汞对人类胎盘碱性磷酸酶活力与荧光光谱的影响
作者：耿芳宋 刘洪明 王秀丽 杜 卫 张社华
单位：青岛医学院(青岛 266021)；耿芳宋 刘洪明 王秀丽 杜 卫 生物化学教研室；张社华 中心实验室
关键词：汞；碱性磷酸酶；酶抑制；荧光光谱
青岛医学院学报990106 【摘要】 ①目的 研究汞对人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)活力及其荧光光谱的影响，以探讨汞对PLAP抑制的分子机制。②方法 应用分光光度法测定不同浓度HgCl2存在下的酶活力，用荧光法检测其荧光光谱；用双倒数作图法确定HgCl2对该酶的抑制类型。③结果 当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力及其荧光强度迅速下降，最大发射峰位由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时，酶活力、荧光强度及峰位均无显著变化；当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度增加，酶活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变；HgCl2浓度高达10.00mmol/L时，酶仍有部分活力。HgCl2是PLAP混合性抑制剂，其抑制常数为3.60mmol/L.④结论 HgCl2抑制了PLAP的活力，并使其构象发生了改变。
, 百拇医药
中国图书资料分类法分类号 Q566
THE EFFECT OF MERCURY ON CATALYTIC ACTIVITY AND FLUORESCENCE SPECTRA OF HUMAN PLACENTAL ALKALINE PHOSPHATASE
Geng Fangsong, Liu Hongming, Wang Xiuli, et al
Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the effect of mercury on catalytic activity and fluorescence spectra of human placental alkaline phosphatase(PLAP) and discuss the molecular mechanism of mercury in inhibiting PLAP. Methods Spectrophotometry was used to study the activity of PLAP under different concentrations of HgCl2. Fluorometry was used to observe the fluorescence spectra. The inhibition type of HgCl2 on PLAP was determined by using the double reciprocal plot. Results When the concentration of HgCl2 was 0.25mmol/L, PLSP activity and emission intensity were greatly decreased and the emission maximum was blue-shifted from 347nm to 340nm. When the concentration of HgCl2 was between 0.25-1.00mmol/L, no obvious changes of PLAP activity, emission intensity and emission maximum were observed. When the concentration of HgCl2 was higher than 1.00mmol/L, the PLAP activity and emission intensity were greatly decreased again along with the decrement of HgCl2 concentration, while the emission maximum kept unchanged, At the concentration of 10mmol/L, some PLAP activity could still be observed. HgCl2 was a mixed-competitive inhibitor of PLAP and its inhibition constant(ki) was 3.60mmol/L. Conclusion The PLAP activity was inhibited and its conformation was changed by HgCl2.
, 百拇医药
【KEY WORDS】 mercury; alkaline phosphatases; enzyme inhibition; fluorescence spectra
