去甲斑蝥素用于单克隆抗体为载体的肿瘤导向治疗实验研究
作者：梁福佑 张胜华 潘颖 徐琳娜 王维刚
单位：梁福佑 潘颖 首都医科大学细胞生物学研究室；张胜华 徐琳娜 王维刚 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所
关键词：单克隆抗体；去甲斑蝥素；免疫偶联物
首都医科大学学报990102 提要：用单抗3A5制备与去甲斑蝥素(NCTD)的偶联物。ELISA检测结果表明：3A5-NCTD偶联物保持对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性。克隆生成法测定结果显示：3A5-NCTD具有比NCTD更强的细胞毒性，两者的IC50分别为2.3 mg/L和4.2 mg/L。小鼠腹腔内移植H22肝癌，腹膜内给药(ip)，3A5-NCTD(3 mg/kg)和NCTD(3 mg/kg)的延长寿命值(ILS)分别为168%和42%。裸鼠移植人肝癌BEL-7402细胞，静脉给药(iv)，NCTD的肿瘤抑制率为15%(P>0.05)，3A5-NCTD为62%(P<0.01)；瘤结周围给药(pt)，NCTD的肿瘤抑制率为47%(P<0.05)，3A5-NCTD为78%(P<0.01)。结果表明，与NCTD相比，3A5-NCTD对裸鼠移植人肝癌和腹腔肿瘤具有更强的治疗作用。以上结果提示单抗与NCTD偶联物在肿瘤的导向治疗中有较好的疗效。
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中图分类号：R730.59
Use of Monoclonal Antibody-Norcantharidin Conjugate in Experimental Targeting Therapy of Tumor
Liang Fuyou, Zhang Shenghua*, Pan Ying, Xu Linna*, Wang Weigang*
Department of Cell Biology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: A rat monoclonal antibody was linked to norcantharidin (NCTD)， an antitumor drug currently in clinical use McAb 3A5. The 3A5-NCTD conjugate retained complete immunoreactivity of McAb 3A5 to human hepatoma cancer BEL-7402 cells. The IC50 values of 3A5-NCTD and free NCTD were 2.3 mg/L and 4.2 mg/L, respectively. The 3A5-NCTD showed higher cytotoxicity than free NCTD. Hepatoma H22 ascites was transplanted into the peritoneal of mice. 3A5-NCTD or NCTD were injected into the cavity. The ILS(%) values were 168% and 42%. Tumor fragments of human hepatoma BEL-7402 were transplanted into nude mice. Then 3A5-NCTD or NCTD was injected iv, or pt(peritumorally). The inhibition rates on the growth of hepatoma BEL-7402 xenografts were 62% and 15% for iv; 78% and 47% for pt.Results indicate that 3A5-NCTD is highly effective against targeted human cancer xenograft and mouse tumor.
