正常大鼠黑质纹状体系统一氧化氮合酶活性的分布
作者：吕合义 徐群渊 赵澎 张进禄 徐建兰
单位：首都医科大学北京神经科学研究所
关键词：一氧化氮合酶；NADPH脱氢酶；黑质；纹状体
首都医科大学学报990104 提要： 应用NADPH脱氢酶反应(NADPH-d反应)显示SD大鼠黑质纹状体系统内一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞和末梢，用计算机图像灰度仪测其染色强度。结果：正常大鼠纹状体内存在的阳性神经元和末梢分布位置不同；高密度末梢分布于纹状体腹外侧缘，此区细胞数亦较多；低密度区分布于纹状体背内侧区，阳性细胞数亦较少。苍白球、丘脑和黑质未见NOS阳性物质。
中图分类号： Q554.5； R332.81
The Activities of Nitric Oxide Synthase in the Neurons of the Nigro-striatal System in Rat Brain
, 百拇医药
Lü Heyi, Xu Qunyuan, Zhao Peng, Zhang Jinlu, Xu Jianlan
Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences
Abstract: The activites of nitric oxide synthase(NOS) in cell bodies and terminals of neurons in the nigro-striatal system were detected by using a histochemical method of nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPH-d) reaction in brain sections of the SD rat. The number of NOS-positive neurons and density of the NOS-positive terminals were counted under a DMRP biomicroscope. It was shown that the higher density of labled terminals and more labled neurons were located in the ventrolateral part of the striatum, while the lower density of terminals and less neurons in the dorsomedial part of the striatum. There were no terminals labled in the globus pallidus, substantial negra and thalamus. The results showed that the distributions of NOS-positive neurons may have certain functional significance for motor regulation and certain parts of NOS-positive terminals may be projected from the cerebral cortex.
, 百拇医药
Key words: nitric oxide synthase; NADPH-diaphorase; substantia negra; striatum
纹状体作为基底神经节信息处理通路中的重要环节，其组织结构和生理功能均相当复杂[1]。目前看来，一种与神经元信号传递密切相关的神经调节物质一氧化氮(nitric oxide, NO)在纹状体的生理活动和病理过程中起着重要作用。研究表明NO可引起内源性多巴胺(dopamine, DA)的释放且呈正比关系[2]；NO可影响纹状体神经元而引起DA含量的增加[3，4]。激活黑质M5型胆碱能受体可引起一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)活性增强[5]。同时，大量文献都报道了NO与神经细胞的信号传递和损伤有关[6]。鉴于纹状体内存在着复杂的往返纤维联系，因此，研究纹状体内含有NOS的外源性末梢和自身NOS阳性细胞的分布有重要意义。尽管过去对纹状体内存在NOS阳性细胞有过报道[6]，但并未进行过对NOS阳性末梢和细胞在纹状体内局部分布的研究。因此，本研究采用显示NADPH脱氢酶的组织化学方法来显示纹状体内的NOS阳性细胞及末梢，以探讨其布局特点。
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1 材料和方法
实验选用SD雌性大鼠6只，体质量180～250 g。动物经6%水合氯醛(5 mg/kg)麻醉后开胸，经升主动脉首先用100 mL生理盐水(37 ℃)冲洗血管，后用400 mL 4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4，4 ℃，含10%蔗糖)灌流固定40 min，迅速取脑，入20%蔗糖磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4，4 ℃)中过夜。恒冷箱连续切片，片厚50 μm，分成2套，按如下程序呈色：①0.1 mol/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4～7.6)洗片2次；②在含NADPH(0.2 g/L，Sigma公司)和NBT(0.1 g/L，Sigma公司)的磷酸缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4～7.6，含0.3% Triton X-100)中过夜；③0.1 mol/L PBS中止反应；④裱片；⑤其中1套用1%中性红复染；⑥透明、封片。
