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编号:10265257
海风藤酮对小鼠抗着床作用的免疫组织化学观察
http://www.100md.com 《青岛大学医学院学报》 1999年第1期
     作者:吴 梅 王文青 吴翠娇 于向民 潘晓亮 方丽华

    单位:青岛医学院组织学与胚胎学教研室(青岛 266021)

    关键词:胚泡;细胞外基质;免疫组织化学;海风藤酮;小鼠

    青岛医学院学报990102 【摘要】 ①目的 观察海风藤酮对小鼠胚泡着床的影响。②方法 未经产雌性昆明小白鼠于妊娠第2天,一侧子宫角内分别注射不同剂量海风藤酮(5,10,20,40,60 μL)作为实验组,另一侧子宫角注射相应剂量的生理盐水为对照。于妊娠第8天及第10天,取子宫组织做常规石蜡切片,HE及免疫组织化学染色,光镜观察。③结果 注入海风藤酮(≥20 μL)组子宫蜕膜变薄,层粘连蛋白(Ln)免疫阳性物减少,纤粘连蛋白(Fn)免疫阳性物增多,并伴有不同程度胚胎发育迟缓及退化等改变。大剂量海风藤酮(≥40 μL)组部分动物子宫内膜无蜕膜反应,而且胚胎已消失。④结论 海风藤酮通过拮抗血小板激活因子影响蜕膜反应,并使Ln及Fn 的量和分布发生异常改变。这可能是该药抗着床作用的重要途径之一。
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    中国图书资料分类法分类号 Q246

    THE INFLUENCE OF KADSURENONE UPON BLASTOCYST IMPLANTATION IN MICE——IMMUNOHISTOCHEMICAL STUDIES

    Wu Mei,Wang Wenqing,Wu Cuijiao,et al

    Department of Histology and Embryology, Qingdao Medical College, Qingdao 266021

    【ABSTRACT】 Objective To investigate the influence of Kadsurenone (an antagonist of platelet activity factor PAF) upon implantation of mouse blastocyst. Methods Fifty-two female healthy mice, mating with male healthy mice of the same breed, in proportion as 2 to 1. The 1st day of pregnancy was determined by the presence of vaginal plug. On the 2nd day of pregnancy, Kadsurenone in different dosages were injected into the uterohorn of one side of mice, equal amount of physiological saline were injected into the uterohorn of the other side. On the 8th day or the 10th day of pregnancy, the histological changes of uterus as well as fetus were observed after the tissue being treated with immunohistochemistry. Results In the experimental groups with Kadsurenone ≥20μL, the decidua became thinner , Laminin immuno-reactivity reduced, while fibronectin immuno-reactivity increased, in association with retarded development and even retrogressive degeneration of mouse fetuses compared with the control groups. In groups with Kadsurenone≥40μL, there's no decidualization of uterus, the blastocyst was digsested. Conclusion By the mechanism of anti-PAF , Kadsurenone impaired the decidualization of uterus and influenced on the composition and distribution of extracellular matrix(e.g. Ln and Fn), which might be one of the mechanisms of Kadsurenone against implantation.
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    【KEY WORDS】 extracellular matrix; immunohistochemistry; mouse

    小鼠胚泡在植入过程中,子宫内膜基质细胞向蜕膜细胞分化并向其周围分泌细胞外基质(ECM),其主要成分是层粘连蛋白(Ln)、纤粘连蛋白(Fn) 及Ⅳ型胶原蛋白等。 滋养细胞与蜕膜细胞之间以及与蜕膜ECM之间的相互作用,在很大程度上影响着胚泡的正常植入。许多实验已证明,Ln和Fn在胚泡植入过程中起重要作用〔1~5〕。近年来研究还发现,蜕膜细胞可分泌一种多肽分子——血小板激活因子(PAF),能传递胚泡着床的信号,并在整个植入过程中起促进作用〔6〕。 海风藤酮是PAF的特异拮抗剂,有明显的抗着床作用〔7〕,但其作用机理尚不明确。本实验通过免疫组织化学方法,研究海风藤酮在小鼠胚泡植入时,对小鼠子宫组织学及组织化学的影响, 以探讨其抗着床作用的机理。
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    1 材料和方法

    1.1 动物处理

    选用纯种未经产雌性昆明系小白鼠52只,体质量25~30g(动物由青岛市药物检验所实验中心提供)。当晚按雌雄2∶1合笼交配。次日晨发现阴栓者定为妊娠第1天。于妊娠第2天,在10g/L戊巴比妥腹腔麻醉下,剖腹暴露两侧子宫。一侧子宫角内分别注射不同剂量(5,10,20,40,60 μL,50 g/L)海风藤酮(由北京医科大学提供)作为实验组, 于另一侧子宫角内注射相应剂量生理盐水作为实验对照组。其中3只正常妊娠雌鼠未做任何处理,作为实验的空白对照组。