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Key words: monoclonal antibody; norcantharidin; immunoconjugate
*Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College
去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)是我国自行研制生产的抗肿瘤药物，具有显著的抗癌活性，而其毒、副作用较低。去甲斑蝥素的抗癌机制独特，它并不直接作用于DNA分子，因而对体内正常细胞致畸变的可能性很小。它改变细胞骨架，造成细胞有丝分裂紊乱而死亡；由于肿瘤细胞与正常细胞的细胞骨架有所不同，因此肿瘤细胞对该药反应强烈[1]。近来，随着单抗Herceptin、Rituxan及Panorex等在美国及欧洲的批准上市，以单克隆抗体为载体的抗肿瘤导向药物研究再度成为令人关注的研究领域[2]。本研究采用抗人肝癌大鼠单克隆抗体3A5与NCTD偶联，观察偶联物对肝癌的实验治疗作用，为推动去甲斑蝥素在临床上的应用提供实验基础。
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1 材料和方法
1.1 材料
细胞系：人肝癌BEL-7402细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在CO2体积分数为5%的37 ℃温箱中培养。
动物：BALB/c(nu/nu)裸鼠及昆明种小鼠，雌性，6～7周龄。购于中国医科院动物所。
单抗：抗肝癌大鼠单抗3A5为IgG型单抗，与人肝癌细胞BEL-7402呈强阳性反应。
药物与试剂：NCTD为北京第四制药厂产品。碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺均为Sigma产品。
1.2 方法
单抗3A5的制备与纯化：按文献[3]方法进行。取杂交瘤腹水用MARK 3-Sepharose 4B亲和层析柱纯化。依次用PBS、PBS+2.5 mol/L NaCl和0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，将第Ⅱ蛋白峰用0.3 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中和后再用PBS透析、浓缩备用。
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单抗3A5与去甲斑蝥素偶联物的制备：采用活泼酯法制备3A5-NCTD偶联物，按文献[4]报道的方法进行。滴定透析外液，测定其中NCTD量，推算偶联物中NCTD的含量并计算单抗与药物的摩尔比。
免疫反应性检测：采用ELISA法测定3A5对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性[5]。
克隆形成测定：采用克隆生成测定法观察3A5-NCTD对BEL-7402细胞杀伤作用。取对数生长期的肿瘤细胞种入96孔培养板，每孔50个细胞，培养24 h。加入待测样品，每一药物质量浓度用4个平行孔，各药物均用无血清RPMI-1640培养液稀释，对照组只加无血清RPMI-1640培养液，每孔加液50 μL。药物与细胞接触24 h，吸去培养液，用无血清RPMI-1640培养液洗2次，然后加入含血清的RPMI-1640新鲜培养液，继续培养。接种7 d后在倒置显微镜下数细胞集落数(细胞数超过30个以上者)，以对照组细胞集落数为100%，求得药物不同质量浓度下的集落生成率。
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小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗试验：18～22 g昆明种小鼠腹腔接种肝癌H22腹水0.2 mL。次日起开始注射3A5-NCTD或NCTD，剂量分别为3 mg/kg和1.5 mg/kg，每天1次，共10次。对照组注射生理盐水。观察动物存活时间，按延长寿命值〔increase life span(ILS)，ILS=(t1/t2-1)×100%，t1治疗组动物生存时间，t2对照组动物生存时间〕判断疗效。实验过程中每周2次测量动物体质量。用多样本秩和检验方法(Kruskal-Wallis法)检验各组间差异。
裸鼠移植人肝癌的治疗试验：将直径2 mm的BEL-7402人肝癌瘤块接种于BALB/c (nu/nu)裸鼠右腋皮下。于接种后第3天开始注射3A5-NCTD偶联物。分别采用静脉给药(iv)及瘤结周围给药(pt)法，NCTD的剂量为3.0 mg/kg，每3 d 1次，共7次。对照动物注射生理盐水。各组均为6只动物。治疗期间每周2次测量肿瘤长径a(cm)以及与其相垂直的短径b(cm)并按下式计算瘤质量：m(瘤)/g=(a×b2)×0.5。于30 d后处死动物，剥取肿瘤称质量，用单因素方差分析法检验各组间瘤质量差异。并计算抑瘤率。
