自制长循环合成材料的溶血性及用其包衣后脂质体的稳定性研究
作者：徐乃玉
单位：苏州医学院药学系，苏州，215007
关键词：脂质体；长循环liposomes；实验研究
苏州医学院学报991109 摘要 目的：考察自制长循环材料PEG衍生物的溶血性，及用此合成材料制备的脂质体的体外稳定性。方法：用不同浓度的合成材料对兔血细胞进行溶血和同一浓度的合成材料对不同动物血细胞进行溶血试验，同时进行了Ca2+聚集试验和不同荷电性脂质体的相互作用试验。结果：高浓度合成材料对兔血细胞溶血，合成材料对兔血细胞比小鼠血细胞易溶血，所制备的长循环脂质体表面覆盖的高分子能阻抑Ca2+聚集和荷相反电荷脂质体的相互作用。结论：LCL表面上有一层亲水性高分子存在。
中图法分类 R318.08
, http://www.100md.com Study on the Long-Circulating Liposomes Making fron Synthetic Material
Xu Naiyu
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To observe the hemolysis of PEG derivation made by our own laboratory and the stability of the lipsomes made up from synthetic PEG derivation in vivo. Method Using the different concentration synthetic material to examine that of rabbit and mice respectively. The Ca2+ aggregation of the long-circulating lipsomes(LCL)and the interaction among the LCL of different electrical charge were also tested. Result The high concentration synthetic material made the rabbit's hemocyte hemolystic, while the hemolysis degree of rabbit's hemocyte was higher than that of mice. Comparing with the ordinary lipsomes, both the Ca2+aggregation of the LCL and the interaction of the LCL which had reverse electrical charge became weak obviously. Conclusion The surface of the LCL has a layer of hydrophilic polymer.
, 百拇医药
Key words lipsomes;long-circulating liposomes;study
脂质体[1]是由脂质双分子层形成的封闭小囊泡，作为药物运载体，尤其是抗癌药物的靶向运载体，已得到了广泛研究，并已有3个品种进入市场。然而表面未经修饰包衣的普通脂质体，经静脉注射入体内后，一部分被网状内皮系统(RES)识别和摄取，另一部分到达靶区释放药物，发挥药效。RES的吞噬作用一方面降低了脂质体的主动靶向性，另一方面也增加了对网状内皮细胞的毒性。近年来国外发展了一类长循环脂质体[2，3]，其中有PEG衍生物对脂质体进行包衣而制备的长循环脂质体，可促进血循环时间的延长，逃避网状内皮系统的捕获，靶向到癌组织，增强抗癌活性[4]。最有发展前途。本文对自制长循环材料PEG衍生物的溶血性[5]，包衣后脂质体的稳定性进行了初步研究。
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
1.1 仪器：岛津UV-260型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；DT-100电光分析天平。
1.2 材料：大豆磷脂(上海油脂二厂)；胆固醇(进口包装)；CHCl3、CaCl2均为分析纯；新西兰兔；昆明种小鼠。上述动物由沈阳药科大学动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 合成材料的溶血试验
2.1.1 兔血细胞全溶血溶液的紫外扫描图：取新鲜兔全血 1ml 加蒸馏水至10ml，置37℃水浴，1h 后取出，以3000r/min离心5min,取上清液进行紫外扫描，结果在414.4nm波长处有最大吸收，图1确定为测定波长。
, 百拇医药
图1 兔血细胞全溶血溶液的UV扫描图