    1.2 标本制备

    上述动物分别在妊娠第8天和第10天,经40g/L多聚甲醛与25g/L戊二醛混合液灌注固定,剖腹肉眼观察子宫并记录胚泡数目。取材后常规石蜡包埋, 7 μm连续切片,每隔10片取1片,每1张涂有明胶的载片上同时裱贴有4种不同剂量的子宫切片。免疫组织化学染色,部分切片HE染色。
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    1.3 免疫组织化学染色

    免疫组织化学ABC法染色。兔Ln抗血清(1∶2 000)、兔Fn抗血清(1∶1 000)均由北京医科大学细胞生物室提供;羊抗兔Ig-bio(1∶200)、ABC复合物(1∶200)均由北京中山生物技术有限公司提供。DAB-H2O2液显色,苏木精复染。方法对照以PBS代替上述抗血清。

    2 结 果

    2.1 肉眼及一般组织学观察

    肉眼观察可见,空白对照及实验对照组小鼠于妊娠第8天及第10天子宫较粗呈淡红色,胚泡发育较一致,呈串珠状均匀分布于子宫壁内。实验组相应时间的妊娠子宫直径粗细不等,呈暗红色淤血状。胚泡大小不等而且分布不均。 胚泡总数明显少于对照组,见表1.其中3例子宫直径很细,无结节状外观。光镜下对照组妊娠第8天子宫内膜的蜕膜反应明显,但胎盘发育尚不完善。 胚胎发育良好,神经管已初步形成;妊娠第10天子宫蜕膜较厚,胎盘已形成,绒毛结构发达,绒毛间隙内见有少量血细胞分布。子宫蜕膜与胎膜间可见有大量星形巨细胞分布,并且相互连接呈网状,胚胎内神经管已初步分化。实验组小鼠妊娠第8天及第10天,子宫蜕膜均较相应对照组薄,妊娠第10 天绒毛间隙内见有大量白细胞浸润,星形巨细胞呈网络样,结构松散(图1)。实验组中3例(40 μL组1 例;60 μL组2例)已失去结节状外观的子宫,镜下观察内膜较薄,未见蜕膜反应, 胎体已消失(图2)。
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    表1 海风藤酮对小鼠胚泡数量的影响(个) 组别

    体积(V/μL)

    5

    10

    20

    40

    60

    对照组

    84

    44

    76

    32

    37
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    实验驵

    97

    38

    51

    23

    24

    图1 海风藤酮60 μL组:妊娠第10 天,可见胚胎已退化,绒毛结构松散 HE×40

    图2 海风藤酮40μL组:妊娠第8天.子宫内膜反应已被阻断,胚胎已消失 HE×200

    2.2 免疫组织化学观察
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    2.2.1 Ln染色 Ln免疫阳性物呈棕黑色,不着色为阴性。对照组小鼠妊娠第8天和第10天,Ln免疫阳性物广泛分布于子宫内膜的上皮基膜、子宫腺基膜、绒毛滋养细胞及基膜和蜕膜细胞周围的基质中(图3,4)。对照组小鼠妊娠第10 天星形巨细胞胞浆内有较多Ln免疫阳性物(图5)。方法对照切片呈阴性。给予海风藤酮5μL和10μL组,Ln免疫反应强度及分布未见明显变化。海风藤酮≥20μL组,Ln免疫阳性物均少于对照组,蜕膜细胞周围最明显(图6,7)。妊娠第10天实验组星形巨细胞内Ln免疫阳性物也较相应对照组减少(图8)。

    图3 生理盐水20μL组:妊娠第8天.可见大量免疫反应阳性物广泛分布于绒毛上皮 ×200

    图4 空白对照作组μL组:妊娠第8天,蜕膜细胞周围的中见有较多免疫反应阳性物 ×400
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    图5 生理盐水20μL组:妊娠第10天,星形巨细胞浆内及胞膜周围呈较强免疫阳性反应 ×200

