白细胞介素1β对兔主动脉平滑肌细胞MCP-1及VCAM-1蛋白及mRNA表达的影响*
作者：阮秋蓉 宋建新 邓仲端
单位：阮秋蓉、邓促端：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030；宋建新：同济医科大学附属同济医院传染科，武汉 430030
关键词：白细胞介素1β；肌，平滑，血管；动脉粥样硬化
同济医科大学学报990501 摘要 白细胞介素1β(IL-1β)是一种参与动脉粥样硬化斑块形成的细胞因子。为了研究IL-1β在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Northern Blot法观察IL-1β对培养的兔主动脉平滑肌细胞(SMC)单核细胞趋化蛋白1( MCP-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)蛋白分泌及mRNA表达的影响。结果表明，IL-1β对兔主动脉SMC MCP-1的蛋白分泌和mRNA表达具有明显的诱导作用，而对VCAM-1表达则无明显影响。说明IL-1β可能通过诱导SMC表达MCP-1参与动脉粥样硬化斑块形成。
, 百拇医药
中图法分类号 R392.12, R322.7, R543.5
Effects of IL-1β on Expression of MCP-1 and VCAM-1 in
Rabbit Aortic Smooth Muscle Cells
Ruan Qiurong1, Song Jianxin2, Deng Zhongduan1
1 Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药 2 Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract In order to investigate the pathway of interleukin 1β(IL-1β) action, the effects of IL-1β on protein secretion as well as mRNA expression of monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) and vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) in cultured rabbit aortic smooth muscle cells (SMCs) were observed by using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Northern blot analysis. The results showed that IL-1β induced obviously protein secretion and mRNA expression of MCP-1 in the rabbit aortic SMCs, had no influence on VCAM-1 expression. It suggests that IL-1β might take part in the formation of atherosclerotic plaque by inducing MCP-1 expression.
, http://www.100md.com
Key words interleukin-1β; muscle, smooth, vascular; atherosclerosis
动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见病。已知动脉粥样硬化斑块中含有单核细胞源性和平滑肌细胞源性两种泡沫细胞，其中单核细胞源性泡沫细胞在内皮下间隙的聚集是动脉粥样硬化最早病变之一。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，单核细胞趋化因子1(monocyte chemotectic protein 1, MCP-1)和血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecular, VCAM-1)在招引血液单核细胞迁移至内皮下间隙起重要作用。近年研究表明，血管内皮细胞、平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)均能表达MCP-1及VCAM-1，而且其表达水平受许多因素调节。
白细胞介素1β(IL-1β)是一种参与动脉粥样硬化斑块形成的细胞因子，可由动脉壁内皮细胞、SMC产生[1]。为了研究IL-1β在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用， 我们采用酶联免疫吸附试验(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Northern Blot分析研究IL-1β对培养的兔主动脉SMC的MCP-1及 VCAM-1蛋白分泌及mRNA表达的影响，为动脉粥样硬化的发病机制提供新的实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞培养
采用酶消化法培养SMC。在无菌条件下取出正常日本大耳白兔胸主动脉中膜内层切成小块。37 ℃下依次用3 mg/L胶原酶( Sigma 公司)、1 g/L 弹性蛋白酶( Sigma 公司)及3 mg/L胶原酶消化3次，约1.5 h，直至组织块消失。1000 r/min 离心10 min后用含200 ml/L胎牛血清的M199培养液(Gibco公司)悬浮细胞并种于培养瓶，置37℃、50 ml/L CO2培养箱内培养。待SMC融合后，以1∶3的比例传代培养。细胞呈典型峰谷样结构。实验所用细胞为3至6代。
1.2 条件培养液的制备
待生长于24孔板内SMC融合后，用Hanks平衡盐溶液清洗2次，换成不含胎牛血清的新鲜M199，每孔0.5 ml，分别加或不加1 μg/L IL-1β(2×104 U/g， Otsuka公司)，置于37 ℃培养箱内继续孵育15 h，收集各组细胞培养上清液，10000 r/min离心去除细胞碎屑，贮存于-70 ℃待用。用细胞计数器计数每孔细胞总数。