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2 结果
2.1 单抗3A5纯化及单抗偶联物制备
纯化的3A5单抗经细胞ELISA法测定免疫反应，结果显示，纯化3A5抗体对BEL-7402细胞呈强阳性反应。经测定偶联物中的3A5与NCTD摩尔比约为1∶82。
2.2 偶联物中3A5抗体反应性测定
将游离3A5单抗与3A5-NCTD偶联物分别以PBS倍比稀释成一系列质量浓度，用ELISA法测定它们对靶细胞BEL-7402的反应性。结果表明偶联物中3A5反应性未见明显改变(图1)
图1 3A5-NCTD偶联物及3A5单抗对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性
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2.3 对靶细胞的杀伤作用
克隆形成测定结果，药物与细胞作用24 h，偶联物及游离NCTD对BEL-7402细胞的半数抑制质量浓度(IC50)分别为2.3 mg/L和4.2 mg/L。偶联物对靶细胞的杀伤力稍强于游离NCTD(图2)
图2 3A5-NCTD偶联物对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用
2.4 小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗试验
3A5-NCTD显示出比游离NCTD更强的治疗作用(表1)。其中3A5-NCTD(3 mg/kg)组至实验结束时(60 d)尚有2只动物存活，经解剖未发现腹腔内肿瘤及腹水。
表1 NCTD及3A5-NCTD偶联物对小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗作用 分组
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给药量/
(mg.kg-1)
t(生存)/d
中位数
ILS/%
存活60 d
动物数
对照组
/
14.0
/
/
, 百拇医药 NCTD
3.0
20.5
42
0
1.5
17.0
21
0
3A5-NCTD
3.0
37.5*
168
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2
1.5
23.0
64
1
每组动物数均为10，*与对照组比较P<0.052.5 裸鼠移植人肝癌的实验治疗
3A5-NCTD对移植人肝癌BEL-7402肿瘤生长有显著抑制作用(图3)，其抑制率高于等剂量游离去甲斑蝥素，其中又以瘤结周围给药的治疗效果更强。实验结束时，游离NCTD(3 mg/kg)静脉给药组抑瘤率为15%(P>0.05)，3A5-NCTD(3 mg/kg)静脉给药组肿瘤抑制率为62%(P<0.01)；而当采用瘤结周围给药时，两者的抑瘤率分别为47%和78%(表2)。
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图3 3A5-NCTD偶联物对裸鼠移植人肝癌的生长抑制作用
表2 NCTD及3A5-NCTD偶联物对裸鼠移植人肝癌BEL-7402的治疗作用 分组
给药途径
m(裸鼠)/g
m(瘤)/g
抑瘤率/%
对照组
4.06±1.28
1.84±0.71
NCTD
pt
, 百拇医药
6.73±2.46
0.97±0.45*
47*
3A5-NCTD
pt
7.09±2.87
0.41±0.12**
78**△
NCTD
iv
5.94±1.54
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1.56±0.40
15
3A5-NCTD
iv
4.05±1.58
0.70±0.27**
62**
每组治疗开始和结束时的动物数均为6；各组给药量均为3 mg/kg;与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；△与3A5-NCTD iv组比较P<0.05
3 讨论
去甲斑蝥素可通过多种途径破坏、抑制癌细胞。此外，可缩短白细胞的骨髓成熟、释放时间；并有促进骨髓造血干细胞(CFU-S)向粒-单核系祖细胞(CFU-GM)分化的作用，从而导致白细胞升高[6]。临床应用证明其对多种肿瘤具有良好的治疗效果；与其他药物合用可拮抗骨髓抑制及进一步提高疗效；在治疗剂量范围内，对免疫功能无不良影响[7]。
