反义BCR/ABL寡核苷酸体外抑制K562细胞的研究
作者：戴木水 戴丽君 洪文德 罗绍凯 彭爱华 王顺清
单位：中山医科大学附属第一医院血液病研究室； 广州， 510080
关键词：白血病，髓样，慢性；药物疗法；凋亡；药物作用；基因，ABL；寡核苷酸，反义；治疗应用；肿瘤细胞，培养的
中山医科大学学报990115 摘 要 目的：探讨反义BCR和ABL融合基因(BCR/ABL融合基因)寡核苷酸体外抑制K562细胞的作用及机制。方法：采用K562细胞培养，观察反义BCR/ABL寡核苷酸体外对K562细胞数、台盼蓝拒染率及克隆形成等的影响。结果：经反义BCR/ABL寡核苷酸b3a2(AS-b3a2)处理后培养8d的K562克隆抑制率达60.69%，液体培养中细胞数从24h开始较对照组减少，细胞存活率从8h开始即较对照组明显下降，BCR/ABL寡核苷酸b2a2(AS-b2a2)及无义寡核苷酸对K562细胞数和存活率无明显影响；3种寡核苷酸对HL-60细胞数和存活率也无影响。结论：AS-b3a2对K562细胞有序列特异性的抑制作用。AS-b3a2的这种抑制作用可能在于它诱导K562细胞的凋亡。
, http://www.100md.com
中图号 R 733.71
In Vitro Inhibition of K562 Cell Lines by BCR-ABL Antisense Oligonucleotide
Dai Mushui Dai Lijunhong Wende Luo Shaokai Peng Aihua Wang Shunqing
(Department of Hematology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080)
Abstract Objective: To explore the inhibition of K562 cell lines by bcr-abl antisense oligonucleotide in vitro. Methods: K562 cell line was used to observe the influences on cell proliferation, the ability to exclude trypan blue and the clonal formation in vitro treatment with BCR/ABL antisense oligonucleotide. Results: The clonal formation of K562 cell line after treatment with BCR/ABL antisense oligonucleotide b3a2 (AS-b3a2) was inhibited obviously. In liquid culture, the quantity of cell proliferation decreased from 24 hour after treatment, while the ability to exclude trypan blue significantly decreased from 8 hours after treatment. No influences on the number and activities of K562 cells were found when the cells were treated with BCR/ABL antisense oligonucleotide b2a2 (AS-b2a2) or non-sense oligonucleotide. Meanwhile, these three oligonucleotides could not influence the number and activities of HL-60 cell lines. Conclusions: AS-b3a2 could sequence-specifically inhibit activities and proliferation of K562 cells.
, 百拇医药
Subject headings leukemia, myeloid, chronic/drug therapy; apoptosis/drug effects; gene, abl; oligonucleotide, antisense/therapeutic use; tumor cells, cultured
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增生性疾病。该病最大的细胞遗传学特点是存在特异性的Ph染色体即t(9；22)，这一易位使正常位于9q34上的c-ab1基因与22q11上的bcr基因发生融合形成BCR/ABL融合基因，并表达BCR/ABL融合蛋白(P 210蛋白)。目前认为该蛋白在CML发病中起重要作用[1，2]，因而如何抑制BCR/ABL mRNA及P 210蛋白的表达以达到分子水平的完全缓解(CR)成为CML现代治疗的新突出点。本研究观察反义BCR/ABL寡核苷酸体外对CML细胞的抑制作用，为临床反义基因治疗提供理论和实验依据。
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1 材料和方法
1.1 细胞株
人CML急性变细胞株K562、人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60为我室冷冻保存细胞株。使用时用含φ=10%小牛血清，pH 7.0的RPMI-1640培养液传代培养，取对数增殖期细胞制备浓度为2×109/L的单个核细胞悬液。
1.2 反义寡核苷酸