, 百拇医药
1.3 条件培养液MCP-1和VCAM-1蛋白含量的测定
用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测对照组(不加IL-1β)和IL-1β组条件培养液MCP-1和VCAM-1蛋白含量。抗体为MCP-1和VCAM-1的多克隆抗体，方法按药盒说明书进行(Otsuka公司)。实验结果用t检验进行统计学处理。
1.4 Northern Blot分析
在融合SMC中加或不加1 μg/L IL-1β作用15 h后，用异硫氰酸胍方法分别提取对照组和IL-1β组细胞总RNA。各RNA样本经12 g/L凝胶电泳后转移到Duralon-UVTM尼龙膜上(Stratagene, USA)，57 ℃条件下预杂交2 h，然后换成含109 cpm/L α-32P标记cDNA探针的新鲜杂交液(50 mmol/L PIPES、100 mmol/L NaCl、50 mmol/L 磷酸钠、1 mmol/L EDTA、50 g/L SDS)，57 ℃杂交过夜。杂交膜在室温下用50 g/L SDS，1×SSC洗10 min，再于57℃下用同样溶液洗3次，每次20 min。置杂交膜于暗盒，用XAR-5 X光片于-70 ℃下自显影约12～48 h。自显影图像用密度仪扫描，测量各杂交带相对吸光度，以衡量各组细胞特异mRNA表达强度。杂交膜经煮沸的5 g/L SDS水溶液处理后用于再杂交。本实验所用探针为含兔MCP-1全部碱基对的cDNA探针和3.2 kb的VCAM-1 cDNA探针(日本福岛医科大学)。再杂交探针为兔GAPDH的cDNA探针，用以监测各样本量的一致性。探针用随机引物法按药盒说明书进行标记(Boehringer Mannheim公司, Germany)。
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2 结果
培养的兔主动脉SMC经1 μg/L的 IL-1β作用15 h，其条件培养液MCP-1蛋白含量明显增加〔(327±26) pg/105细胞〕，约为对照组〔(183±12) pg/105细胞〕的1.8倍(P<0.01，n=9)，差异有极显著意义，而对照组和IL-1β组的条件培养液中VCAM-1蛋白含量分别为(134±17)和(142±29) pg/105细胞，差异无显著意义(P>0.05， n=9)。
Northern Blot显示IL-1β可使培养SMC的MCP-1 mRNA表达增强，相对吸光度为对照组的197%，而IL-1β组VCAM-1 mRNA表达略有增强，Northern Blot结果与ELISA结果基本一致。其相对吸光度为对照组的109%(图1、2)。
, 百拇医药
图1 SMC MCP-1和VCAM-1 Northern印迹
图2 SMC MCP-1和VCAM-1 Northern印迹光密度
扫描
3 讨论
在动脉粥样硬化发生过程中，单核细胞向内皮下间隙的迁移受多种趋化因子的影响，其中作用最强的是MCP-1，它特异地作用于血液单核细胞，招引其迁移入内皮下间隙。此外，实验还表明，动脉内皮下间隙的单核细胞量与血管壁VCAM-1表达呈正相关[2]，VCAM-1等粘附分子不仅调节细胞的粘附，还介导细胞的迁移、吞噬和其它粘附依赖性功能。 因此，VCAM-1在单核细胞源性泡沫细胞形成过程中可能起重要作用。
, 百拇医药 血管壁内皮细胞、SMC表达MCP-1和VCAM-1受多种因素影响。据报道，轻微氧化修饰的低密度脂蛋白、白细胞介素-1(IL-1)、TNF、LPS等均能诱导动脉内皮细胞表达MCP-1和VCAM-1[3，4]。我们也曾证明，动脉粥样硬化的危险因素极低密度脂蛋白和氧化极低密度脂蛋白可诱导兔主动脉SMC表达MCP-1[5]。
血管SMC可通过自分泌和旁分泌方式释放细胞因子IL-1，而且IL-1β的水平远高于IL-1α。IL-1β具有多种生物学功能，它不仅能作用于血管内皮细胞，诱导其MCP-1和VCAM-1的表达，而且能与PDGF或单核细胞源性生长因子共同作用促进血管SMC增生；以浓度和时间依赖方式诱导单核细胞和中性粒细胞对血管SMC的粘附[6]。但IL-1β是否也影响SMC表达MCP-1 和VCAM-1，目前尚不清楚。本研究结果表明，IL-1β对兔主动脉SMC MCP-1的蛋白分泌和mRNA表达具有明显的诱导作用，但对其VCAM-1表达无明显影响。普遍认为，在血液单核细胞迁移入内皮下间隙过程中，内皮细胞分泌的MCP-1在动脉粥样硬化发生早期起关键作用，而SMC产生的MCP-1在动脉粥样硬化的各个时期都发挥重要作用[7]。 根据本研究结果，我们认为，IL-1β能通过诱导SMC表达MCP-1参与动脉粥样硬化斑块形成。然而，对单核细胞的迁移而言，内皮细胞VCAM-1的分泌可能比SMC VCAM-1的产生更重要， 因为单核细胞进入内皮下间隙前必须先粘附于内皮细胞表面。 IL-1β促进内皮细胞VCAM-1表达[3，8]，但不影响SMC的 VCAM-1 的表达，可能与此因素有关。
, http://www.100md.com
*国家自然科学基金资助项目(No.39730220)
作者简介：阮秋蓉，女，1964年生，医学博士。
参考文献
1 Moyer C F, Sajuthi D, Tulli H et al. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. Am J Pathol, 1991, 138:951
2 Fruebis J, Gonzalez V, Silvestre M et al. Effect of probucol treatment on gene expression of VCAM-1, MCP-1, and M-CSF in the aortic wall of LDL receptor-deficient rabbits during early atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17:1289
, 百拇医药
