慢性缺氧所致肺血管结构改建机制的探讨
作者：刘帆 陈瑞芬 刘国贞 宋爱利
单位：刘帆 首都医科大学附属北京友谊医院实验中心；陈瑞芬 刘国贞 宋爱利 首都医科大学病理解剖学教研室
关键词：慢性缺氧；血管改建；病理变化
首都医科大学学报990108 提要： 利用常压缺氧舱建立大鼠肺缺氧模型，通过HE、VG、免疫组化染色及电镜，观察慢性缺氧所致的肺血管结构改建。发现其结构改建主要表现为：①肺动脉外膜胶原纤维增生；②肺外周肌性小动脉中膜增厚；③肺泡内无肌性小动脉肌型化。并对慢性缺氧所致肺血管结构改建的机制进行了探讨。
中图分类号： R365.56
Mechanism of Pulmonary Vascular Structure Remodeling Induced by Chronic Hypoxia
, 百拇医药
Liu Fan
Laboratory Center, Beijing Frendship Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Chen Ruifen, Liu Guozhen, Song Aili
Department of Pathology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: Rat was used as the hypoxia model by being kept in the normobaric hypoxia chamber. The lung sections were stained with routine HE, VG and immunohistochemical methods. Some specimens were examined by electromicroscope. Results showed that the remodeling of the pulmonary vascular structure under chronic hypoxia included: ① significant proliferation of the adventitial collagen fiber in pulmonary arteries. ②hypertrophy of the medial coat of peripheral muscular arterioles and ③ muscularization of the nonvascular arterioles in the alveolar septa.
, 百拇医药
Key words: chronic hypoxia; remodeling of vascular structure; pathologic changes
缺氧，尤其是慢性中度缺氧常是导致肺动脉高压形成的重要原因，其机制与肺动脉在结构与功能上的变化有关。目前，临床上肺动脉高压、肺心病的发病率较高，为了进一步了解其发生、发展过程，需要建立肺缺氧、肺动脉高压的动物模型，对肺血管结构的改建及其机制进行研究。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
实验用成年雄性SD大鼠40只(首都医科大学动物室提供)，体质量200～250 g，分为正常对照组和缺氧3、7、14 d共4组，每组10只动物。
自制缺氧装置，缺氧舱为直径40 cm，高33 cm的圆柱形玻璃缸及有机玻璃盖，2个入气孔分别通入氧和氮，出气孔连接气体体积分数测定仪，以了解舱内气体体积分数变化情况。
, 百拇医药
将实验动物放入缺氧舱内，首先通入氮气，使舱内氧体积分数下降至9%～10%。待氧体积分数恒定后开始计时。各组动物在缺氧舱内饲养到期后，于离开缺氧舱1 h内进行手术处理。分离组织，取出肺脏，分别放入甲醛固定液用于石蜡切片，放入戊二醛固定液用于电镜切片。
1.2 切片染色
石蜡切片进行常规HE染色及以下特殊染色：①Van-Gieson(VG)染色，染色结果胶原纤维呈红至粉红色，肌肉呈黄色，细胞核呈黑色。②石蜡切片α-smooth muscle actin(α-SMA)免疫组化染色(ABC法)。一抗：α-SMA单克隆抗体，效价1∶400，由Sigma公司提供。ABC染色棕黄色颗粒沉着处为阳性。
1.3 电镜切片制作