人类胎盘碱性磷酸酶(E.C.3.1.3.1,PLAP)是位于晚期胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物，其一级结构已经清楚〔1,2〕。该酶不仅直接参与了磷酸基团的转运和代谢过程，而且也是某些专一性物质(如IgG等)进入胎盘的受体，对胎儿的生长发育起重要作用〔3〕。基于该酶的重要性，我们探讨了HgCl2对其活力与构象的影响，旨在阐明HgCl2对PLAP的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
DEAE-纤维素为上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50为Pharmacia公司产品；二乙醇胺为天津化学试剂三厂产品，分析纯；氯化汞为上海试剂四厂产品，分析纯；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)为Merck公司产品；其他试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
, 百拇医药
1.2 PLAP的分离和纯化
按文献〔4〕的方法进行，纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定为单一区带；反相高效液相色谱(HPLC)分析为单一对称峰。测得纯化酶的比活力为108.95mmol.s-1/g.二乙醇胺缓冲液〔1mol/L二乙醇胺，2mmol/L Mg(NO3)2，pH 9.9〕透析去Tris,4℃贮存备用。
1.3 纯化酶的处理
在含不同浓度HgCl2的溶液中，加入纯化酶液，使酶的终浓度为31.56mg/L；混匀，20℃保温30min，使酶达到稳定。
1.4 酶活力的测定
参照文献〔5〕的方法，取测活液〔含5mmol/L PNPP， 1mol/L二乙醇胺， 2mmol/L Mg(NO3)2， pH9.9〕2.0mL， 加入一定浓度HgCl2溶液0.5mL，混匀，30℃预保温5min，加入相应浓度经HgCl2处理的酶液10μL，立即混匀，在岛津UV-260型分光光度计上测定405nm波长处的吸光度变化，按其吸光度的变化值计算酶活力。
, 百拇医药
1.5 酶构象的监测
酶的荧光发射光谱用LS-50型荧光光度仪监测，激发波长为280nm，激发和发射狭缝均为5nm，测定温度为20℃，扫描波长范围为300～410nm，用含相应浓度HgCl2的缓冲液进行校正。
2 结 果
2.1 HgCl2对PLAP活力的影响
测活体系中，HgCl2的终浓度分别为0,0.25,0.50,0.75,1.00,2.50,5.00,7.50,10.00mmol/L，按酶活力测定条件和方法分别测定其酶活力，以酶的相对活力对HgCl2的浓度作图1.由图1可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力突降至86%;HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时，酶活力变化相对稳定，呈现一平台区;继续提高HgCl2浓度，酶活力又迅速下降；当HgCl2浓度增至10.00mmol/L时，酶活力降至16%.
, 百拇医药
图1 不同浓度HgCl2对PLAP活力的影响
2.2 HgCl2对PLAP的抑制类型
在1.00mmol/L HgCl2存在和无HgCl2存在条件下，分别测定不同底物浓度(底物终浓度分别为0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50mmol/L)下的酶促反应初速度，以吸光度的变化值(ΔA)表示。以ΔA-1对底物浓度的倒数〔cs〕-1作图2.由图2可见，在有或无HgCl2存在条件下的两条双倒数曲线相交于第2象限，HgCl2存在条件下的表观米氏常数(Km)增大，最大反应速度(Vmax)降低。求得该测定条件下酶的Km值为0.29mmol/L，表观Km值为0.37mmol/L，抑制常数(Ki)值为3.60mmol/L.提示HgCl2对PLAP呈现非竞争性与竞争性的混合性抑制作用。
, 百拇医药
图2 HgCl2对PLAP的抑制类型
①无HgCl2存在 ②HgCl2浓度为1.00mmol/L
2.3 HgCl2对PLAP构象的影响
PLAP分别在0，0.25，0.50，0.75，1.00，2.50，5.00，7.50，10.00mmol/L HgCl2溶液中，20℃保温30min，测得酶的内源荧光发射光谱见图3.由图3可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶的荧光强度迅速降至55.1%, 最大发射峰位由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度<1.00mmol/L时，其荧光强度及峰位变化不大。当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度的增加，荧光强度又迅速下降，但最大发射峰位仍为340nm.HgCl2浓度为10.00mmol/L时，其荧光强度降至10.4%.