    图6 海风藤酮60μL组:妊娠第8天.绒毛结构破坏未见明显免疫反应阳性物 ×200

    图7 海风藤酮20μL组:妊娠第8天,蜕膜细胞周围免疫反应阳性物质明显减少 ×400

    图8 海风藤酮40μL组:妊娠第10天,星形巨细胞网络样结构松散,细胞内免疫反应阳性长期的明显减少 ×200

    2.2.2 Fn染色 对照组妊娠第8天和第10天,Fn免疫阳性物弥散分布于蜕膜及其绒毛基质内,反应强度较弱(图9)。偶见黏膜上皮细胞内含有Fn免疫阳性颗粒。黏膜上皮、子宫腺体及滋养上皮的基膜均呈阴性。方法对照切片也呈阴性。 实验组Fn免疫反应强度随给药剂量的增加而增加。大剂量海风藤酮(≥40μL)组,绒毛中出现较多强阳性反应细胞(图10)。此类细胞多呈圆形,细胞内呈黑色的Fn免疫阳性物已遮盖住胞核的轮廓。此类细胞呈散在分布。实验组妊娠第10天也见有数量不等的呈Fn免疫反应阳性的星形巨细胞。
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    图9 生理盐水10μL组:妊娠第10天,免疫反应阳性物弥散分布于绒毛基质内,反应强度较弱 ×200

    图10 海风藤酮40μL组:妊娠第10天,绒毛中见有大量呈免疫反应强阳性的细胞 ×400

    3 讨 论

    蜕膜是妊娠子宫内膜的特化结构,是在多种激素(雌激素、孕激素等)和多种因子(PAF,转移生长因子等)的持续刺激下形成的。蜕膜细胞可调控胚泡的着床,保护其免受母体的免疫机制的排斥,并具有分泌催乳素和合成ECM等重要作用〔4~6〕。ECM是联系母体蜕膜细胞与子体滋养细胞的一种含有多种化学成分的介质。许多实验显示,ECM中的Ln在胚泡植入中起重要的促进作用〔1,2,4,5,8〕 ,特别是分布在黏膜上皮基膜中的Ln,是胚泡植入时最先接触的ECM,可促进胚泡黏附于子宫黏膜上。本实验观察到给予一定剂量(≥20 μL)的海风藤酮后,子宫蜕膜变薄,并且黏膜上皮基膜及蜕膜ECM中Ln明显减少,这可能是海风藤酮抑制胚泡着床的一个重要途径。本实验还观察到,随着给药剂量的增加,Fn免疫阳性物有增多的趋势。在大剂量(≥40μL)实验组中,绒毛中轴处出现许多Fn免疫阳性细胞。关于Fn在整个植入过程的作用,目前仍存在争议。 部分学者认为Fn的合成与胶原纤维的形成呈平行关系〔5〕。当阻碍Fn的合成时, 胶原纤维的形成也受到阻碍。在月经周期的分泌期中,Fn及胶原纤维的含量均最少, 这对胚泡顺利地植入子宫内膜并在此正常生长发育是很有利的〔4〕。 但有学者则持不同观点〔9〕。本实验显示,海风藤酮能促进Fn的合成。大量Fn合成同时伴有大量胶原的形成,致使子宫内膜较坚韧,胚泡难以穿入,这可能是海风藤酮抗着床的又一重要途径。大剂量(≥40μL)的海风藤酮可以完全阻止胚泡着床, 并可阻止子宫内膜的蜕膜反应。类似的现象曾在醋酸棉酚抗着床的研究中有过报道〔10〕。至于海风藤酮促使ECM中Ln和Fn发生明显的量及分布变化的原因,目前尚不十分清楚。PAF是一 种具有多种生物活性的物质。内源性PAF可促进蜕膜反应,并可通过其特异性受体直接作用于蜕膜和胚泡上的一些靶细胞(如参与合成Ln和Fn的蜕膜细胞和巨细胞等),以促进胚泡的着床。另外,PAF还可促进蜕膜血管的扩张,从而使蜕膜呈水肿状并富含营养成分,利于妊娠的维持。妊娠早期子宫内膜中的PAF活性很强〔6〕,故于妊娠第2天宫内给予海风藤酮,竞争性地抑制内膜中PAF,使PAF的作用阻断,结果使多数胚泡发育受阻,子宫蜕膜变薄并退化变性,ECM中Ln和Fn的量及分布也发生异常改变,从而影响胚泡植入和胚胎的正常发育。
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    (本文承蒙北京医科大学刘斌教授、山东医科大学高英茂教授及北京中医药大学叶百宽教授的精心指导,特此致谢!)。

    本文为山东省自然科学基金资助课题(批准号:Y95C1941)

    参考文献

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    3 许复华. 纤连蛋白在生殖过程中的作用研究进展.生殖与避孕,1994, 14(5):323
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    4 史小林, 诸守寿, 翁 静,等.人子宫内膜细胞外基质在月经周期中变化研究.生殖与避孕,1994,14(6):407

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    10 杨纫姝,张艳红, 瞿阿香. 宫内一次给予醋酸棉酚对雌性大鼠的抗着床作用及其机理分析. 生殖与避孕,1986,6(4):27

    (1998-04-08收稿 1998-12-29修回), 百拇医药