据BCR/ABL融合区基因序列类型的不同[3]，合成2条反义BCR/ABL寡核苷酸：b3a2 antisense (AS-b3a2) 5′-GAA GGG CTT TTG AAC TCT-3′和b2a2 antisense (AS-b2a2) 5′-GAA GGG CTT CTT CCT TAT-3′，另设一条无意义寡核苷酸(nonsense, NS) 5′-TCT TCCAAC TTG GAA GGG AGA-3′作对照[4]，均为上海细胞生物研究所人工合成，使用时用无菌双蒸水配成浓度为0.5mol/L。
, 百拇医药
1.3 寡核苷酸体外处理及克隆形成培养
取K562及HL-60单个核细胞悬液1mL(含5×105个细胞)，分4组进行处理：①对照组不加任何寡核苷酸，②③④组分别加入寡核苷酸AS-b3a2、AS-b2a2及NS，浓度均为10 fmoL/L，12h后再加5 fmoL/L，于37 ℃、φ=5% CO2、完全饱和湿度下在24孔培养板中培养，18h收集细胞作半固体培养。RPMI-1640培养体系含2×104单个核细胞、φ=30%小牛血清、0.88%甲基纤维素(Sigma产品)、青霉素100 U、链霉素100 U、丁胺卡那霉素20 μg，调至pH 7.0，充分混匀后，分2孔，每孔0.5mL加入24孔培养板中，置37℃、φ=5% CO2、完全饱和湿度下培养8d，计数含40个以上细胞的集落数，取2孔的均数用于资料统计。
1.4 细胞计数及台盼蓝拒染率
, 百拇医药
分别计数加入各种寡核苷酸第0、8、16、24h和48h的细胞数和台盼蓝(Sigma产品)拒染率。每个时间点细胞计数3次，取均值；台盼蓝拒染率计数100个细胞中的活细胞数，每组3次取均值。
1.5 统计学处理
计量资料用
±s表示；2个样本均数的比较用t检验。集落存活率＝试验组集落均数/对照组集落均数×100%。细胞死亡率＝1-台盼蓝拒染率。
2 结 果
2.1 反义核酸体外对K562和HL-60细胞存活率的影响
由表1可见，用与K562细胞表达的BCR/ABL融合基因结合部序列互补的反义寡核苷酸AS-b3a2体外处理，K562细胞白血病集落形成单位(L-CFU)集落存活率明显下降，体外克隆抑制率(1-存活率)达60.69%(P<0.01)；而AS-b2a2及NS对K562细胞集落存活率无明显影响。上述3种寡核苷酸对HL-60细胞L-CFU存活率均无明显影响(P>0.05)。
, 百拇医药
表1 反义核酸体外对K562及HL-60细胞L-CFU存活率的影响
Table 1 The influence on L-CFU survival rate of K562 and HL-60 cell lines by antisense oligonucleotide in vitro (±s, %)
K562(n=10)
P
HL-60 (n=10)
P
Clone
survival
, 百拇医药
rate
clone
survival
rate
Note:Contral
597.3±72.8
100
746.9±57.3
100.0
AS-b3a2
234.8±47.4
39.31)
, http://www.100md.com
<0.01
732.0±64.8
98.02)
>0.05
AS-b2a2
510.8±70.5
85.52)
>0.05
738.1±88.6
98.82)
>0.05
, 百拇医药 NS
541.9±87.7
90.72)
>0.05
718.5±85.8
96.12)
>0.05
Note:Compared with control group:1)P<0.01; 2)P>0.05
2.2 AS-b3a2体外对K562及HL-60细胞增殖和存活率的影响
由表2，3可见，与对照组相比，加入AS-b3a2后8h及16h的细胞增殖数无明显减少，24h和48h的K562细胞数较对照组明显减少(P<0.05)，而细胞死亡率从8h开始即较对照组明显升高(P<0.05)。24h细胞存活率84.5%，48h仅73.7%；而AS-b2a2和NS对K562细胞数和细胞存活率均无明显影响(P>0.05)。3种寡核苷酸对HL-60细胞的增殖数及其细胞存活率也无明显影响(P>0.05)。
, 百拇医药
表2 反义核酸体外对液体培养的K562及HL-60细胞数的影响
Table 2 The influence on cell numbers of K562 and HL-60 cultured in liquid by antisense oligonucleotide in vitro (±s, ×105) Cells
antisense
oligonucleotide
treatment time (t /h)
0
8
, 百拇医药
16
24
48
K562
contral
5.00
5.65±0.43
7.36±0.50
9.89±0.71
15.76±0.91
(n=10)
AS-b3a2
, 百拇医药 5.00
5.27±0.312)
6.71±0.762)
7.06±0.391)
9.19±0.811)
AS-b2a2
5.00
5.69±0.332)
6.94±0.482)
9.49±0.702)
, 百拇医药
14.95±0.892)
NS
5.00
5.68±0.352)
7.05±0.44
9.92±0.562)
15.48±0.612)
hL-60
contral
5.00
6.13±0.55
, 百拇医药
7.20±0.59
8.93±0.62
14.20±0.81
(n=10)
AS-b3a2
5.00
6.40±0.742)
7.33±1.022)
9.02±0.732)
14.53±0.852)
AS-b2a2
, http://www.100md.com
5.00
6.34±0.742)
7.15±0.602)
9.19±0.582)
14.41±0.522)
NS
5.00
6.39±0.632)
7.34±0.492)
9.04±0.592)
, 百拇医药
14.44±0.692)
Note:Compared with control group: 1) P<0.01；2) P>0.05
