甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能的影响
作者：任晓燕 徐 珞 张玉敏 葛宝林 曲忠森 刘洪明
单位：任晓燕 张玉敏 葛宝林 刘洪明 青岛医学院病理生理学教研室(青岛 266021)；徐 珞 青岛医学院生理学教研室；曲忠森 泰山医学院附属医院微循环研究所
关键词：甘糖酯；谷氨酸转运体；缺血-再灌注损伤；脂质过氧化物；大鼠
青岛医学院学报990112 【摘要】 ①目的 探讨甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能的影响。②方法 采用大鼠三血管夹闭、松夹制作脑缺血-再灌注损伤模型，利用海马突触膜颗粒对3H-L-谷氨酸摄入量的测定，观察了甘糖酯对谷氨酸转运体功能的影响，同时测定了脑组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化。③结果缺血-再灌注损伤时，大鼠海马谷氨酸转运体功能及SOD活性明显降低，MDA明显升高，与对照组比较差异均有显著性(t=3.691～5.406,P均<0.01)；应用甘糖酯组大鼠海马谷氨酸转运体功能及SOD活性显著提高，MDA含量降低，与缺血-再灌注损伤组相比，差异均有显著性(t=2.938～3.127,P均<0.05)。④结论 甘糖酯可能通过清除自由基的作用,改善大鼠脑组织缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体的功能。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 R363.21
EFFECT OF PROPLYLENE GLUCOL MANNURATE SULPHATE ON GLUTAMATE TRANSPORTER FUNCTION OF HIPPOCAMPUS IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURED RATS
Ren Xiaoyan, Xu Luo, Zhang Yumin, et al
Department of Pathophysiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To investigate the effect of proplylene glucol mannurate sulphate( PGMS) on glutamate transporter function of hippocampus in ischemia-reperfusion injured (I120-R30) rats. Methods The brain ischemia-reperfusion model of rat was made by clipping and releasing three arteries.Glutamate transporter function was studied by assay of 3H-L-glutamate uptake in hippocampus synaptosomes. MDA contents and SOD activities were detected by spectrophotometry. Results The glutamate transporter function and SOD activities of hippocampus in ischemia-reperfusion rats were significantly decreased(t=4.482,3.691,P<0.01), contents of MDA were increased(t=3.067,P<0.05) compared with control group. Glutamate transporter function and SOD activity in PGMS group were increased(t=3.127,2.938,P<0.05), contents of MDA were decreased(t=3.067,P<0.05) compared with ischemia-reperfusion rats. Conclusion PGMS can improve glutamate transporter function of ischemia-reperfusion rats through the elimination of free radicals.
, http://www.100md.com
【KEY WORDS】 proplylene glucol mannurate sulphate; glutamate transporter; brain ischemia-reperfusion injury;lipid peroxidation;rat
研究表明，在脑缺血及再灌注时，神经元突触间隙内谷氨酸积聚，可引起不可逆性神经损害〔1〕。正常情况下神经元突触间隙的谷氨酸可被其突触前膜及胶质细胞的谷氨酸转运体摄取、贮存，从而终止对突触后膜的作用〔2〕。甘糖酯系新型类肝素海洋药物，具有明显的抗凝和溶栓作用〔3〕。本文通过观察甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能的影响，以探讨脑缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体功能变化的机制。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
, http://www.100md.com
3H-L-谷氨酸(1.52TBq/mol)购自美国杜邦公司。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京生物工程研究所。甘糖酯购自青岛华海制药厂。RS-20Ⅲ型高速冰冻离心机(日本产)；LKB1209型液体闪烁计数仪(瑞典产)；751型分光光度计(上海产)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 健康雄性Wistar大鼠24只(250～350g)，随机分为3组，每组8只。缺血-再灌注损伤组(实验组)动物模型的制备参照文献〔4〕的方法。甘糖酯组实验前用质量浓度为1g/L的甘糖酯灌胃，10mL/d，共10d，手术过程同缺血-再灌注损伤组。对照组实验过程基本同缺血-再灌注损伤组，但不夹闭血管。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离海马。
1.2.2 谷氨酸转运体功能测定 参照文献〔5〕方法制备海马突触膜颗粒。取膜颗粒20μL，加膜外液(0.15mol/L NaCl溶液180μL加3H-L-谷氨酸0.25μL)，放入30℃水浴中反应10min，用0.15mol/L冰冻NaCl溶液2mL终止反应，立即倒在孔径为0.45μm滤膜上定时(40s)、定量(24mL)冲洗，滤膜烘干置于液闪管中，隔夜测定。样本均用双管，转运体的功能表达为谷氨酸摄入量(nmol.min-1/g蛋白)。膜颗粒的蛋白质含量测定采用Lowry法。
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1.2.3 MDA和SOD测定 采用分光光度比色法测定海马MDA含量和SOD活性。
2 结 果
缺血-再灌注损伤组海马谷氨酸转运体的功能和SOD活性明显降低，MDA含量明显增高，与对照组比较，差异均有显著意义(t=3.691～5.406，P均<0.01)；甘糖酯组谷氨酸转运体的功能及SOD活性显著提高，MDA含量降低,与缺血-再灌注损伤组比较，差异均有显著性(t=2.938～3.127,P均<0.05)。见表1.