将缺氧2周的大鼠肺组织放入戊二醛中固定4 h，再经锇酸固定、清洗与脱水，浸透包埋，超薄切片，日立电子显微镜下观察、拍照。
, 百拇医药
1.4 结果测量
大肺动脉管壁厚度与外膜胶原纤维厚度的测量：每组10张VG染色切片，选取肺门部直径为1 mm、基本相同的肺动脉，用测微尺在显微镜高倍视野下测量其管壁厚度和外膜胶原纤维的厚度，并计算外膜胶原纤维厚度在管壁厚度中所占比例。
肺泡内小动脉分类计数：用计数器在400倍视野中，分别计数每组10张VG染色切片中，肺泡水平位上直径小于50 μm的肌性小动脉、部分肌性小动脉、无肌性小动脉的数量及其所占比例。
1.5 统计学方法
统计学处理采用方差分析法。
2 结果
2.1 胶原纤维增生的测量与观察
表1列出了肺内大动脉管壁的厚度和外膜胶原纤维厚度。
, 百拇医药
表1 肺内大动脉管壁厚度(d管)和胶原纤维厚度(d胶) 分组
d胶/μm
d管/μm
d胶/d管
正常对照组
15.26±2.96
57.93±3.69
0.26
缺氧3 d组
37.04±3.88**
, 百拇医药
80.46±4.78*
0.46*
缺氧7 d组
36.99±3.96**
87.69±3.33*
0.43*
缺氧14 d组
38.67±4.23**
96.33±2.12*
0.40*
, 百拇医药
每组n=10；**与对照组比较P<0.01，*任意2组比较P<0.05
除厚度变化外，随缺氧时间的延长，肺动脉壁胶原纤维的密度亦逐渐增加，在VG染色切片中胶原纤维的染色由疏松淡染转化为致密浓染(图1、2)。
肺内中、小型动脉外膜胶原纤维增生的观察：在正常对照组中，中、小型动脉均有薄层疏松的胶原纤维围绕，其平均厚度为2～5 μm(图3)。实验组随缺氧时间的延长，中型动脉壁的胶原纤维厚度逐渐增加。缺氧14 d时，其厚度可达平均8 μm，致密程度也有所增加(图4)。
2.2 肺内小动脉肌化观察结果
正常对照组：肺泡水平上直径小于50 μm的小动脉多为无肌性小动脉。无肌性小动脉约占小动脉总数的86%，肌性和部分肌性小动脉只占14%。实验组：随缺氧时间的延长，肺内无肌性小动脉出现逐渐加重的肌化现象，缺氧第14天，肺内肌性小动脉和部分肌性小动脉可占总数的42%，而无肌性小动脉则降至58%。随缺氧时间的延长，实验组肺内肌性小动脉中膜厚度亦明显增加。
, 百拇医药
正常对照组：肺泡水平上直径小于50 μm的肌性小动脉中膜有少量平滑肌，其厚度约为1～3 μm。缺氧14 d组：肺泡水平上直径小于50 μm的肌性小动脉中膜平滑肌增厚，其厚度为8～11 μm，管腔明显变窄(图5)。
2.3 肺内α-SMA免疫组化染色结果
正常对照组：α-SMA阳性细胞主要见于肌性血管中膜、支气管肌层。另外，肺泡开口膨大处亦可见少量α-SMA阳性细胞，肺泡隔内偶见α-SMA阳性细胞。
实验组：α-SMA阳性反应范围较对照组明显扩大，肌性动脉中膜增宽并呈阳性反应，肺泡开口处α-SMA阳性细胞数量增多，肺泡间隔内出现多量α-SMA阳性细胞。
2.4 肺间质电镜观察结果
正常对照组：肺泡隔内可见较多的成纤维细胞，未见肌纤维母细胞。实验组：随缺氧时间的延长，肺泡隔内肌纤维母细胞及成熟的平滑肌细胞易见(图6)。
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图1 正常对照组肺门部大动脉VG染色片 VG×200
图2 缺氧14 d组肺门部大动脉VG染色片 中膜平滑肌及外膜胶原纤维较对照组增生明显，胶原纤维排列致密 VG×200
图3 正常对照组中型动脉VG染色片 VG×200
图4 缺氧14 d组中型动脉VG染色片 中膜平滑肌增生和外膜胶原纤维增厚 VG×200
图5 缺氧14 d组肺泡水平位上直径小于50 μm的小动脉VG染色片 无肌性小动脉肌型化，平滑肌增生，管壁增厚 VG×400
图6 肺泡间隔肌纤维母细胞电镜片 细胞胞浆丰富，含有丰富的细胞器，分泌胶原纤维，含肌微丝及密斑，细胞间连接呈缝隙连接，具有纤维细胞和平滑肌细胞的双重特点 ×8 000
, http://www.100md.com
3 讨论
肺血管结构的改建是缺氧性肺动脉高压形成的基础。本研究通过VG染色，系统地观察了缺氧3、7、14 d肺血管结构的动态变化，并通过α-SMA免疫组化染色，进一步探讨了肺动脉结构改建的形成机制。
3.1 肺动脉外膜胶原纤维增生