用光镜对呈色后的各部位切片进行观察，并用绘图管(Olympus)描绘记录切片中NOS阳性的细胞胞体和末梢，选作记录的细胞均具明显的神经细胞胞体形态。对1例动物(No.1)部分切片中选作记录的细胞在40倍物镜下测量其平均径(胞体最长径和垂直于此径中点的垂直径的平均值)。把直径小于10 μm、10～20 μm、大于20 μm的细胞分别称为小型、中等、大型细胞。
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应用DMRB生物显微镜(Leica Ltd.生产，与计算机连接可测量特定脑区的透光率，并描绘脑区的结构)测量记录细胞的透光率。然后把全部数值由小到大分为3个等级区段，由此区分强阳性、中等阳性和弱阳性细胞。同样，以相同面积内透光率的大小代表末梢密度，可把纹状体内末梢分布区分为高密度区、低密度区，即将其透光率值分别定在70.00～75.00和75.01～80.00，空白对照区透光率在80.01～95.00。
2 结果
光镜下，NOS阳性细胞呈蓝色，形态如同Golgi染色样，胞体及突起清晰；NOS阳性纤维末梢呈蓝色点状。
末梢分布的高密度区大约位于纹状体腹外侧边缘，透光率最小；低密度区约位于纹状体背内侧边缘，透光率居中，苍白球区域未见阳性末梢，透光率最高，近似对照。NOS阳性胞体数目在上述3区内也呈由多到少分布；各分布区内细胞胞体着色强度亦不同，高密度区中的胞体着色为强阳性，低密度区的则为中等或弱阳性，苍白球几乎见不到阳性胞体。各区内阳性胞体多为三角形，直径大多10～20 μm，多为中型细胞，突起多为二三条，突起上小棘不明显，未见有NOS阳性纤维离开纹状体。
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此外，在大脑皮质可见NOS阳性神经元胞体，它们几乎出现在所有的皮质，呈零星分布、多位于Ⅲ、Ⅳ层。在黑质和丘脑未见NOS阳性胞体及末梢。
3 讨论
本实验结果显示，纹状体中确有许多NOS阳性细胞和末梢。然而，在所观察的切片中，NOS阳性末梢比阳性胞体要相对密集得多，因此，可以认为纹状体内的NOS末梢中至少有一部分是外源性的。从本实验可以看出，大鼠的丘脑和黑质内未能发现NOS阳性神经元，而其主要集中于大脑皮质的广泛区域内。由于大脑皮质是纹状体传入纤维的重要来源[1]，这就说明纹状体内的外源性NOS阳性纤维末梢可能多来自于大脑皮质。但是，大脑皮质内的NOS阳性神经元分布较为广泛，它们是否都向纹状体发出直接投射则有待进一步研究。无论如何，这提示在研究大脑皮质谷氨酸能神经元对纹状体的影响时，需要考虑它们与NOS阳性神经元的关系。
现已知道，纹状体对黑质以及纹状体对苍白球的投射神经元是中等有棘神经元[1]。在本观察中，纹状体的NOS阳性神经元虽属中等大小，但突起上的小棘并不明显，也未能看到有NOS阳性轴突离开纹状体的现象，在黑质、苍白球内亦未能看到NOS阳性纤维末梢，这似乎可以推测纹状体内存在的NOS阳性神经元可能不是投射神经元而属于中间神经元。然而，鉴于本方法的局限性，单凭NOS阳性神经元的形态尚不能肯定这样的结论。
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本研究还发现NOS阳性末梢在纹状体的分布是不均匀的：在腹外侧密度高，背内侧密度低；与此相似，NOS阳性细胞也有此分布规律。另有研究表明，纹状体存在大量的5-HT阳性神经纤维及末梢，这些阳性成分的密度亦是在纹状体腹侧高，背侧低[6]。另外，纹状体腹、背侧的不同还表现在对黑质的投射部位上，即纹状体腹侧向黑质背侧部位有密集的纤维投射，而纹状体背侧则主要投向黑质腹外侧[7]。纹状体腹、背侧NOS活性差异在运动调节功能中可能具有一定意义，对此应进一步研究。
由于NOS阳性神经细胞可以选择性抵抗多种神经毒性损伤(包括NMDA介导的毒性作用、缺血和Alzheimer病所引起的损伤)，而过量生成NO又可引起不含NOS的神经元损伤或死亡[8]，因此我们认为纹状体中这些NOS阳性末梢和细胞密度较高的部位在病理情况下释放NO的量是值得考虑的因素。鉴于大量产生的NO有神经毒性，并且NO的扩散距离很短，因此纹状体NOS阳性末梢和胞体丰富部位与无NOS活性的脑区相比，可能更易出现不含NOS细胞的死亡。因此对NOS活性阳性神经元在纹状体内的分布状况的研究可能与基底神经节疾患有一定关系。
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参考文献
1 Parent A. Extrinsic connections of the basal ganglia. Trends Neurosci, 1990,13:254～258
2 Zhu X Z, Luo L G. Effect of nitroprusside (nitric oxide) on endogenous dopamine release from rat striatal slices. J Neurochem, 1992,59(3):932～935
3 Nakahara K, Yokooh H, Yoshida M. Effect of nitric oxide on central dopaminergic neurons. No To Shinkei,1994,46(12):1147～1153