表3 反义核酸体外对液体培养的K562及HL-60细胞死亡率的影响
Table 3 The influence on death rate of K562 and HL-60 cell lines cultured in liquid by antisense oligonucleotide in vitro (±s, %) Cells
antisense
oligonucleotide
, http://www.100md.com
treatment time (t /h)
0
8
16
24
48
K562
contral
2.20
3.40±0.97
3.80±0.77
4.40±1.17
, 百拇医药 5.70±1.25
(n=10)
AS-b3a2
2.20
6.60±1.581)
8.70±1.571)
15.50±3.831)
26.30±5.271)
AS-b2a2
2.20
4.30±0.062)
, 百拇医药
4.50±1.182)
4.90±1.102)
5.70±5.272)
NS
2.20
4.40±1.082)
5.10±0.992)
5.20±1.032)
5.60±0.842)
hL-60
, 百拇医药
contral
3.35
4.60±0.97
5.40±0.97
5.90±1.20
7.00±1.16
(n=10)
AS-b3a2
3.35
4.201±1.132)
5.20±1.232)
, http://www.100md.com
5.50±1.082)
6.60±0.972)
AS-b2a2
3.35
4.50±1.082)
5.30±1.642)
5.80±1.032)
6.60±1.272)
NS
3.35
, http://www.100md.com
4.30±1.162)
5.10±0.992)
5.60±1.172)
7.10±1.292)
Note:Compared with control group: 1) P<0.01；2) P>0.05
3 讨 论
已知95%以上的CML携带BCR/ABL融合基因，据BCR/ABL基因断裂点位置的不同，Ph染色体阳性(Ph+)CML至少表现2种分子异构体，即BCR-exon3/ABL exon2 (b3a2)和BCR exon2/ABL exon2 (b2a2)，2种融合mRNA表达的P 210蛋白相差25个氨基酸，但均具有酪氨酸蛋白激酶活性。大量的研究已提示BCR/ABL基因及其表达产物P 210在CML发病中起重要作用，动物实验也证明导入BCR/ABL基因可引致转基因小鼠CML样改变。因此如果能从基因水平上封闭BCR/ABL基因的表达，对临床将有重要意义。现代CML的治疗也着眼于分子水平的CR，如干扰素(INF)可使部分病人获得Ph-骨髓造血而有延长慢性期的作用[5]。已有资料表明针对BCR/ABL融合区序列的反义DNA/RNA有抑制Ph+克隆的作用[4，6～8]。
, 百拇医药
本实验用针对K562细胞表达的b3a2型BCR/ABL融合基因设计的反义寡核苷酸AS-b3a2体外处理K562细胞，观察到它对K562细胞的克隆形成有明显的抑制作用，抑制率可达60.69%，而错配反义寡核苷酸AS-b2a2及NS均无抑制作用，各寡核苷酸对HL-60细胞集落形成也均无明显影响，提示反义BCR/ABL DNA在体外对CML L-CFU克隆有序列特异性的抑制作用。与文献[6]报道相符，Sezylih等用反义寡核苷酸处理CML病人细胞，结果显示L-CFU从未处理组的806降到108，而错配寡核苷酸处理组为786，且3组正常粒-单细胞集落形成单位(GM-CFU)的形成均无明显改变。
为探讨这种抑制作用的机制，我们观察了序列特异的反义寡核苷酸处理后K562细胞的增殖及其活性情况，发现AS-b3a2处理后24h内对K562的细胞增殖并无影响，而细胞的存活率从8h开始即有明显下降，提示这种作用主要对细胞的生存有明显抑制作用，即处理后细胞的存活期明显缩短。我们还从DNA水平观察到无血清培养下，序列特异的寡核苷酸处理后8h即出现细胞的凋亡，在48h达高峰，而未处理组的K562细胞在24h后才有少量细胞凋亡。通过电镜及流式细胞仪检测，我们观察到这种细胞凋亡的改变[9]，从而提示反义BCR/ABL寡核苷酸确有诱导细胞凋亡的作用，即BCR/ABL致CML作用可能在于抑制髓系细胞的凋亡，而反义BCR/ABL寡核苷酸抑制Ph+克隆的机制在于它诱导髓系细胞凋亡。支持1994年Bedi等[7]的报道，提示BCR/ABL基因与BCL-2基因一样，也是一种抗细胞凋亡基因。
, 百拇医药
从我们的结果可以看出，这种反义基因体外抑制细胞的作用有重要意义，用反义BCR/ABL体外净化Ph+克隆细胞后实施自体骨髓移植将为许多无HLA配型及Allo-BMT机会的CML病人提供了一种更有意义的根治措施，而这种方法或可与高温、单克隆抗体或INF及其它化疗药物联合应用来净化骨髓中微量残留Ph+白血病细胞，因而具有重要的临床意义。
参考文献
1 Butturini A, Gale R P. Chronic myelogenous leukemia as a model of cancer development. Semin Oncol, 1995, 22(4):374
2 戴木水，洪文德. Molecular biological aspects of evolution of chronic myelogenous leukemia to blast crisis. 实验血液学杂志，1995，3(1)：33
, 百拇医药
3 McGahon A, Bissonnette R, Schimitt M, et al. BCR-ABL maintains resistence of chronic myelogenous leukemia cells to apoptosis cell death. Blood, 1994, 83(5):1179