肺动脉外膜胶原纤维增生是缺氧过程中发生较早的一种结构改变，动脉外膜胶原纤维厚度的测量结果(见表1)表明：在缺氧前3 d，大动脉外膜的纤维结缔组织表现出极迅速的增生反应，使外膜胶原纤维的厚度较对照组增加2～3倍，而中膜平滑肌的改变并不明显。这样就使外膜胶原纤维的厚度在整个管壁厚度中所占的比例增加(由正常对照组的0.26上升到0.46)。缺氧3～14 d，外膜胶原纤维厚度增加不明显，而致密程度有所增加；同时此阶段中膜平滑肌的厚度增加，外膜胶原纤维厚度在管壁厚度中所占比例有所下降。另外，中、小型动脉外膜的胶原纤维在慢性缺氧过程中亦有一定程度的增生。而这2种类型的血管在肺循环压力的形成中起着更为重要的作用，其外膜胶原纤维的增生必然使血管壁增厚变硬，血流阻力增加，肺动脉压力增高。因此，胶原纤维的增生在肺动脉高压的形成中也起到一定的作用。慢性缺氧时，胶原纤维的来源可能有2条途径：其一，肺动脉外膜成纤维细胞在缺氧早期发生迅速的增生反应，同时合成大量的胶原纤维；其二，中膜新生的平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型，亦能产生一定量的胶原纤维沉积在动脉中膜和外膜[1]。
, 百拇医药
3.2 肺小动脉肌型化
正常情况下，在肺泡水平位上，直径小于50 μm的小动脉多为无肌性小动脉，而肌性和部分肌性小动脉只占14%左右。随缺氧时间的延长，肺内小动脉出现逐渐加重的肌化现象。到缺氧第14天时，肌性和部分肌性小动脉可占到小动脉总数的42%，同时肌性小动脉中膜的厚度亦明显增加，肺泡水平位上出现多量管壁厚、管腔狭窄的小动脉。肺微细动脉的肌化使肺血管收缩部位由肺泡外血管延伸到肺泡内血管，而肺泡内无肌性小动脉在肺的血压调节中起着重要的缓冲作用，其数量的减少是肺动脉高压形成的关键[2]。关于肌化过程中平滑肌的来源仍有争议，过去许多学者认为其来源于近端肌性小动脉中膜平滑肌细胞的增生并向远端迁移。而近年来，许多学者对一些具有收缩潜力的中间型非肌性细胞，如血管外膜细胞、肌纤维母细胞等所谓平滑肌前细胞在肺血管床肌化中的作用越来越重视。
α-SMA是6种平滑肌肌动蛋白异构型中的1种，可表达于中间型非肌性细胞中，标志着这些细胞开始具有向平滑肌细胞分化的趋势[3]。本研究通过α-SMA免疫组化染色，发现随缺氧时间的延长，肺内小于50 μm的小动脉内膜下出现阳性细胞的比例大于正常对照组，肺泡间隔内出现较多的阳性细胞。超微结构研究显示，缺氧14 d组肺泡间隔内出现胞浆内含肌丝的肌纤维母细胞及成熟的平滑肌细胞。以上结果表明，慢性缺氧不仅可使肺肌性血管中膜平滑肌细胞增生，并且使肺间质内α-SMA阳性肌纤维母细胞增多，且向平滑肌方向分化。提示肺微细血管肌化可能来自间质中间型非肌性细胞，但也不能排除肌性血管中膜平滑肌细胞向远端微血管迁移而致血管床肌化的可能[4]。
, 百拇医药
参考文献
1 Meyrick B, Reid L. Hypoxia-induced structure changes in the media and adventitia of the rat hilar pulmonary artery and their regression. Am J Pathol, 1979, 100:151
2 Smith P. Ultrastructures of the lung in chronic hypoxia. Thorax, 1994, 49:S27～S32
3 Skalli O. Myofibroblasts from diverse pathologic setting are heterognous in their content of actin isoforns and intermediate filament proteins. Lab Invest, 1989,60:275
4 Leslic K O. Lang myofibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton, 1992,22:91
收稿日期：1998-06-22, 百拇医药
单位：刘帆 首都医科大学附属北京友谊医院实验中心；陈瑞芬 刘国贞 宋爱利 首都医科大学病理解剖学教研室
关键词：慢性缺氧；血管改建；病理变化
首都医科大学学报990108 提要： 利用常压缺氧舱建立大鼠肺缺氧模型，通过HE、VG、免疫组化染色及电镜，观察慢性缺氧所致的肺血管结构改建。发现其结构改建主要表现为：①肺动脉外膜胶原纤维增生；②肺外周肌性小动脉中膜增厚；③肺泡内无肌性小动脉肌型化。并对慢性缺氧所致肺血管结构改建的机制进行了探讨。