, 百拇医药
图3 在不同浓度HgCl2溶液中PLAP的荧光发射光谱
①～⑨分别表示在0,0.25,0.50,0.75,1.00,2.50,5.00,7.50,10.00mmol/L HgCl2溶液中，PLAP的荧光发射光谱
2.4 PLAP活力与构象变化的比较
酶的荧光强度、最大发射波长及活力的变化如图4所示。由图4可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力及其荧光强度迅速下降，最大发射波长由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度<1.00mmol/L时，酶活力、荧光强度及最大发射波长均变化不明显；当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度的增加，酶活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变；当HgCl2浓度增至10.00mmol/L时，酶仍有活力，荧光亦未淬灭。
, 百拇医药
图4 不同浓度HgCl2中PLAP活力、荧光强度及最大发射峰值的比较
①酶活力曲线，②相对荧光强度曲线，③最大发射峰位曲线
3 讨 论
PLAP的溶解形式为二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基〔2〕。观测这些残基所产生的荧光变化，可以帮助了解其构象的变化概况。结果显示，不同浓度的HgCl2均使PLAP荧光光谱的最大发射峰位蓝移，据此可以推测,HgCl2使PLAP分子上的色氨酸残基处于更加非极性微区〔6〕，提示酶分子更加紧缩。由于PLAP分子的紧缩而导致其荧光强度的下降，荧光强度的下降是处于更加非极性微区的色氨酸和酪氨酸残基共同作用的结果〔7〕。一方面色氨酸残基使其荧光强度升高，而另一方面酪氨酸残基由于酚羟基的解离减少，使其荧光强度降低，总结果是HgCl2的存在降低了PLAP的荧光强度。至于PLAP分子紧缩的原因，可能是由于Hg2+与酶分子中的某些侧链基团(如巯基、咪唑基等)形成螯合物所致。
, 百拇医药
PLAP构象与活力变化的比较结果表明，HgCl2对PLAP的影响是一个复杂过程，大体上可分为两个阶段，一是低浓度Hg2+(HgCl2<1.00mmol/L)使PLAP活力和荧光强度骤降后经历了一个相对稳定区(HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时)，并伴有峰位的蓝移，这可能是因为低浓度的Hg2+与酶分子表面或内埋较浅的某些侧链基团螯合所致；另一个阶段是HgCl2浓度>1.00mmol/L时，PLAP活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变，这可能是因为较高浓度的Hg2+与酶分子上内埋较深的某些侧链基团螯合所致。 Hg2+与酶蛋白氨基酸残基的螯合导致酶活性中心紧缩，从而降低了其柔性。活性中心的柔性是酶充分表现其催化活性所必需的〔8〕，酶活性中心的柔性太小，不利于酶与底物的结合与催化，表现为Km值增大，Vmax降低，故Hg2+对PLAP呈现非竞争性与竞争性混合性抑制。不同浓度的Hg2+均无PLAP荧光光谱峰位的红移，提示在该测定条件下酶并未变性。
, http://www.100md.com
综上所述，Hg2+对PLAP抑制的分子机制是Hg2+与酶分子中某些氨基酸残基螯合后，降低了酶活性中心的柔性，从而降低了酶活性。至于Hg2+与酶分子中哪些侧链基团螯合，有待进一步探讨。
本文为山东省卫生厅科研基金资助课题(批准号：95036)
参考文献
1 Fishman WH. Alkaline phosphatase isozymes:recent progress. Clin Biochem,1990,23:99
2 Millan JL. Molecular cloning and sequence analysis of human placental alkaline phosphatase. J Biol Chem,1986,261(7):3112
, 百拇医药
3 Makiya R,Stigbrand T. Placental alkaline phosphatase as the placental IgG receptor. Clin Chem,1992,38(12):2543
4 耿芳宋,王秀丽,张金玉,等. 人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化.青岛医学院学报, 1998,34(2):84
5 Hoylaerts MF,Manes T,Millan JL. Molecular mechanism of uncompetitive inhibition of human placental and germ-cell alkaline phosphatase.Biochem J,1992,286:23
6 袁志安,陈挹芳. 鸡肝二氢叶酸还原酶的胍变性. 生物化学与生物物理学报,1989,21(4):74
7 耿芳宋,王秀丽,童家明,等. 盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响. 生物物理学报，1998,14(3):385