4 戴木水，洪文德，庞国元，等. 用PCR技术评价微量残留白血病细胞体外净化的效果. 中华血液学杂志，1995，16(1)：23
5 戴木水，洪文德. 慢性粒细胞白血病的现代治疗及其分子生物学基础. 国外医学内科学分册，1996，23(4)：156
6 Szczylik C, Skorski T, Nicolaides N C, et al. Selective inhibition of leukemia cell proliferation by BCR/ABL antisense oligodoxynucleotides. Science, 1991, 253(5019):562
, 百拇医药
7 Bedi A, Zehnbauer B A, Barber J P, et al. Inhibition of apoptosis by BCR/ABL in chronic myelogenous leukemia. Blood, 1994, 83(8):2038
8 Smetsers T F, Skorski T, Van de Locht L T, et al. Antisense BCR-ABL oligonucleotides induce apoptosis in the philadelphia chromosome-positive cell line BV173. Leukemia, 1994, 8(1):129
9 戴木水，罗绍凯，戴丽君，等. 反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的研究. 中华血液学杂志，1997，18(5)：264
(1998 - 03 - 25收稿 1998 - 08 - 25修回), http://www.100md.com
单位：中山医科大学附属第一医院血液病研究室； 广州， 510080
关键词：白血病，髓样，慢性；药物疗法；凋亡；药物作用；基因，ABL；寡核苷酸，反义；治疗应用；肿瘤细胞，培养的
中山医科大学学报990115 摘 要 目的：探讨反义BCR和ABL融合基因(BCR/ABL融合基因)寡核苷酸体外抑制K562细胞的作用及机制。方法：采用K562细胞培养，观察反义BCR/ABL寡核苷酸体外对K562细胞数、台盼蓝拒染率及克隆形成等的影响。结果：经反义BCR/ABL寡核苷酸b3a2(AS-b3a2)处理后培养8d的K562克隆抑制率达60.69%，液体培养中细胞数从24h开始较对照组减少，细胞存活率从8h开始即较对照组明显下降，BCR/ABL寡核苷酸b2a2(AS-b2a2)及无义寡核苷酸对K562细胞数和存活率无明显影响；3种寡核苷酸对HL-60细胞数和存活率也无影响。结论：AS-b3a2对K562细胞有序列特异性的抑制作用。AS-b3a2的这种抑制作用可能在于它诱导K562细胞的凋亡。
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中图号 R 733.71
In Vitro Inhibition of K562 Cell Lines by BCR-ABL Antisense Oligonucleotide
Dai Mushui Dai Lijunhong Wende Luo Shaokai Peng Aihua Wang Shunqing
(Department of Hematology, First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510080)
Abstract Objective: To explore the inhibition of K562 cell lines by bcr-abl antisense oligonucleotide in vitro. Methods: K562 cell line was used to observe the influences on cell proliferation, the ability to exclude trypan blue and the clonal formation in vitro treatment with BCR/ABL antisense oligonucleotide. Results: The clonal formation of K562 cell line after treatment with BCR/ABL antisense oligonucleotide b3a2 (AS-b3a2) was inhibited obviously. In liquid culture, the quantity of cell proliferation decreased from 24 hour after treatment, while the ability to exclude trypan blue significantly decreased from 8 hours after treatment. No influences on the number and activities of K562 cells were found when the cells were treated with BCR/ABL antisense oligonucleotide b2a2 (AS-b2a2) or non-sense oligonucleotide. Meanwhile, these three oligonucleotides could not influence the number and activities of HL-60 cell lines. Conclusions: AS-b3a2 could sequence-specifically inhibit activities and proliferation of K562 cells.
