宝. 双醋酸荧光素-碘化丙淀法鉴定单个离体毛细胞活性. 中华耳鼻咽喉杂志, 1995,30(3):152
5 Goldstein A J, Mizukoshi O. Separation of the organ of corti into its component cells. Ann Otol Rhinol Laryngol,1967,76:414
, 百拇医药
6 Dulon O, Zajic G, Aran J-M et al. Aminoglycosides antobiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res, 1989,24:338
7 Richardson G P, Russell I J. Cochlear cultures as a model system for study aminoglycosides induced ototoxicity. Hear Res, 1991,53:293
8 Schacht J. Molecular mechanisms of drug-induced hearing loss. Hear Res, 1986,22:297
9 Meyer Z, Kaufmann R. Is an Imbalanced calcium-homeostasis responsible for the expesimentally induced endolymphatic hydzops? Acta Otolaryngol, 1986,102:93
收稿日期:1998-12-31, http://www.100md.com