8 邹承鲁. 活性部位的柔性为酶充分表现其催化活性所必需. 生物化学与生物物理学报,1992,24(5):393
(1998-07-13收稿 1999-02-10修回), http://www.100md.com
单位：青岛医学院(青岛 266021)；耿芳宋 刘洪明 王秀丽 杜 卫 生物化学教研室；张社华 中心实验室
关键词：汞；碱性磷酸酶；酶抑制；荧光光谱
青岛医学院学报990106 【摘要】 ①目的 研究汞对人类胎盘碱性磷酸酶(PLAP)活力及其荧光光谱的影响，以探讨汞对PLAP抑制的分子机制。②方法 应用分光光度法测定不同浓度HgCl2存在下的酶活力，用荧光法检测其荧光光谱；用双倒数作图法确定HgCl2对该酶的抑制类型。③结果 当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力及其荧光强度迅速下降，最大发射峰位由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时，酶活力、荧光强度及峰位均无显著变化；当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度增加，酶活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变；HgCl2浓度高达10.00mmol/L时，酶仍有部分活力。HgCl2是PLAP混合性抑制剂，其抑制常数为3.60mmol/L.④结论 HgCl2抑制了PLAP的活力，并使其构象发生了改变。
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中国图书资料分类法分类号 Q566
THE EFFECT OF MERCURY ON CATALYTIC ACTIVITY AND FLUORESCENCE SPECTRA OF HUMAN PLACENTAL ALKALINE PHOSPHATASE
Geng Fangsong, Liu Hongming, Wang Xiuli, et al
Department of Biochemistry, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
【ABSTRACT】 Objective To study the effect of mercury on catalytic activity and fluorescence spectra of human placental alkaline phosphatase(PLAP) and discuss the molecular mechanism of mercury in inhibiting PLAP. Methods Spectrophotometry was used to study the activity of PLAP under different concentrations of HgCl2. Fluorometry was used to observe the fluorescence spectra. The inhibition type of HgCl2 on PLAP was determined by using the double reciprocal plot. Results When the concentration of HgCl2 was 0.25mmol/L, PLSP activity and emission intensity were greatly decreased and the emission maximum was blue-shifted from 347nm to 340nm. When the concentration of HgCl2 was between 0.25-1.00mmol/L, no obvious changes of PLAP activity, emission intensity and emission maximum were observed. When the concentration of HgCl2 was higher than 1.00mmol/L, the PLAP activity and emission intensity were greatly decreased again along with the decrement of HgCl2 concentration, while the emission maximum kept unchanged, At the concentration of 10mmol/L, some PLAP activity could still be observed. HgCl2 was a mixed-competitive inhibitor of PLAP and its inhibition constant(ki) was 3.60mmol/L. Conclusion The PLAP activity was inhibited and its conformation was changed by HgCl2.