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作为小分子抗肿瘤药物，去甲斑蝥素在药代动力学上具有起效快，代谢快的特点。但去甲斑蝥素在肿瘤局部滞留时间不足及其在体内分布的非特异性有可能成为限制其最佳疗效发挥的主要因素。已有许多文献证明[8～11]，单抗导向药物经区域性给药后(包括动脉灌注、腔内给药、瘤内或瘤旁给药)，由于其具有大分子的药代动力学性质，使得偶联物在肿瘤部位滞留时间延长，局部浓度高，且减少了非肿瘤组织对导向药物的摄取，从而具有独特的应用价值，在临床应用中已取得一定的治疗效果，成为导向治疗中值得重视的方法。
本研究将去甲斑蝥素与抗肝癌大鼠单抗3A5偶联，观察其经静脉给药和肿瘤局部给药对肿瘤的治疗作用。结果表明，3A5-NCTD保持3A5单抗对BEL-7402细胞的免疫反应性，与3A5单抗相比活性相当。克隆生成法测定结果显示：3A5-NCTD保持了NCTD的细胞毒性。对小鼠腹水型肝癌H22的治疗结果表明：3A5-NCTD显示出比游离NCTD更强的治疗作用。其中3A5-NCTD(3 mg/kg)组至实验结束时(60 d)尚有2只动物存活，经解剖未发现腹腔内肿瘤及腹水。对裸鼠移植人肝癌BEL-7402细胞的治疗结果表明：iv组NCTD的肿瘤抑制率为15%，3A5-NCTD的肿瘤抑制率为62%(P<0.01)；pt组NCTD肿瘤抑制率为47%(P<0.05)，3A5-NCTD为78%(P<0.01)。结果均显示，与NCTD相比，3A5-NCTD对裸鼠移植人肝癌BEL-7402具有更强的治疗作用。瘤结周围给予3A5-NCTD比经静脉给药具有更高疗效(P<0.05)。
北京市自然科学基金资助项目
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参考文献
1 连慕兰.去甲斑蝥酸钠干扰细胞有丝分裂的机制.解剖学报,1991,22(3):286～291
2 Dickman S. Antibodies stage a comeback in cancer treatment. Science, 1998,280:1197
3 Bazin H. Rat monoclonal antibodies. Ⅱ. A rapid and efficient method of purification from ascitic fluid or serum. J Immunol Methods, 1984,71(1):9
4 Tarun I G. Preparation of antibody-linked cytotoxic agents. Methods Enzymol, 1983,93:168
, 百拇医药
5 Douillard J T, Hoftman T. Enayme-linked immunosorbent assay for screening monoclonal antibody production using enzyme-labeled second antibody. Methods Enzymol, 1983,92:168
6 易受南.去甲斑蝥素增加白细胞机理初探.湖南医学院学报,1988,13(4):327～390
7 Wang G S. Medical uses of mylabris in ancient China and recent studies. J Ethnopharmacol, 1989,26:147～162
8 甄永苏.抗肿瘤导向药物研究的现状与展望.药学学报,1994,29(1):1
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9 王维刚.人单克隆抗体与平阳霉素偶联物治疗乳腺癌实验研究.药学学报,1995,30(8):583～587
10 王维刚.单克隆抗体与平阳霉素偶联物对肿瘤的区域性导向实验治疗.药学学报,1997,32(9):669～674
11 Takakura Y. Macromolecular drug carrier systems in cancer chemotherapy: Macromolecular prodrugs. Crit Rev Oncol Hematol, 1995,18:207
收稿日期：1998-12-16, 百拇医药
单位：梁福佑 潘颖 首都医科大学细胞生物学研究室；张胜华 徐琳娜 王维刚 中国医学科学院中国协和医科大学医药生物技术研究所
关键词：单克隆抗体；去甲斑蝥素；免疫偶联物
首都医科大学学报990102 提要：用单抗3A5制备与去甲斑蝥素(NCTD)的偶联物。ELISA检测结果表明：3A5-NCTD偶联物保持对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性。克隆生成法测定结果显示：3A5-NCTD具有比NCTD更强的细胞毒性，两者的IC50分别为2.3 mg/L和4.2 mg/L。小鼠腹腔内移植H22肝癌，腹膜内给药(ip)，3A5-NCTD(3 mg/kg)和NCTD(3 mg/kg)的延长寿命值(ILS)分别为168%和42%。裸鼠移植人肝癌BEL-7402细胞，静脉给药(iv)，NCTD的肿瘤抑制率为15%(P>0.05)，3A5-NCTD为62%(P<0.01)；瘤结周围给药(pt)，NCTD的肿瘤抑制率为47%(P<0.05)，3A5-NCTD为78%(P<0.01)。结果表明，与NCTD相比，3A5-NCTD对裸鼠移植人肝癌和腹腔肿瘤具有更强的治疗作用。以上结果提示单抗与NCTD偶联物在肿瘤的导向治疗中有较好的疗效。