中图分类号： R365.56
Mechanism of Pulmonary Vascular Structure Remodeling Induced by Chronic Hypoxia
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Liu Fan
Laboratory Center, Beijing Frendship Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences
Chen Ruifen, Liu Guozhen, Song Aili
Department of Pathology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: Rat was used as the hypoxia model by being kept in the normobaric hypoxia chamber. The lung sections were stained with routine HE, VG and immunohistochemical methods. Some specimens were examined by electromicroscope. Results showed that the remodeling of the pulmonary vascular structure under chronic hypoxia included: ① significant proliferation of the adventitial collagen fiber in pulmonary arteries. ②hypertrophy of the medial coat of peripheral muscular arterioles and ③ muscularization of the nonvascular arterioles in the alveolar septa.
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Key words: chronic hypoxia; remodeling of vascular structure; pathologic changes
缺氧，尤其是慢性中度缺氧常是导致肺动脉高压形成的重要原因，其机制与肺动脉在结构与功能上的变化有关。目前，临床上肺动脉高压、肺心病的发病率较高，为了进一步了解其发生、发展过程，需要建立肺缺氧、肺动脉高压的动物模型，对肺血管结构的改建及其机制进行研究。
1 材料和方法
1.1 动物模型的建立
实验用成年雄性SD大鼠40只(首都医科大学动物室提供)，体质量200～250 g，分为正常对照组和缺氧3、7、14 d共4组，每组10只动物。
自制缺氧装置，缺氧舱为直径40 cm，高33 cm的圆柱形玻璃缸及有机玻璃盖，2个入气孔分别通入氧和氮，出气孔连接气体体积分数测定仪，以了解舱内气体体积分数变化情况。
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将实验动物放入缺氧舱内，首先通入氮气，使舱内氧体积分数下降至9%～10%。待氧体积分数恒定后开始计时。各组动物在缺氧舱内饲养到期后，于离开缺氧舱1 h内进行手术处理。分离组织，取出肺脏，分别放入甲醛固定液用于石蜡切片，放入戊二醛固定液用于电镜切片。
1.2 切片染色
石蜡切片进行常规HE染色及以下特殊染色：①Van-Gieson(VG)染色，染色结果胶原纤维呈红至粉红色，肌肉呈黄色，细胞核呈黑色。②石蜡切片α-smooth muscle actin(α-SMA)免疫组化染色(ABC法)。一抗：α-SMA单克隆抗体，效价1∶400，由Sigma公司提供。ABC染色棕黄色颗粒沉着处为阳性。
1.3 电镜切片制作
将缺氧2周的大鼠肺组织放入戊二醛中固定4 h，再经锇酸固定、清洗与脱水，浸透包埋，超薄切片，日立电子显微镜下观察、拍照。
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1.4 结果测量