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4 Kahn R A, Weinberger J, Brannan T, et al. Nitric oxide modulates dopamine release during global temporary cerebral ischemia. Anesth Analg, 1995,80(6):1116～1121
5 Wang S Z, Zhu S Z, Fakahang E. Efficient coupling of M5 muscarinic cetylcholine receptors to activation of nitric oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther, 1994,268(2):552～557
6 Soghomonian J J, Doucet G, Descarries L. Serotonin innervation in adult rat neostriatum I. Quantified regional distribution. Brain Res, 1987, 425:85～100
, 百拇医药
7 Lynd-Balta E, Haber S N. Primate striatonigral projections: A comparison of the sensorimotor-related striatum and the ventral striatum. J Comp Neurol, 1994,345:562～578
8 Dawson T M, Dawson V L, Snyder S H, et al. A novel neuronal messenger molecule in brain: The free redical, nitric oxide. Ann Neurol, 1992,32(3):297
收稿日期：1998-03-17, http://www.100md.com
单位：首都医科大学北京神经科学研究所
关键词：一氧化氮合酶；NADPH脱氢酶；黑质；纹状体
首都医科大学学报990104 提要： 应用NADPH脱氢酶反应(NADPH-d反应)显示SD大鼠黑质纹状体系统内一氧化氮合酶(NOS)阳性细胞和末梢，用计算机图像灰度仪测其染色强度。结果：正常大鼠纹状体内存在的阳性神经元和末梢分布位置不同；高密度末梢分布于纹状体腹外侧缘，此区细胞数亦较多；低密度区分布于纹状体背内侧区，阳性细胞数亦较少。苍白球、丘脑和黑质未见NOS阳性物质。
中图分类号： Q554.5； R332.81
The Activities of Nitric Oxide Synthase in the Neurons of the Nigro-striatal System in Rat Brain
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Lü Heyi, Xu Qunyuan, Zhao Peng, Zhang Jinlu, Xu Jianlan
Beijing Institute for Neuroscience, Capital University of Medical Sciences
Abstract: The activites of nitric oxide synthase(NOS) in cell bodies and terminals of neurons in the nigro-striatal system were detected by using a histochemical method of nicotinamide adenosine dinucleotide phosphate diaphorase (NADPH-d) reaction in brain sections of the SD rat. The number of NOS-positive neurons and density of the NOS-positive terminals were counted under a DMRP biomicroscope. It was shown that the higher density of labled terminals and more labled neurons were located in the ventrolateral part of the striatum, while the lower density of terminals and less neurons in the dorsomedial part of the striatum. There were no terminals labled in the globus pallidus, substantial negra and thalamus. The results showed that the distributions of NOS-positive neurons may have certain functional significance for motor regulation and certain parts of NOS-positive terminals may be projected from the cerebral cortex.