3 Haraldsen G, Kvale D, Lien B et al. Cytokine-regulated expression of E-selection, intercellular adhesion molecular-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human intestinal microvascular endothelial cells. J Immunol, 1996, 156:2588
4 Collins T. Endothelial nuclear factor-kappa B and the initiation of the atherosclerotic lesions. Lab Invest, 1993, 68:497
5 Ruan Q R, Deng Z D, Song J X. Very low density lipoprotein and oxidized very low density lipoprotein induce monocyte chemotactic protein 1 in rabbit aortic smooth muscle cells. Chin Med J, 1996, 109:206
, http://www.100md.com
6 Wang X, Feuerslein G Z Clark RK et al. Enhanced leucocyte adhesion to interleukin-1 beta stimulated vascular smooth muscle cells is mainly through intercellular adhesion molecule-1. Cardiovasc Res, 1994, 28:1808
7 Takeya M, Yoshimura T, Leonard E J et al. Detection of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerotic lesions by an anti-moonocyte chemoattractant protein-1 monoclonal antibody. Human Pathol, 1993, 24:534
8 Sironi M, Sciacca F L, Matteucci C et al. Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13: selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production. Blood, 1994, 84:19131
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药
单位：阮秋蓉、邓促端：同济医科大学基础医学院病理学教研室，武汉 430030；宋建新：同济医科大学附属同济医院传染科，武汉 430030
关键词：白细胞介素1β；肌，平滑，血管；动脉粥样硬化
同济医科大学学报990501 摘要 白细胞介素1β(IL-1β)是一种参与动脉粥样硬化斑块形成的细胞因子。为了研究IL-1β在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Northern Blot法观察IL-1β对培养的兔主动脉平滑肌细胞(SMC)单核细胞趋化蛋白1( MCP-1)和血管细胞粘附分子1(VCAM-1)蛋白分泌及mRNA表达的影响。结果表明，IL-1β对兔主动脉SMC MCP-1的蛋白分泌和mRNA表达具有明显的诱导作用，而对VCAM-1表达则无明显影响。说明IL-1β可能通过诱导SMC表达MCP-1参与动脉粥样硬化斑块形成。
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中图法分类号 R392.12, R322.7, R543.5
Effects of IL-1β on Expression of MCP-1 and VCAM-1 in
Rabbit Aortic Smooth Muscle Cells
Ruan Qiurong1, Song Jianxin2, Deng Zhongduan1
1 Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Tongji Medical University, Wuhan 430030
, 百拇医药 2 Department of Infectious Diseases, Tongji Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract In order to investigate the pathway of interleukin 1β(IL-1β) action, the effects of IL-1β on protein secretion as well as mRNA expression of monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) and vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) in cultured rabbit aortic smooth muscle cells (SMCs) were observed by using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Northern blot analysis. The results showed that IL-1β induced obviously protein secretion and mRNA expression of MCP-1 in the rabbit aortic SMCs, had no influence on VCAM-1 expression. It suggests that IL-1β might take part in the formation of atherosclerotic plaque by inducing MCP-1 expression.