大肺动脉管壁厚度与外膜胶原纤维厚度的测量：每组10张VG染色切片，选取肺门部直径为1 mm、基本相同的肺动脉，用测微尺在显微镜高倍视野下测量其管壁厚度和外膜胶原纤维的厚度，并计算外膜胶原纤维厚度在管壁厚度中所占比例。
肺泡内小动脉分类计数：用计数器在400倍视野中，分别计数每组10张VG染色切片中，肺泡水平位上直径小于50 μm的肌性小动脉、部分肌性小动脉、无肌性小动脉的数量及其所占比例。
1.5 统计学方法
统计学处理采用方差分析法。
2 结果
2.1 胶原纤维增生的测量与观察
表1列出了肺内大动脉管壁的厚度和外膜胶原纤维厚度。
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表1 肺内大动脉管壁厚度(d管)和胶原纤维厚度(d胶) 分组
d胶/μm
d管/μm
d胶/d管
正常对照组
15.26±2.96
57.93±3.69
0.26
缺氧3 d组
37.04±3.88**
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80.46±4.78*
0.46*
缺氧7 d组
36.99±3.96**
87.69±3.33*
0.43*
缺氧14 d组
38.67±4.23**
96.33±2.12*
0.40*
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每组n=10；**与对照组比较P<0.01，*任意2组比较P<0.05
除厚度变化外，随缺氧时间的延长，肺动脉壁胶原纤维的密度亦逐渐增加，在VG染色切片中胶原纤维的染色由疏松淡染转化为致密浓染(图1、2)。
肺内中、小型动脉外膜胶原纤维增生的观察：在正常对照组中，中、小型动脉均有薄层疏松的胶原纤维围绕，其平均厚度为2～5 μm(图3)。实验组随缺氧时间的延长，中型动脉壁的胶原纤维厚度逐渐增加。缺氧14 d时，其厚度可达平均8 μm，致密程度也有所增加(图4)。
2.2 肺内小动脉肌化观察结果
正常对照组：肺泡水平上直径小于50 μm的小动脉多为无肌性小动脉。无肌性小动脉约占小动脉总数的86%，肌性和部分肌性小动脉只占14%。实验组：随缺氧时间的延长，肺内无肌性小动脉出现逐渐加重的肌化现象，缺氧第14天，肺内肌性小动脉和部分肌性小动脉可占总数的42%，而无肌性小动脉则降至58%。随缺氧时间的延长，实验组肺内肌性小动脉中膜厚度亦明显增加。
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正常对照组：肺泡水平上直径小于50 μm的肌性小动脉中膜有少量平滑肌，其厚度约为1～3 μm。缺氧14 d组：肺泡水平上直径小于50 μm的肌性小动脉中膜平滑肌增厚，其厚度为8～11 μm，管腔明显变窄(图5)。
2.3 肺内α-SMA免疫组化染色结果
正常对照组：α-SMA阳性细胞主要见于肌性血管中膜、支气管肌层。另外，肺泡开口膨大处亦可见少量α-SMA阳性细胞，肺泡隔内偶见α-SMA阳性细胞。
实验组：α-SMA阳性反应范围较对照组明显扩大，肌性动脉中膜增宽并呈阳性反应，肺泡开口处α-SMA阳性细胞数量增多，肺泡间隔内出现多量α-SMA阳性细胞。
2.4 肺间质电镜观察结果
正常对照组：肺泡隔内可见较多的成纤维细胞，未见肌纤维母细胞。实验组：随缺氧时间的延长，肺泡隔内肌纤维母细胞及成熟的平滑肌细胞易见(图6)。
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图1 正常对照组肺门部大动脉VG染色片 VG×200
图2 缺氧14 d组肺门部大动脉VG染色片 中膜平滑肌及外膜胶原纤维较对照组增生明显，胶原纤维排列致密 VG×200
图3 正常对照组中型动脉VG染色片 VG×200
图4 缺氧14 d组中型动脉VG染色片 中膜平滑肌增生和外膜胶原纤维增厚 VG×200
图5 缺氧14 d组肺泡水平位上直径小于50 μm的小动脉VG染色片 无肌性小动脉肌型化，平滑肌增生，管壁增厚 VG×400
图6 肺泡间隔肌纤维母细胞电镜片 细胞胞浆丰富，含有丰富的细胞器，分泌胶原纤维，含肌微丝及密斑，细胞间连接呈缝隙连接，具有纤维细胞和平滑肌细胞的双重特点 ×8 000
, http://www.100md.com
3 讨论