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【KEY WORDS】 mercury; alkaline phosphatases; enzyme inhibition; fluorescence spectra
人类胎盘碱性磷酸酶(E.C.3.1.3.1,PLAP)是位于晚期胎盘细胞膜上的一种糖蛋白，是一个新进化的基因产物，其一级结构已经清楚〔1,2〕。该酶不仅直接参与了磷酸基团的转运和代谢过程，而且也是某些专一性物质(如IgG等)进入胎盘的受体，对胎儿的生长发育起重要作用〔3〕。基于该酶的重要性，我们探讨了HgCl2对其活力与构象的影响，旨在阐明HgCl2对PLAP的作用机制。
1 材料和方法
1.1 实验试剂
DEAE-纤维素为上海试剂二厂产品；DEAE-Sephadex A-50为Pharmacia公司产品；二乙醇胺为天津化学试剂三厂产品，分析纯；氯化汞为上海试剂四厂产品，分析纯；对硝基酚磷酸二钠(PNPP)为Merck公司产品；其他试剂均为国产分析纯，用双蒸水配制。
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1.2 PLAP的分离和纯化
按文献〔4〕的方法进行，纯化酶经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定为单一区带；反相高效液相色谱(HPLC)分析为单一对称峰。测得纯化酶的比活力为108.95mmol.s-1/g.二乙醇胺缓冲液〔1mol/L二乙醇胺，2mmol/L Mg(NO3)2，pH 9.9〕透析去Tris,4℃贮存备用。
1.3 纯化酶的处理
在含不同浓度HgCl2的溶液中，加入纯化酶液，使酶的终浓度为31.56mg/L；混匀，20℃保温30min，使酶达到稳定。
1.4 酶活力的测定
参照文献〔5〕的方法，取测活液〔含5mmol/L PNPP， 1mol/L二乙醇胺， 2mmol/L Mg(NO3)2， pH9.9〕2.0mL， 加入一定浓度HgCl2溶液0.5mL，混匀，30℃预保温5min，加入相应浓度经HgCl2处理的酶液10μL，立即混匀，在岛津UV-260型分光光度计上测定405nm波长处的吸光度变化，按其吸光度的变化值计算酶活力。
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1.5 酶构象的监测
酶的荧光发射光谱用LS-50型荧光光度仪监测，激发波长为280nm，激发和发射狭缝均为5nm，测定温度为20℃，扫描波长范围为300～410nm，用含相应浓度HgCl2的缓冲液进行校正。
2 结 果
2.1 HgCl2对PLAP活力的影响
测活体系中，HgCl2的终浓度分别为0,0.25,0.50,0.75,1.00,2.50,5.00,7.50,10.00mmol/L，按酶活力测定条件和方法分别测定其酶活力，以酶的相对活力对HgCl2的浓度作图1.由图1可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力突降至86%;HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时，酶活力变化相对稳定，呈现一平台区;继续提高HgCl2浓度，酶活力又迅速下降；当HgCl2浓度增至10.00mmol/L时，酶活力降至16%.
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图1 不同浓度HgCl2对PLAP活力的影响
2.2 HgCl2对PLAP的抑制类型
在1.00mmol/L HgCl2存在和无HgCl2存在条件下，分别测定不同底物浓度(底物终浓度分别为0.10,0.15,0.20,0.30,0.40,0.50mmol/L)下的酶促反应初速度，以吸光度的变化值(ΔA)表示。以ΔA-1对底物浓度的倒数〔cs〕-1作图2.由图2可见，在有或无HgCl2存在条件下的两条双倒数曲线相交于第2象限，HgCl2存在条件下的表观米氏常数(Km)增大，最大反应速度(Vmax)降低。求得该测定条件下酶的Km值为0.29mmol/L，表观Km值为0.37mmol/L，抑制常数(Ki)值为3.60mmol/L.提示HgCl2对PLAP呈现非竞争性与竞争性的混合性抑制作用。
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图2 HgCl2对PLAP的抑制类型
①无HgCl2存在 ②HgCl2浓度为1.00mmol/L
2.3 HgCl2对PLAP构象的影响
PLAP分别在0，0.25，0.50，0.75，1.00，2.50，5.00，7.50，10.00mmol/L HgCl2溶液中，20℃保温30min，测得酶的内源荧光发射光谱见图3.由图3可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶的荧光强度迅速降至55.1%, 最大发射峰位由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度<1.00mmol/L时，其荧光强度及峰位变化不大。当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度的增加，荧光强度又迅速下降，但最大发射峰位仍为340nm.HgCl2浓度为10.00mmol/L时，其荧光强度降至10.4%.