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Key words interleukin-1β; muscle, smooth, vascular; atherosclerosis
动脉粥样硬化是严重危害人类健康的常见病。已知动脉粥样硬化斑块中含有单核细胞源性和平滑肌细胞源性两种泡沫细胞，其中单核细胞源性泡沫细胞在内皮下间隙的聚集是动脉粥样硬化最早病变之一。在动脉粥样硬化斑块形成过程中，单核细胞趋化因子1(monocyte chemotectic protein 1, MCP-1)和血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecular, VCAM-1)在招引血液单核细胞迁移至内皮下间隙起重要作用。近年研究表明，血管内皮细胞、平滑肌细胞(smooth muscle cell, SMC)均能表达MCP-1及VCAM-1，而且其表达水平受许多因素调节。
白细胞介素1β(IL-1β)是一种参与动脉粥样硬化斑块形成的细胞因子，可由动脉壁内皮细胞、SMC产生[1]。为了研究IL-1β在动脉粥样硬化斑块形成过程中的作用， 我们采用酶联免疫吸附试验(sandwich enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和Northern Blot分析研究IL-1β对培养的兔主动脉SMC的MCP-1及 VCAM-1蛋白分泌及mRNA表达的影响，为动脉粥样硬化的发病机制提供新的实验依据。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细胞培养
采用酶消化法培养SMC。在无菌条件下取出正常日本大耳白兔胸主动脉中膜内层切成小块。37 ℃下依次用3 mg/L胶原酶( Sigma 公司)、1 g/L 弹性蛋白酶( Sigma 公司)及3 mg/L胶原酶消化3次，约1.5 h，直至组织块消失。1000 r/min 离心10 min后用含200 ml/L胎牛血清的M199培养液(Gibco公司)悬浮细胞并种于培养瓶，置37℃、50 ml/L CO2培养箱内培养。待SMC融合后，以1∶3的比例传代培养。细胞呈典型峰谷样结构。实验所用细胞为3至6代。
1.2 条件培养液的制备
待生长于24孔板内SMC融合后，用Hanks平衡盐溶液清洗2次，换成不含胎牛血清的新鲜M199，每孔0.5 ml，分别加或不加1 μg/L IL-1β(2×104 U/g， Otsuka公司)，置于37 ℃培养箱内继续孵育15 h，收集各组细胞培养上清液，10000 r/min离心去除细胞碎屑，贮存于-70 ℃待用。用细胞计数器计数每孔细胞总数。
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1.3 条件培养液MCP-1和VCAM-1蛋白含量的测定
用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测对照组(不加IL-1β)和IL-1β组条件培养液MCP-1和VCAM-1蛋白含量。抗体为MCP-1和VCAM-1的多克隆抗体，方法按药盒说明书进行(Otsuka公司)。实验结果用t检验进行统计学处理。
1.4 Northern Blot分析
在融合SMC中加或不加1 μg/L IL-1β作用15 h后，用异硫氰酸胍方法分别提取对照组和IL-1β组细胞总RNA。各RNA样本经12 g/L凝胶电泳后转移到Duralon-UVTM尼龙膜上(Stratagene, USA)，57 ℃条件下预杂交2 h，然后换成含109 cpm/L α-32P标记cDNA探针的新鲜杂交液(50 mmol/L PIPES、100 mmol/L NaCl、50 mmol/L 磷酸钠、1 mmol/L EDTA、50 g/L SDS)，57 ℃杂交过夜。杂交膜在室温下用50 g/L SDS，1×SSC洗10 min，再于57℃下用同样溶液洗3次，每次20 min。置杂交膜于暗盒，用XAR-5 X光片于-70 ℃下自显影约12～48 h。自显影图像用密度仪扫描，测量各杂交带相对吸光度，以衡量各组细胞特异mRNA表达强度。杂交膜经煮沸的5 g/L SDS水溶液处理后用于再杂交。本实验所用探针为含兔MCP-1全部碱基对的cDNA探针和3.2 kb的VCAM-1 cDNA探针(日本福岛医科大学)。再杂交探针为兔GAPDH的cDNA探针，用以监测各样本量的一致性。探针用随机引物法按药盒说明书进行标记(Boehringer Mannheim公司, Germany)。
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2 结果
培养的兔主动脉SMC经1 μg/L的 IL-1β作用15 h，其条件培养液MCP-1蛋白含量明显增加〔(327±26) pg/105细胞〕，约为对照组〔(183±12) pg/105细胞〕的1.8倍(P<0.01，n=9)，差异有极显著意义，而对照组和IL-1β组的条件培养液中VCAM-1蛋白含量分别为(134±17)和(142±29) pg/105细胞，差异无显著意义(P>0.05， n=9)。
Northern Blot显示IL-1β可使培养SMC的MCP-1 mRNA表达增强，相对吸光度为对照组的197%，而IL-1β组VCAM-1 mRNA表达略有增强，Northern Blot结果与ELISA结果基本一致。其相对吸光度为对照组的109%(图1、2)。
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图1 SMC MCP-1和VCAM-1 Northern印迹
图2 SMC MCP-1和VCAM-1 Northern印迹光密度
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3 讨论
在动脉粥样硬化发生过程中，单核细胞向内皮下间隙的迁移受多种趋化因子的影响，其中作用最强的是MCP-1，它特异地作用于血液单核细胞，招引其迁移入内皮下间隙。此外，实验还表明，动脉内皮下间隙的单核细胞量与血管壁VCAM-1表达呈正相关[2]，VCAM-1等粘附分子不仅调节细胞的粘附，还介导细胞的迁移、吞噬和其它粘附依赖性功能。 因此，VCAM-1在单核细胞源性泡沫细胞形成过程中可能起重要作用。