表1 甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能及MDA和SOD的影响(
) 组 别
n
谷氨酸摄入量
, http://www.100md.com
(ξ/nmol.
min-1.g-1)
MDA
(b/μmol.g-1)
SOD
(ξ/U.L-1)
对照组
8
1.30±0.17
15.93±1.60
, http://www.100md.com
124.64±15.42
实验组
8
0.95±0.12**
19.10±0.94**
104.20± 6.87**
甘糖酯组
8
1.22±0.22△
17.05±2.00△
112.78± 4.22△
, 百拇医药
与对照组相比,**t=3.691～5.406,P均<0.01；与实验组相比,△t=2.938～3.067,P均<0.05
3 讨 论
谷氨酸是脑内的兴奋性神经递质，其在神经元突触间隙中的异常积聚可严重损伤神经细胞。正常时由突触前膜释放的谷氨酸作用于突触后膜，产生神经兴奋作用，后经突触前膜和胶质细胞膜上的谷氨酸转运体摄取、贮存，从而维持脑内谷氨酸水平的相对稳定〔2〕。研究表明，脑缺血-再灌注损伤时突触间隙中可出现谷氨酸异常积聚，由此引起Na+，Cl-和水分进入神经细胞，或出现钙超载而诱发脑神经细胞的各种损伤性变化〔6〕。本文结果显示，脑缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体的功能降低，同时，脑组织中MDA含量升高而SOD活性降低。由此可推测脑缺血-再灌注损伤时，突触间隙中谷氨酸的增多可能与谷氨酸转运体的功能降低有关。 而海马谷氨酸转运体功能降低可能与自由基损伤有关。
, 百拇医药
脑缺血-再灌注时形成大量的氧自由基，引起组织的损伤性变化。在体外培养大鼠皮层神经胶质细胞的实验发现，自由基的形成可显著降低谷氨酸转运体清除细胞外谷氨酸的能力，当在培养的细胞中加入氧自由基时，可抑制谷氨酸转运体的转运功能，加入自由基清除剂时，这种抑制作用解除〔7〕。本文结果显示，应用甘糖酯后大鼠海马谷氨酸转运体的功能明显提高，并伴随着MDA含量的降低及SOD活性的增加，故推测甘糖酯具有提高脑组织抗氧化酶的活性及抗氧化能力的作用。且甘糖酯提高海马谷氨酸转运体功能的作用可能是通过降低脑组织自由基而实现的。
本文为国家自然科学基金资助课题(批准号：39400051)参考文献
1 Faden AI,Demediuk P,Panter,et al.The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science,1989,244(1):798
, 百拇医药
2 Fonnum F.Glutamate:a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem, 1984,42(1):11
3 姜国辉,张世玲,袁 玮,等.甘糖酯对家兔凝血和纤溶功能的影响.中国药理学通报，1991,7(3):201
4 田鹤屯，陈前芬，谢 群.三血管阻断与重开放造成的大鼠全脑缺血-再灌注损伤的实验研究.蚌埠医学院学报，1993,18(2):113
5 Pines G,Kanner BI.Counterflow of L-Glutamate in plasma membrane vesicles and reconstituted preparations from rat brain. Biochemistry ,1990,29:11209
6 Hara H,Sukamoto T,Kogure K.Mechanism and pathogenesis of ischemia-induced neuronal damage. Progress in Neurobiology,1993,40(1):645
7 Volterra A,Frotti D,Fromba C,et al. Glutamate uptake inhibition by oxygen free radicals in rat cortical astrocytes. J Neurosci,1994,14( 5) :2924
(1998-10-28收稿 1999-02-06修回), 百拇医药
单位：任晓燕 张玉敏 葛宝林 刘洪明 青岛医学院病理生理学教研室(青岛 266021)；徐 珞 青岛医学院生理学教研室；曲忠森 泰山医学院附属医院微循环研究所
关键词：甘糖酯；谷氨酸转运体；缺血-再灌注损伤；脂质过氧化物；大鼠
青岛医学院学报990112 【摘要】 ①目的 探讨甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能的影响。②方法 采用大鼠三血管夹闭、松夹制作脑缺血-再灌注损伤模型，利用海马突触膜颗粒对3H-L-谷氨酸摄入量的测定，观察了甘糖酯对谷氨酸转运体功能的影响，同时测定了脑组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性的变化。③结果缺血-再灌注损伤时，大鼠海马谷氨酸转运体功能及SOD活性明显降低，MDA明显升高，与对照组比较差异均有显著性(t=3.691～5.406,P均<0.01)；应用甘糖酯组大鼠海马谷氨酸转运体功能及SOD活性显著提高，MDA含量降低，与缺血-再灌注损伤组相比，差异均有显著性(t=2.938～3.127,P均<0.05)。④结论 甘糖酯可能通过清除自由基的作用,改善大鼠脑组织缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体的功能。
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中国图书资料分类法分类号 R363.21
EFFECT OF PROPLYLENE GLUCOL MANNURATE SULPHATE ON GLUTAMATE TRANSPORTER FUNCTION OF HIPPOCAMPUS IN ISCHEMIA-REPERFUSION INJURED RATS