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Key words: nitric oxide synthase; NADPH-diaphorase; substantia negra; striatum
纹状体作为基底神经节信息处理通路中的重要环节，其组织结构和生理功能均相当复杂[1]。目前看来，一种与神经元信号传递密切相关的神经调节物质一氧化氮(nitric oxide, NO)在纹状体的生理活动和病理过程中起着重要作用。研究表明NO可引起内源性多巴胺(dopamine, DA)的释放且呈正比关系[2]；NO可影响纹状体神经元而引起DA含量的增加[3，4]。激活黑质M5型胆碱能受体可引起一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)活性增强[5]。同时，大量文献都报道了NO与神经细胞的信号传递和损伤有关[6]。鉴于纹状体内存在着复杂的往返纤维联系，因此，研究纹状体内含有NOS的外源性末梢和自身NOS阳性细胞的分布有重要意义。尽管过去对纹状体内存在NOS阳性细胞有过报道[6]，但并未进行过对NOS阳性末梢和细胞在纹状体内局部分布的研究。因此，本研究采用显示NADPH脱氢酶的组织化学方法来显示纹状体内的NOS阳性细胞及末梢，以探讨其布局特点。
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1 材料和方法
实验选用SD雌性大鼠6只，体质量180～250 g。动物经6%水合氯醛(5 mg/kg)麻醉后开胸，经升主动脉首先用100 mL生理盐水(37 ℃)冲洗血管，后用400 mL 4%的多聚甲醛磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4，4 ℃，含10%蔗糖)灌流固定40 min，迅速取脑，入20%蔗糖磷酸缓冲液(0.1 mol/L，pH 7.4，4 ℃)中过夜。恒冷箱连续切片，片厚50 μm，分成2套，按如下程序呈色：①0.1 mol/L多聚甲醛磷酸缓冲液(pH 7.4～7.6)洗片2次；②在含NADPH(0.2 g/L，Sigma公司)和NBT(0.1 g/L，Sigma公司)的磷酸缓冲液(0.01 mol/L，pH 7.4～7.6，含0.3% Triton X-100)中过夜；③0.1 mol/L PBS中止反应；④裱片；⑤其中1套用1%中性红复染；⑥透明、封片。
用光镜对呈色后的各部位切片进行观察，并用绘图管(Olympus)描绘记录切片中NOS阳性的细胞胞体和末梢，选作记录的细胞均具明显的神经细胞胞体形态。对1例动物(No.1)部分切片中选作记录的细胞在40倍物镜下测量其平均径(胞体最长径和垂直于此径中点的垂直径的平均值)。把直径小于10 μm、10～20 μm、大于20 μm的细胞分别称为小型、中等、大型细胞。
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应用DMRB生物显微镜(Leica Ltd.生产，与计算机连接可测量特定脑区的透光率，并描绘脑区的结构)测量记录细胞的透光率。然后把全部数值由小到大分为3个等级区段，由此区分强阳性、中等阳性和弱阳性细胞。同样，以相同面积内透光率的大小代表末梢密度，可把纹状体内末梢分布区分为高密度区、低密度区，即将其透光率值分别定在70.00～75.00和75.01～80.00，空白对照区透光率在80.01～95.00。
2 结果
光镜下，NOS阳性细胞呈蓝色，形态如同Golgi染色样，胞体及突起清晰；NOS阳性纤维末梢呈蓝色点状。
末梢分布的高密度区大约位于纹状体腹外侧边缘，透光率最小；低密度区约位于纹状体背内侧边缘，透光率居中，苍白球区域未见阳性末梢，透光率最高，近似对照。NOS阳性胞体数目在上述3区内也呈由多到少分布；各分布区内细胞胞体着色强度亦不同，高密度区中的胞体着色为强阳性，低密度区的则为中等或弱阳性，苍白球几乎见不到阳性胞体。各区内阳性胞体多为三角形，直径大多10～20 μm，多为中型细胞，突起多为二三条，突起上小棘不明显，未见有NOS阳性纤维离开纹状体。
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此外，在大脑皮质可见NOS阳性神经元胞体，它们几乎出现在所有的皮质，呈零星分布、多位于Ⅲ、Ⅳ层。在黑质和丘脑未见NOS阳性胞体及末梢。
3 讨论
本实验结果显示，纹状体中确有许多NOS阳性细胞和末梢。然而，在所观察的切片中，NOS阳性末梢比阳性胞体要相对密集得多，因此，可以认为纹状体内的NOS末梢中至少有一部分是外源性的。从本实验可以看出，大鼠的丘脑和黑质内未能发现NOS阳性神经元，而其主要集中于大脑皮质的广泛区域内。由于大脑皮质是纹状体传入纤维的重要来源[1]，这就说明纹状体内的外源性NOS阳性纤维末梢可能多来自于大脑皮质。但是，大脑皮质内的NOS阳性神经元分布较为广泛，它们是否都向纹状体发出直接投射则有待进一步研究。无论如何，这提示在研究大脑皮质谷氨酸能神经元对纹状体的影响时，需要考虑它们与NOS阳性神经元的关系。