2.1.2 不同浓度合成材料对兔血细胞溶血性试验比较：按文献[6]方法进行试验，取4支相同试管，各加1ml兔全血，分别加不同浓度合成材料溶液0.1ml，各加生理盐水至10ml，置37℃水浴1h后，以3000r/min离心5min，取上清液于 414.4nm 测吸收度A，并与阳性溶血管进行比较，测得溶血度。溶血度(%)=A待测/A阳对×100%。结果见图2。
图2 不同浓度合成材料中兔血细胞的溶血度
2.1.3.不同动物血细胞溶血性试验比较：取新鲜小鼠和兔的全血，分别加到如附表所列3组试管中，各以1、2、3、4、5号管顺序和加两种动物全血1ml、不同浓度合成材料溶液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，加生理盐水至10ml，均置37℃水浴，1h后取出，以3000r/min离心5min,取上清液，方法同上，测溶血度或显微镜检查，小鼠实验管镜检均无红细胞，结果见附表。由附表可见合成材料对兔血细胞比小鼠血细胞易溶血。
, http://www.100md.com
附表 合成材料对不同动物全血的溶血情况 全血
种类
合成材料
浓度(g/L)
管号
1
2
3
4
5
小鼠
2.0
未溶
, 百拇医药
未溶
未溶
未溶
未溶
兔
0.6
1～5号管离心有沉淀，但镜检无红细胞
兔
1.8
1～5号管离心无沉淀，镜检也无红细胞
2.2 普通脂质体与长循环脂质体的体外稳定性比较
2.2.1 空白脂质体的制备：普通脂质体与长循环脂质体的制备采用逆相蒸发法。普通脂质体分别精密称取大豆磷脂、胆固醇(4∶1)混合，长循环脂质体分别精密称取大豆磷脂、胆固醇以及自制PEG衍生物(前两者固定比为4∶1)混合，各溶于CHCl3溶液，加入300mmol/L枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液(pH=4)，经超声分散成w/o型乳剂，再经旋转蒸发除去乳剂中的有机溶媒，形成均匀脂质体。过微孔滤膜(200nm)，得均匀粒径的脂质体。
, http://www.100md.com
2.2.2 Ca2+对不同脂质体稳定性的影响：分别取普通脂质体、含合成材料0.2、0.6、1.8g/L的LCL快速加入1mol/L Ca2+溶液中，于450nm处测定吸收度的变化，吸收度变化率与时间的关系见图3。图示曲线表明，合成材料对外界条件的改变响应不明显。
图3 含不同量合成物质制成脂质体在水中△A与t的关系
(1.普通脂质体；2、3、4分别为含合成材料0.2、0.6、1.8g/L脂质体)
2.2.3 合成材料对阴、阳脂质体相互作用的影响：自制阳性材料、阴性材料用上述方法制得阳性脂质体、阴性脂质体、阳性长循环脂质体、阴性长循环脂质体，分别以阴、阳脂质体两者组合，各取0.1ml，快速加入5ml H2O中，在450nm处观察吸收度变化，其吸收度变化率与时间关系曲线见图4。图中曲线表示合成材料使荷相反电荷物质对脂质体的作用明显减弱。
, http://www.100md.com
图4 阴、阳liposomes结合后吸收度变化率随时间的关系
(a.阳性脂质体；b.阴性脂质体；c.长循环阳性脂质体；d.长循环阴性脂质体)
3 讨论
合成的高分子材料PEG衍生物为两亲性物质，具有表面活性剂的作用，由于将来用于静脉给药，有必要进行溶血试验，由试验可见，2g/L合成材料对家兔全血溶血，而对小鼠全血则不溶，可能与种属差异有关。
制备脂质体磷脂与胆固醇必须保持一定比例。因在体内，磷脂在血浆中起乳化作用，影响胆固醇与脂肪的运输和沉着，静脉给予磷脂，可促进粥样硬化斑的消散，防止胆固醇引起的血管内神经内膜损伤。
所合成的材料是将亲水性大分子(PEG等)通过脂质镶嵌到脂质膜上，既有亲水基又有亲油基，用其对脂质体进行表面修饰包衣。见图5。
, 百拇医药
A普通脂质体 B经修饰包衣的长循环脂质体
图5 长循环脂质体的结构模式图
由于脂质体表面的亲水性高分子物质存在，使脂质体具有一些新的特征，对外界条件改变的响应不显著，一些金属离子、荷相反电荷物质对脂质体作用明显减弱，从而保证了脂质体的体内稳定性。
参考文献
1 顾学裘，等.抗癌药物靶向载体.中国多相脂质体研究.中国医药科技出版社，1991
2 袁树军，等.新型热敏脂质体的研究进展.沈阳药科大学学报，1998，15(4)
3 赵荣生，等.空间稳定脂质体与药物的靶向释放.中国药学学报，1998，38(8)∶452
4 Huang SK,et al.pharmacokinetics and therapeutics of sterically stabilized liposomes in mice bearing c-26 colon carcinoma.Cancer Res,1992,52(24)∶6774
5 郑永安.聚乙二醇及其在药剂中的应用.中国药学学报，1989，24(8)∶451
6 徐叔云，等.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982