肺血管结构的改建是缺氧性肺动脉高压形成的基础。本研究通过VG染色，系统地观察了缺氧3、7、14 d肺血管结构的动态变化，并通过α-SMA免疫组化染色，进一步探讨了肺动脉结构改建的形成机制。
3.1 肺动脉外膜胶原纤维增生
肺动脉外膜胶原纤维增生是缺氧过程中发生较早的一种结构改变，动脉外膜胶原纤维厚度的测量结果(见表1)表明：在缺氧前3 d，大动脉外膜的纤维结缔组织表现出极迅速的增生反应，使外膜胶原纤维的厚度较对照组增加2～3倍，而中膜平滑肌的改变并不明显。这样就使外膜胶原纤维的厚度在整个管壁厚度中所占的比例增加(由正常对照组的0.26上升到0.46)。缺氧3～14 d，外膜胶原纤维厚度增加不明显，而致密程度有所增加；同时此阶段中膜平滑肌的厚度增加，外膜胶原纤维厚度在管壁厚度中所占比例有所下降。另外，中、小型动脉外膜的胶原纤维在慢性缺氧过程中亦有一定程度的增生。而这2种类型的血管在肺循环压力的形成中起着更为重要的作用，其外膜胶原纤维的增生必然使血管壁增厚变硬，血流阻力增加，肺动脉压力增高。因此，胶原纤维的增生在肺动脉高压的形成中也起到一定的作用。慢性缺氧时，胶原纤维的来源可能有2条途径：其一，肺动脉外膜成纤维细胞在缺氧早期发生迅速的增生反应，同时合成大量的胶原纤维；其二，中膜新生的平滑肌细胞由收缩表型转化为合成表型，亦能产生一定量的胶原纤维沉积在动脉中膜和外膜[1]。
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3.2 肺小动脉肌型化
正常情况下，在肺泡水平位上，直径小于50 μm的小动脉多为无肌性小动脉，而肌性和部分肌性小动脉只占14%左右。随缺氧时间的延长，肺内小动脉出现逐渐加重的肌化现象。到缺氧第14天时，肌性和部分肌性小动脉可占到小动脉总数的42%，同时肌性小动脉中膜的厚度亦明显增加，肺泡水平位上出现多量管壁厚、管腔狭窄的小动脉。肺微细动脉的肌化使肺血管收缩部位由肺泡外血管延伸到肺泡内血管，而肺泡内无肌性小动脉在肺的血压调节中起着重要的缓冲作用，其数量的减少是肺动脉高压形成的关键[2]。关于肌化过程中平滑肌的来源仍有争议，过去许多学者认为其来源于近端肌性小动脉中膜平滑肌细胞的增生并向远端迁移。而近年来，许多学者对一些具有收缩潜力的中间型非肌性细胞，如血管外膜细胞、肌纤维母细胞等所谓平滑肌前细胞在肺血管床肌化中的作用越来越重视。
α-SMA是6种平滑肌肌动蛋白异构型中的1种，可表达于中间型非肌性细胞中，标志着这些细胞开始具有向平滑肌细胞分化的趋势[3]。本研究通过α-SMA免疫组化染色，发现随缺氧时间的延长，肺内小于50 μm的小动脉内膜下出现阳性细胞的比例大于正常对照组，肺泡间隔内出现较多的阳性细胞。超微结构研究显示，缺氧14 d组肺泡间隔内出现胞浆内含肌丝的肌纤维母细胞及成熟的平滑肌细胞。以上结果表明，慢性缺氧不仅可使肺肌性血管中膜平滑肌细胞增生，并且使肺间质内α-SMA阳性肌纤维母细胞增多，且向平滑肌方向分化。提示肺微细血管肌化可能来自间质中间型非肌性细胞，但也不能排除肌性血管中膜平滑肌细胞向远端微血管迁移而致血管床肌化的可能[4]。
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参考文献
1 Meyrick B, Reid L. Hypoxia-induced structure changes in the media and adventitia of the rat hilar pulmonary artery and their regression. Am J Pathol, 1979, 100:151
2 Smith P. Ultrastructures of the lung in chronic hypoxia. Thorax, 1994, 49:S27～S32
3 Skalli O. Myofibroblasts from diverse pathologic setting are heterognous in their content of actin isoforns and intermediate filament proteins. Lab Invest, 1989,60:275
4 Leslic K O. Lang myofibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton, 1992,22:91
收稿日期：1998-06-22, 百拇医药