, 百拇医药 血管壁内皮细胞、SMC表达MCP-1和VCAM-1受多种因素影响。据报道，轻微氧化修饰的低密度脂蛋白、白细胞介素-1(IL-1)、TNF、LPS等均能诱导动脉内皮细胞表达MCP-1和VCAM-1[3，4]。我们也曾证明，动脉粥样硬化的危险因素极低密度脂蛋白和氧化极低密度脂蛋白可诱导兔主动脉SMC表达MCP-1[5]。
血管SMC可通过自分泌和旁分泌方式释放细胞因子IL-1，而且IL-1β的水平远高于IL-1α。IL-1β具有多种生物学功能，它不仅能作用于血管内皮细胞，诱导其MCP-1和VCAM-1的表达，而且能与PDGF或单核细胞源性生长因子共同作用促进血管SMC增生；以浓度和时间依赖方式诱导单核细胞和中性粒细胞对血管SMC的粘附[6]。但IL-1β是否也影响SMC表达MCP-1 和VCAM-1，目前尚不清楚。本研究结果表明，IL-1β对兔主动脉SMC MCP-1的蛋白分泌和mRNA表达具有明显的诱导作用，但对其VCAM-1表达无明显影响。普遍认为，在血液单核细胞迁移入内皮下间隙过程中，内皮细胞分泌的MCP-1在动脉粥样硬化发生早期起关键作用，而SMC产生的MCP-1在动脉粥样硬化的各个时期都发挥重要作用[7]。 根据本研究结果，我们认为，IL-1β能通过诱导SMC表达MCP-1参与动脉粥样硬化斑块形成。然而，对单核细胞的迁移而言，内皮细胞VCAM-1的分泌可能比SMC VCAM-1的产生更重要， 因为单核细胞进入内皮下间隙前必须先粘附于内皮细胞表面。 IL-1β促进内皮细胞VCAM-1表达[3，8]，但不影响SMC的 VCAM-1 的表达，可能与此因素有关。
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*国家自然科学基金资助项目(No.39730220)
作者简介：阮秋蓉，女，1964年生，医学博士。
参考文献
1 Moyer C F, Sajuthi D, Tulli H et al. Synthesis of IL-1 alpha and IL-1 beta by arterial cells in atherosclerosis. Am J Pathol, 1991, 138:951
2 Fruebis J, Gonzalez V, Silvestre M et al. Effect of probucol treatment on gene expression of VCAM-1, MCP-1, and M-CSF in the aortic wall of LDL receptor-deficient rabbits during early atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997, 17:1289
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3 Haraldsen G, Kvale D, Lien B et al. Cytokine-regulated expression of E-selection, intercellular adhesion molecular-1 (ICAM-1), and vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) in human intestinal microvascular endothelial cells. J Immunol, 1996, 156:2588
4 Collins T. Endothelial nuclear factor-kappa B and the initiation of the atherosclerotic lesions. Lab Invest, 1993, 68:497
5 Ruan Q R, Deng Z D, Song J X. Very low density lipoprotein and oxidized very low density lipoprotein induce monocyte chemotactic protein 1 in rabbit aortic smooth muscle cells. Chin Med J, 1996, 109:206
, http://www.100md.com
6 Wang X, Feuerslein G Z Clark RK et al. Enhanced leucocyte adhesion to interleukin-1 beta stimulated vascular smooth muscle cells is mainly through intercellular adhesion molecule-1. Cardiovasc Res, 1994, 28:1808
7 Takeya M, Yoshimura T, Leonard E J et al. Detection of monocyte chemoattractant protein-1 in human atherosclerotic lesions by an anti-moonocyte chemoattractant protein-1 monoclonal antibody. Human Pathol, 1993, 24:534
8 Sironi M, Sciacca F L, Matteucci C et al. Regulation of endothelial and mesothelial cell function by interleukin-13: selective induction of vascular cell adhesion molecule-1 and amplification of interleukin-6 production. Blood, 1994, 84:19131
收稿日期：1999-04-05, 百拇医药