(1999年6月30日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院药学系，苏州，215007
关键词：脂质体；长循环liposomes；实验研究
苏州医学院学报991109 摘要 目的：考察自制长循环材料PEG衍生物的溶血性，及用此合成材料制备的脂质体的体外稳定性。方法：用不同浓度的合成材料对兔血细胞进行溶血和同一浓度的合成材料对不同动物血细胞进行溶血试验，同时进行了Ca2+聚集试验和不同荷电性脂质体的相互作用试验。结果：高浓度合成材料对兔血细胞溶血，合成材料对兔血细胞比小鼠血细胞易溶血，所制备的长循环脂质体表面覆盖的高分子能阻抑Ca2+聚集和荷相反电荷脂质体的相互作用。结论：LCL表面上有一层亲水性高分子存在。
中图法分类 R318.08
, http://www.100md.com Study on the Long-Circulating Liposomes Making fron Synthetic Material
Xu Naiyu
(Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective To observe the hemolysis of PEG derivation made by our own laboratory and the stability of the lipsomes made up from synthetic PEG derivation in vivo. Method Using the different concentration synthetic material to examine that of rabbit and mice respectively. The Ca2+ aggregation of the long-circulating lipsomes(LCL)and the interaction among the LCL of different electrical charge were also tested. Result The high concentration synthetic material made the rabbit's hemocyte hemolystic, while the hemolysis degree of rabbit's hemocyte was higher than that of mice. Comparing with the ordinary lipsomes, both the Ca2+aggregation of the LCL and the interaction of the LCL which had reverse electrical charge became weak obviously. Conclusion The surface of the LCL has a layer of hydrophilic polymer.
, 百拇医药
Key words lipsomes;long-circulating liposomes;study
脂质体[1]是由脂质双分子层形成的封闭小囊泡，作为药物运载体，尤其是抗癌药物的靶向运载体，已得到了广泛研究，并已有3个品种进入市场。然而表面未经修饰包衣的普通脂质体，经静脉注射入体内后，一部分被网状内皮系统(RES)识别和摄取，另一部分到达靶区释放药物，发挥药效。RES的吞噬作用一方面降低了脂质体的主动靶向性，另一方面也增加了对网状内皮细胞的毒性。近年来国外发展了一类长循环脂质体[2，3]，其中有PEG衍生物对脂质体进行包衣而制备的长循环脂质体，可促进血循环时间的延长，逃避网状内皮系统的捕获，靶向到癌组织，增强抗癌活性[4]。最有发展前途。本文对自制长循环材料PEG衍生物的溶血性[5]，包衣后脂质体的稳定性进行了初步研究。
1 材料与仪器
, http://www.100md.com
1.1 仪器：岛津UV-260型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；DT-100电光分析天平。
1.2 材料：大豆磷脂(上海油脂二厂)；胆固醇(进口包装)；CHCl3、CaCl2均为分析纯；新西兰兔；昆明种小鼠。上述动物由沈阳药科大学动物中心提供。
2 方法与结果
2.1 合成材料的溶血试验
2.1.1 兔血细胞全溶血溶液的紫外扫描图：取新鲜兔全血 1ml 加蒸馏水至10ml，置37℃水浴，1h 后取出，以3000r/min离心5min,取上清液进行紫外扫描，结果在414.4nm波长处有最大吸收，图1确定为测定波长。
, 百拇医药
图1 兔血细胞全溶血溶液的UV扫描图