现已知道，纹状体对黑质以及纹状体对苍白球的投射神经元是中等有棘神经元[1]。在本观察中，纹状体的NOS阳性神经元虽属中等大小，但突起上的小棘并不明显，也未能看到有NOS阳性轴突离开纹状体的现象，在黑质、苍白球内亦未能看到NOS阳性纤维末梢，这似乎可以推测纹状体内存在的NOS阳性神经元可能不是投射神经元而属于中间神经元。然而，鉴于本方法的局限性，单凭NOS阳性神经元的形态尚不能肯定这样的结论。
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本研究还发现NOS阳性末梢在纹状体的分布是不均匀的：在腹外侧密度高，背内侧密度低；与此相似，NOS阳性细胞也有此分布规律。另有研究表明，纹状体存在大量的5-HT阳性神经纤维及末梢，这些阳性成分的密度亦是在纹状体腹侧高，背侧低[6]。另外，纹状体腹、背侧的不同还表现在对黑质的投射部位上，即纹状体腹侧向黑质背侧部位有密集的纤维投射，而纹状体背侧则主要投向黑质腹外侧[7]。纹状体腹、背侧NOS活性差异在运动调节功能中可能具有一定意义，对此应进一步研究。
由于NOS阳性神经细胞可以选择性抵抗多种神经毒性损伤(包括NMDA介导的毒性作用、缺血和Alzheimer病所引起的损伤)，而过量生成NO又可引起不含NOS的神经元损伤或死亡[8]，因此我们认为纹状体中这些NOS阳性末梢和细胞密度较高的部位在病理情况下释放NO的量是值得考虑的因素。鉴于大量产生的NO有神经毒性，并且NO的扩散距离很短，因此纹状体NOS阳性末梢和胞体丰富部位与无NOS活性的脑区相比，可能更易出现不含NOS细胞的死亡。因此对NOS活性阳性神经元在纹状体内的分布状况的研究可能与基底神经节疾患有一定关系。
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参考文献
1 Parent A. Extrinsic connections of the basal ganglia. Trends Neurosci, 1990,13:254～258
2 Zhu X Z, Luo L G. Effect of nitroprusside (nitric oxide) on endogenous dopamine release from rat striatal slices. J Neurochem, 1992,59(3):932～935
3 Nakahara K, Yokooh H, Yoshida M. Effect of nitric oxide on central dopaminergic neurons. No To Shinkei,1994,46(12):1147～1153
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4 Kahn R A, Weinberger J, Brannan T, et al. Nitric oxide modulates dopamine release during global temporary cerebral ischemia. Anesth Analg, 1995,80(6):1116～1121
5 Wang S Z, Zhu S Z, Fakahang E. Efficient coupling of M5 muscarinic cetylcholine receptors to activation of nitric oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther, 1994,268(2):552～557
6 Soghomonian J J, Doucet G, Descarries L. Serotonin innervation in adult rat neostriatum I. Quantified regional distribution. Brain Res, 1987, 425:85～100
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7 Lynd-Balta E, Haber S N. Primate striatonigral projections: A comparison of the sensorimotor-related striatum and the ventral striatum. J Comp Neurol, 1994,345:562～578
8 Dawson T M, Dawson V L, Snyder S H, et al. A novel neuronal messenger molecule in brain: The free redical, nitric oxide. Ann Neurol, 1992,32(3):297
收稿日期：1998-03-17, http://www.100md.com