Ren Xiaoyan, Xu Luo, Zhang Yumin, et al
Department of Pathophysiology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To investigate the effect of proplylene glucol mannurate sulphate( PGMS) on glutamate transporter function of hippocampus in ischemia-reperfusion injured (I120-R30) rats. Methods The brain ischemia-reperfusion model of rat was made by clipping and releasing three arteries.Glutamate transporter function was studied by assay of 3H-L-glutamate uptake in hippocampus synaptosomes. MDA contents and SOD activities were detected by spectrophotometry. Results The glutamate transporter function and SOD activities of hippocampus in ischemia-reperfusion rats were significantly decreased(t=4.482,3.691,P<0.01), contents of MDA were increased(t=3.067,P<0.05) compared with control group. Glutamate transporter function and SOD activity in PGMS group were increased(t=3.127,2.938,P<0.05), contents of MDA were decreased(t=3.067,P<0.05) compared with ischemia-reperfusion rats. Conclusion PGMS can improve glutamate transporter function of ischemia-reperfusion rats through the elimination of free radicals.
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【KEY WORDS】 proplylene glucol mannurate sulphate; glutamate transporter; brain ischemia-reperfusion injury;lipid peroxidation;rat
研究表明，在脑缺血及再灌注时，神经元突触间隙内谷氨酸积聚，可引起不可逆性神经损害〔1〕。正常情况下神经元突触间隙的谷氨酸可被其突触前膜及胶质细胞的谷氨酸转运体摄取、贮存，从而终止对突触后膜的作用〔2〕。甘糖酯系新型类肝素海洋药物，具有明显的抗凝和溶栓作用〔3〕。本文通过观察甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能的影响，以探讨脑缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体功能变化的机制。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂
, http://www.100md.com
3H-L-谷氨酸(1.52TBq/mol)购自美国杜邦公司。丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京生物工程研究所。甘糖酯购自青岛华海制药厂。RS-20Ⅲ型高速冰冻离心机(日本产)；LKB1209型液体闪烁计数仪(瑞典产)；751型分光光度计(上海产)。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备 健康雄性Wistar大鼠24只(250～350g)，随机分为3组，每组8只。缺血-再灌注损伤组(实验组)动物模型的制备参照文献〔4〕的方法。甘糖酯组实验前用质量浓度为1g/L的甘糖酯灌胃，10mL/d，共10d，手术过程同缺血-再灌注损伤组。对照组实验过程基本同缺血-再灌注损伤组，但不夹闭血管。实验完毕后断头取脑，按自然分界分离海马。
1.2.2 谷氨酸转运体功能测定 参照文献〔5〕方法制备海马突触膜颗粒。取膜颗粒20μL，加膜外液(0.15mol/L NaCl溶液180μL加3H-L-谷氨酸0.25μL)，放入30℃水浴中反应10min，用0.15mol/L冰冻NaCl溶液2mL终止反应，立即倒在孔径为0.45μm滤膜上定时(40s)、定量(24mL)冲洗，滤膜烘干置于液闪管中，隔夜测定。样本均用双管，转运体的功能表达为谷氨酸摄入量(nmol.min-1/g蛋白)。膜颗粒的蛋白质含量测定采用Lowry法。
, http://www.100md.com
1.2.3 MDA和SOD测定 采用分光光度比色法测定海马MDA含量和SOD活性。
2 结 果
缺血-再灌注损伤组海马谷氨酸转运体的功能和SOD活性明显降低，MDA含量明显增高，与对照组比较，差异均有显著意义(t=3.691～5.406，P均<0.01)；甘糖酯组谷氨酸转运体的功能及SOD活性显著提高，MDA含量降低,与缺血-再灌注损伤组比较，差异均有显著性(t=2.938～3.127,P均<0.05)。见表1.