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中图分类号：R730.59
Use of Monoclonal Antibody-Norcantharidin Conjugate in Experimental Targeting Therapy of Tumor
Liang Fuyou, Zhang Shenghua*, Pan Ying, Xu Linna*, Wang Weigang*
Department of Cell Biology, Capital University of Medical Sciences
Abstract: A rat monoclonal antibody was linked to norcantharidin (NCTD)， an antitumor drug currently in clinical use McAb 3A5. The 3A5-NCTD conjugate retained complete immunoreactivity of McAb 3A5 to human hepatoma cancer BEL-7402 cells. The IC50 values of 3A5-NCTD and free NCTD were 2.3 mg/L and 4.2 mg/L, respectively. The 3A5-NCTD showed higher cytotoxicity than free NCTD. Hepatoma H22 ascites was transplanted into the peritoneal of mice. 3A5-NCTD or NCTD were injected into the cavity. The ILS(%) values were 168% and 42%. Tumor fragments of human hepatoma BEL-7402 were transplanted into nude mice. Then 3A5-NCTD or NCTD was injected iv, or pt(peritumorally). The inhibition rates on the growth of hepatoma BEL-7402 xenografts were 62% and 15% for iv; 78% and 47% for pt.Results indicate that 3A5-NCTD is highly effective against targeted human cancer xenograft and mouse tumor.
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Key words: monoclonal antibody; norcantharidin; immunoconjugate
*Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College
去甲斑蝥素(norcantharidin, NCTD)是我国自行研制生产的抗肿瘤药物，具有显著的抗癌活性，而其毒、副作用较低。去甲斑蝥素的抗癌机制独特，它并不直接作用于DNA分子，因而对体内正常细胞致畸变的可能性很小。它改变细胞骨架，造成细胞有丝分裂紊乱而死亡；由于肿瘤细胞与正常细胞的细胞骨架有所不同，因此肿瘤细胞对该药反应强烈[1]。近来，随着单抗Herceptin、Rituxan及Panorex等在美国及欧洲的批准上市，以单克隆抗体为载体的抗肿瘤导向药物研究再度成为令人关注的研究领域[2]。本研究采用抗人肝癌大鼠单克隆抗体3A5与NCTD偶联，观察偶联物对肝癌的实验治疗作用，为推动去甲斑蝥素在临床上的应用提供实验基础。
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1 材料和方法
1.1 材料
细胞系：人肝癌BEL-7402细胞，用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液在CO2体积分数为5%的37 ℃温箱中培养。
动物：BALB/c(nu/nu)裸鼠及昆明种小鼠，雌性，6～7周龄。购于中国医科院动物所。