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图3 在不同浓度HgCl2溶液中PLAP的荧光发射光谱
①～⑨分别表示在0,0.25,0.50,0.75,1.00,2.50,5.00,7.50,10.00mmol/L HgCl2溶液中，PLAP的荧光发射光谱
2.4 PLAP活力与构象变化的比较
酶的荧光强度、最大发射波长及活力的变化如图4所示。由图4可见，当HgCl2浓度为0.25mmol/L时，酶活力及其荧光强度迅速下降，最大发射波长由347nm蓝移至340nm；HgCl2浓度<1.00mmol/L时，酶活力、荧光强度及最大发射波长均变化不明显；当HgCl2浓度>1.00mmol/L时，随其浓度的增加，酶活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变；当HgCl2浓度增至10.00mmol/L时，酶仍有活力，荧光亦未淬灭。
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图4 不同浓度HgCl2中PLAP活力、荧光强度及最大发射峰值的比较
①酶活力曲线，②相对荧光强度曲线，③最大发射峰位曲线
3 讨 论
PLAP的溶解形式为二聚体，每个亚基含有4个色氨酸残基和16个酪氨酸残基〔2〕。观测这些残基所产生的荧光变化，可以帮助了解其构象的变化概况。结果显示，不同浓度的HgCl2均使PLAP荧光光谱的最大发射峰位蓝移，据此可以推测,HgCl2使PLAP分子上的色氨酸残基处于更加非极性微区〔6〕，提示酶分子更加紧缩。由于PLAP分子的紧缩而导致其荧光强度的下降，荧光强度的下降是处于更加非极性微区的色氨酸和酪氨酸残基共同作用的结果〔7〕。一方面色氨酸残基使其荧光强度升高，而另一方面酪氨酸残基由于酚羟基的解离减少，使其荧光强度降低，总结果是HgCl2的存在降低了PLAP的荧光强度。至于PLAP分子紧缩的原因，可能是由于Hg2+与酶分子中的某些侧链基团(如巯基、咪唑基等)形成螯合物所致。
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PLAP构象与活力变化的比较结果表明，HgCl2对PLAP的影响是一个复杂过程，大体上可分为两个阶段，一是低浓度Hg2+(HgCl2<1.00mmol/L)使PLAP活力和荧光强度骤降后经历了一个相对稳定区(HgCl2浓度为0.25～1.00mmol/L时)，并伴有峰位的蓝移，这可能是因为低浓度的Hg2+与酶分子表面或内埋较浅的某些侧链基团螯合所致；另一个阶段是HgCl2浓度>1.00mmol/L时，PLAP活力和荧光强度又快速下降，但峰位不变，这可能是因为较高浓度的Hg2+与酶分子上内埋较深的某些侧链基团螯合所致。 Hg2+与酶蛋白氨基酸残基的螯合导致酶活性中心紧缩，从而降低了其柔性。活性中心的柔性是酶充分表现其催化活性所必需的〔8〕，酶活性中心的柔性太小，不利于酶与底物的结合与催化，表现为Km值增大，Vmax降低，故Hg2+对PLAP呈现非竞争性与竞争性混合性抑制。不同浓度的Hg2+均无PLAP荧光光谱峰位的红移，提示在该测定条件下酶并未变性。
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综上所述，Hg2+对PLAP抑制的分子机制是Hg2+与酶分子中某些氨基酸残基螯合后，降低了酶活性中心的柔性，从而降低了酶活性。至于Hg2+与酶分子中哪些侧链基团螯合，有待进一步探讨。
本文为山东省卫生厅科研基金资助课题(批准号：95036)
参考文献
1 Fishman WH. Alkaline phosphatase isozymes:recent progress. Clin Biochem,1990,23:99
2 Millan JL. Molecular cloning and sequence analysis of human placental alkaline phosphatase. J Biol Chem,1986,261(7):3112
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3 Makiya R,Stigbrand T. Placental alkaline phosphatase as the placental IgG receptor. Clin Chem,1992,38(12):2543
4 耿芳宋,王秀丽,张金玉,等. 人类胎盘碱性磷酸酶的分离纯化.青岛医学院学报, 1998,34(2):84
5 Hoylaerts MF,Manes T,Millan JL. Molecular mechanism of uncompetitive inhibition of human placental and germ-cell alkaline phosphatase.Biochem J,1992,286:23
6 袁志安,陈挹芳. 鸡肝二氢叶酸还原酶的胍变性. 生物化学与生物物理学报,1989,21(4):74
7 耿芳宋,王秀丽,童家明,等. 盐酸胍对人类胎盘碱性磷酸酶构象与活力的影响. 生物物理学报，1998,14(3):385
8 邹承鲁. 活性部位的柔性为酶充分表现其催化活性所必需. 生物化学与生物物理学报,1992,24(5):393
(1998-07-13收稿 1999-02-10修回), http://www.100md.com