表1 甘糖酯对脑缺血-再灌注损伤大鼠海马谷氨酸转运体功能及MDA和SOD的影响(
) 组 别n
谷氨酸摄入量
, http://www.100md.com
(ξ/nmol.
min-1.g-1)
MDA
(b/μmol.g-1)
SOD
(ξ/U.L-1)
对照组
8
1.30±0.17
15.93±1.60
, http://www.100md.com
124.64±15.42
实验组
8
0.95±0.12**
19.10±0.94**
104.20± 6.87**
甘糖酯组
8
1.22±0.22△
17.05±2.00△
112.78± 4.22△
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与对照组相比,**t=3.691～5.406,P均<0.01；与实验组相比,△t=2.938～3.067,P均<0.05
3 讨 论
谷氨酸是脑内的兴奋性神经递质，其在神经元突触间隙中的异常积聚可严重损伤神经细胞。正常时由突触前膜释放的谷氨酸作用于突触后膜，产生神经兴奋作用，后经突触前膜和胶质细胞膜上的谷氨酸转运体摄取、贮存，从而维持脑内谷氨酸水平的相对稳定〔2〕。研究表明，脑缺血-再灌注损伤时突触间隙中可出现谷氨酸异常积聚，由此引起Na+，Cl-和水分进入神经细胞，或出现钙超载而诱发脑神经细胞的各种损伤性变化〔6〕。本文结果显示，脑缺血-再灌注损伤时海马谷氨酸转运体的功能降低，同时，脑组织中MDA含量升高而SOD活性降低。由此可推测脑缺血-再灌注损伤时，突触间隙中谷氨酸的增多可能与谷氨酸转运体的功能降低有关。 而海马谷氨酸转运体功能降低可能与自由基损伤有关。
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脑缺血-再灌注时形成大量的氧自由基，引起组织的损伤性变化。在体外培养大鼠皮层神经胶质细胞的实验发现，自由基的形成可显著降低谷氨酸转运体清除细胞外谷氨酸的能力，当在培养的细胞中加入氧自由基时，可抑制谷氨酸转运体的转运功能，加入自由基清除剂时，这种抑制作用解除〔7〕。本文结果显示，应用甘糖酯后大鼠海马谷氨酸转运体的功能明显提高，并伴随着MDA含量的降低及SOD活性的增加，故推测甘糖酯具有提高脑组织抗氧化酶的活性及抗氧化能力的作用。且甘糖酯提高海马谷氨酸转运体功能的作用可能是通过降低脑组织自由基而实现的。
本文为国家自然科学基金资助课题(批准号：39400051)参考文献
1 Faden AI,Demediuk P,Panter,et al.The role of excitatory amino acids and NMDA receptors in traumatic brain injury. Science,1989,244(1):798
, 百拇医药
2 Fonnum F.Glutamate:a neurotransmitter in mammalian brain. J Neurochem, 1984,42(1):11
3 姜国辉,张世玲,袁 玮,等.甘糖酯对家兔凝血和纤溶功能的影响.中国药理学通报，1991,7(3):201
4 田鹤屯，陈前芬，谢 群.三血管阻断与重开放造成的大鼠全脑缺血-再灌注损伤的实验研究.蚌埠医学院学报，1993,18(2):113
5 Pines G,Kanner BI.Counterflow of L-Glutamate in plasma membrane vesicles and reconstituted preparations from rat brain. Biochemistry ,1990,29:11209
6 Hara H,Sukamoto T,Kogure K.Mechanism and pathogenesis of ischemia-induced neuronal damage. Progress in Neurobiology,1993,40(1):645
7 Volterra A,Frotti D,Fromba C,et al. Glutamate uptake inhibition by oxygen free radicals in rat cortical astrocytes. J Neurosci,1994,14( 5) :2924
(1998-10-28收稿 1999-02-06修回), 百拇医药