单抗：抗肝癌大鼠单抗3A5为IgG型单抗，与人肝癌细胞BEL-7402呈强阳性反应。
药物与试剂：NCTD为北京第四制药厂产品。碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺均为Sigma产品。
1.2 方法
单抗3A5的制备与纯化：按文献[3]方法进行。取杂交瘤腹水用MARK 3-Sepharose 4B亲和层析柱纯化。依次用PBS、PBS+2.5 mol/L NaCl和0.1 mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液洗脱，将第Ⅱ蛋白峰用0.3 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中和后再用PBS透析、浓缩备用。
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单抗3A5与去甲斑蝥素偶联物的制备：采用活泼酯法制备3A5-NCTD偶联物，按文献[4]报道的方法进行。滴定透析外液，测定其中NCTD量，推算偶联物中NCTD的含量并计算单抗与药物的摩尔比。
免疫反应性检测：采用ELISA法测定3A5对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性[5]。
克隆形成测定：采用克隆生成测定法观察3A5-NCTD对BEL-7402细胞杀伤作用。取对数生长期的肿瘤细胞种入96孔培养板，每孔50个细胞，培养24 h。加入待测样品，每一药物质量浓度用4个平行孔，各药物均用无血清RPMI-1640培养液稀释，对照组只加无血清RPMI-1640培养液，每孔加液50 μL。药物与细胞接触24 h，吸去培养液，用无血清RPMI-1640培养液洗2次，然后加入含血清的RPMI-1640新鲜培养液，继续培养。接种7 d后在倒置显微镜下数细胞集落数(细胞数超过30个以上者)，以对照组细胞集落数为100%，求得药物不同质量浓度下的集落生成率。
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小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗试验：18～22 g昆明种小鼠腹腔接种肝癌H22腹水0.2 mL。次日起开始注射3A5-NCTD或NCTD，剂量分别为3 mg/kg和1.5 mg/kg，每天1次，共10次。对照组注射生理盐水。观察动物存活时间，按延长寿命值〔increase life span(ILS)，ILS=(t1/t2-1)×100%，t1治疗组动物生存时间，t2对照组动物生存时间〕判断疗效。实验过程中每周2次测量动物体质量。用多样本秩和检验方法(Kruskal-Wallis法)检验各组间差异。
裸鼠移植人肝癌的治疗试验：将直径2 mm的BEL-7402人肝癌瘤块接种于BALB/c (nu/nu)裸鼠右腋皮下。于接种后第3天开始注射3A5-NCTD偶联物。分别采用静脉给药(iv)及瘤结周围给药(pt)法，NCTD的剂量为3.0 mg/kg，每3 d 1次，共7次。对照动物注射生理盐水。各组均为6只动物。治疗期间每周2次测量肿瘤长径a(cm)以及与其相垂直的短径b(cm)并按下式计算瘤质量：m(瘤)/g=(a×b2)×0.5。于30 d后处死动物，剥取肿瘤称质量，用单因素方差分析法检验各组间瘤质量差异。并计算抑瘤率。
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2 结果
2.1 单抗3A5纯化及单抗偶联物制备
纯化的3A5单抗经细胞ELISA法测定免疫反应，结果显示，纯化3A5抗体对BEL-7402细胞呈强阳性反应。经测定偶联物中的3A5与NCTD摩尔比约为1∶82。
2.2 偶联物中3A5抗体反应性测定
将游离3A5单抗与3A5-NCTD偶联物分别以PBS倍比稀释成一系列质量浓度，用ELISA法测定它们对靶细胞BEL-7402的反应性。结果表明偶联物中3A5反应性未见明显改变(图1)
图1 3A5-NCTD偶联物及3A5单抗对人肝癌BEL-7402细胞的免疫反应性
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2.3 对靶细胞的杀伤作用
克隆形成测定结果，药物与细胞作用24 h，偶联物及游离NCTD对BEL-7402细胞的半数抑制质量浓度(IC50)分别为2.3 mg/L和4.2 mg/L。偶联物对靶细胞的杀伤力稍强于游离NCTD(图2)
图2 3A5-NCTD偶联物对人肝癌BEL-7402细胞的抑制作用
2.4 小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗试验
3A5-NCTD显示出比游离NCTD更强的治疗作用(表1)。其中3A5-NCTD(3 mg/kg)组至实验结束时(60 d)尚有2只动物存活，经解剖未发现腹腔内肿瘤及腹水。