2.1.2 不同浓度合成材料对兔血细胞溶血性试验比较：按文献[6]方法进行试验，取4支相同试管，各加1ml兔全血，分别加不同浓度合成材料溶液0.1ml，各加生理盐水至10ml，置37℃水浴1h后，以3000r/min离心5min，取上清液于 414.4nm 测吸收度A，并与阳性溶血管进行比较，测得溶血度。溶血度(%)=A待测/A阳对×100%。结果见图2。
图2 不同浓度合成材料中兔血细胞的溶血度
2.1.3.不同动物血细胞溶血性试验比较：取新鲜小鼠和兔的全血，分别加到如附表所列3组试管中，各以1、2、3、4、5号管顺序和加两种动物全血1ml、不同浓度合成材料溶液各0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，加生理盐水至10ml，均置37℃水浴，1h后取出，以3000r/min离心5min,取上清液，方法同上，测溶血度或显微镜检查，小鼠实验管镜检均无红细胞，结果见附表。由附表可见合成材料对兔血细胞比小鼠血细胞易溶血。
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附表 合成材料对不同动物全血的溶血情况 全血
种类
合成材料
浓度(g/L)
管号
1
2
3
4
5
小鼠
2.0
未溶
, 百拇医药
未溶
未溶
未溶
未溶
兔
0.6
1～5号管离心有沉淀，但镜检无红细胞
兔
1.8
1～5号管离心无沉淀，镜检也无红细胞
2.2 普通脂质体与长循环脂质体的体外稳定性比较
2.2.1 空白脂质体的制备：普通脂质体与长循环脂质体的制备采用逆相蒸发法。普通脂质体分别精密称取大豆磷脂、胆固醇(4∶1)混合，长循环脂质体分别精密称取大豆磷脂、胆固醇以及自制PEG衍生物(前两者固定比为4∶1)混合，各溶于CHCl3溶液，加入300mmol/L枸橼酸—枸橼酸钠缓冲液(pH=4)，经超声分散成w/o型乳剂，再经旋转蒸发除去乳剂中的有机溶媒，形成均匀脂质体。过微孔滤膜(200nm)，得均匀粒径的脂质体。
, http://www.100md.com
2.2.2 Ca2+对不同脂质体稳定性的影响：分别取普通脂质体、含合成材料0.2、0.6、1.8g/L的LCL快速加入1mol/L Ca2+溶液中，于450nm处测定吸收度的变化，吸收度变化率与时间的关系见图3。图示曲线表明，合成材料对外界条件的改变响应不明显。
图3 含不同量合成物质制成脂质体在水中△A与t的关系
(1.普通脂质体；2、3、4分别为含合成材料0.2、0.6、1.8g/L脂质体)
2.2.3 合成材料对阴、阳脂质体相互作用的影响：自制阳性材料、阴性材料用上述方法制得阳性脂质体、阴性脂质体、阳性长循环脂质体、阴性长循环脂质体，分别以阴、阳脂质体两者组合，各取0.1ml，快速加入5ml H2O中，在450nm处观察吸收度变化，其吸收度变化率与时间关系曲线见图4。图中曲线表示合成材料使荷相反电荷物质对脂质体的作用明显减弱。
, http://www.100md.com
图4 阴、阳liposomes结合后吸收度变化率随时间的关系
(a.阳性脂质体；b.阴性脂质体；c.长循环阳性脂质体；d.长循环阴性脂质体)
3 讨论
合成的高分子材料PEG衍生物为两亲性物质，具有表面活性剂的作用，由于将来用于静脉给药，有必要进行溶血试验，由试验可见，2g/L合成材料对家兔全血溶血，而对小鼠全血则不溶，可能与种属差异有关。
制备脂质体磷脂与胆固醇必须保持一定比例。因在体内，磷脂在血浆中起乳化作用，影响胆固醇与脂肪的运输和沉着，静脉给予磷脂，可促进粥样硬化斑的消散，防止胆固醇引起的血管内神经内膜损伤。
所合成的材料是将亲水性大分子(PEG等)通过脂质镶嵌到脂质膜上，既有亲水基又有亲油基，用其对脂质体进行表面修饰包衣。见图5。
, 百拇医药
A普通脂质体 B经修饰包衣的长循环脂质体
图5 长循环脂质体的结构模式图
由于脂质体表面的亲水性高分子物质存在，使脂质体具有一些新的特征，对外界条件改变的响应不显著，一些金属离子、荷相反电荷物质对脂质体作用明显减弱，从而保证了脂质体的体内稳定性。
参考文献
1 顾学裘，等.抗癌药物靶向载体.中国多相脂质体研究.中国医药科技出版社，1991
2 袁树军，等.新型热敏脂质体的研究进展.沈阳药科大学学报，1998，15(4)
3 赵荣生，等.空间稳定脂质体与药物的靶向释放.中国药学学报，1998，38(8)∶452
4 Huang SK,et al.pharmacokinetics and therapeutics of sterically stabilized liposomes in mice bearing c-26 colon carcinoma.Cancer Res,1992,52(24)∶6774
5 郑永安.聚乙二醇及其在药剂中的应用.中国药学学报，1989，24(8)∶451
6 徐叔云，等.药理实验方法学.北京：人民卫生出版社，1982
(1999年6月30日收稿), http://www.100md.com