表1 NCTD及3A5-NCTD偶联物对小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗作用 分组
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给药量/
(mg.kg-1)
t(生存)/d
中位数
ILS/%
存活60 d
动物数
对照组
/
14.0
/
/
, 百拇医药 NCTD
3.0
20.5
42
0
1.5
17.0
21
0
3A5-NCTD
3.0
37.5*
168
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2
1.5
23.0
64
1
每组动物数均为10，*与对照组比较P<0.052.5 裸鼠移植人肝癌的实验治疗
3A5-NCTD对移植人肝癌BEL-7402肿瘤生长有显著抑制作用(图3)，其抑制率高于等剂量游离去甲斑蝥素，其中又以瘤结周围给药的治疗效果更强。实验结束时，游离NCTD(3 mg/kg)静脉给药组抑瘤率为15%(P>0.05)，3A5-NCTD(3 mg/kg)静脉给药组肿瘤抑制率为62%(P<0.01)；而当采用瘤结周围给药时，两者的抑瘤率分别为47%和78%(表2)。
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图3 3A5-NCTD偶联物对裸鼠移植人肝癌的生长抑制作用
表2 NCTD及3A5-NCTD偶联物对裸鼠移植人肝癌BEL-7402的治疗作用 分组
给药途径
m(裸鼠)/g
m(瘤)/g
抑瘤率/%
对照组
4.06±1.28
1.84±0.71
NCTD
pt
, 百拇医药
6.73±2.46
0.97±0.45*
47*
3A5-NCTD
pt
7.09±2.87
0.41±0.12**
78**△
NCTD
iv
5.94±1.54
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1.56±0.40
15
3A5-NCTD
iv
4.05±1.58
0.70±0.27**
62**
每组治疗开始和结束时的动物数均为6；各组给药量均为3 mg/kg;与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；△与3A5-NCTD iv组比较P<0.05
3 讨论
去甲斑蝥素可通过多种途径破坏、抑制癌细胞。此外，可缩短白细胞的骨髓成熟、释放时间；并有促进骨髓造血干细胞(CFU-S)向粒-单核系祖细胞(CFU-GM)分化的作用，从而导致白细胞升高[6]。临床应用证明其对多种肿瘤具有良好的治疗效果；与其他药物合用可拮抗骨髓抑制及进一步提高疗效；在治疗剂量范围内，对免疫功能无不良影响[7]。
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作为小分子抗肿瘤药物，去甲斑蝥素在药代动力学上具有起效快，代谢快的特点。但去甲斑蝥素在肿瘤局部滞留时间不足及其在体内分布的非特异性有可能成为限制其最佳疗效发挥的主要因素。已有许多文献证明[8～11]，单抗导向药物经区域性给药后(包括动脉灌注、腔内给药、瘤内或瘤旁给药)，由于其具有大分子的药代动力学性质，使得偶联物在肿瘤部位滞留时间延长，局部浓度高，且减少了非肿瘤组织对导向药物的摄取，从而具有独特的应用价值，在临床应用中已取得一定的治疗效果，成为导向治疗中值得重视的方法。
本研究将去甲斑蝥素与抗肝癌大鼠单抗3A5偶联，观察其经静脉给药和肿瘤局部给药对肿瘤的治疗作用。结果表明，3A5-NCTD保持3A5单抗对BEL-7402细胞的免疫反应性，与3A5单抗相比活性相当。克隆生成法测定结果显示：3A5-NCTD保持了NCTD的细胞毒性。对小鼠腹水型肝癌H22的治疗结果表明：3A5-NCTD显示出比游离NCTD更强的治疗作用。其中3A5-NCTD(3 mg/kg)组至实验结束时(60 d)尚有2只动物存活，经解剖未发现腹腔内肿瘤及腹水。对裸鼠移植人肝癌BEL-7402细胞的治疗结果表明：iv组NCTD的肿瘤抑制率为15%，3A5-NCTD的肿瘤抑制率为62%(P<0.01)；pt组NCTD肿瘤抑制率为47%(P<0.05)，3A5-NCTD为78%(P<0.01)。结果均显示，与NCTD相比，3A5-NCTD对裸鼠移植人肝癌BEL-7402具有更强的治疗作用。瘤结周围给予3A5-NCTD比经静脉给药具有更高疗效(P<0.05)。
北京市自然科学基金资助项目, 百拇医药
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收稿日期：1998-12-16, 百拇医药
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