, 百拇医药
Subject headings leukemia, myeloid, chronic/drug therapy; apoptosis/drug effects; gene, abl; oligonucleotide, antisense/therapeutic use; tumor cells, cultured
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性增生性疾病。该病最大的细胞遗传学特点是存在特异性的Ph染色体即t(9；22)，这一易位使正常位于9q34上的c-ab1基因与22q11上的bcr基因发生融合形成BCR/ABL融合基因，并表达BCR/ABL融合蛋白(P 210蛋白)。目前认为该蛋白在CML发病中起重要作用[1，2]，因而如何抑制BCR/ABL mRNA及P 210蛋白的表达以达到分子水平的完全缓解(CR)成为CML现代治疗的新突出点。本研究观察反义BCR/ABL寡核苷酸体外对CML细胞的抑制作用，为临床反义基因治疗提供理论和实验依据。
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1 材料和方法
1.1 细胞株
人CML急性变细胞株K562、人急性早幼粒细胞白血病细胞株HL-60为我室冷冻保存细胞株。使用时用含φ=10%小牛血清，pH 7.0的RPMI-1640培养液传代培养，取对数增殖期细胞制备浓度为2×109/L的单个核细胞悬液。
1.2 反义寡核苷酸
据BCR/ABL融合区基因序列类型的不同[3]，合成2条反义BCR/ABL寡核苷酸：b3a2 antisense (AS-b3a2) 5′-GAA GGG CTT TTG AAC TCT-3′和b2a2 antisense (AS-b2a2) 5′-GAA GGG CTT CTT CCT TAT-3′，另设一条无意义寡核苷酸(nonsense, NS) 5′-TCT TCCAAC TTG GAA GGG AGA-3′作对照[4]，均为上海细胞生物研究所人工合成，使用时用无菌双蒸水配成浓度为0.5mol/L。
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1.3 寡核苷酸体外处理及克隆形成培养
取K562及HL-60单个核细胞悬液1mL(含5×105个细胞)，分4组进行处理：①对照组不加任何寡核苷酸，②③④组分别加入寡核苷酸AS-b3a2、AS-b2a2及NS，浓度均为10 fmoL/L，12h后再加5 fmoL/L，于37 ℃、φ=5% CO2、完全饱和湿度下在24孔培养板中培养，18h收集细胞作半固体培养。RPMI-1640培养体系含2×104单个核细胞、φ=30%小牛血清、0.88%甲基纤维素(Sigma产品)、青霉素100 U、链霉素100 U、丁胺卡那霉素20 μg，调至pH 7.0，充分混匀后，分2孔，每孔0.5mL加入24孔培养板中，置37℃、φ=5% CO2、完全饱和湿度下培养8d，计数含40个以上细胞的集落数，取2孔的均数用于资料统计。
1.4 细胞计数及台盼蓝拒染率
, 百拇医药
分别计数加入各种寡核苷酸第0、8、16、24h和48h的细胞数和台盼蓝(Sigma产品)拒染率。每个时间点细胞计数3次，取均值；台盼蓝拒染率计数100个细胞中的活细胞数，每组3次取均值。
1.5 统计学处理
计量资料用
±s表示；2个样本均数的比较用t检验。集落存活率＝试验组集落均数/对照组集落均数×100%。细胞死亡率＝1-台盼蓝拒染率。2 结 果
2.1 反义核酸体外对K562和HL-60细胞存活率的影响
由表1可见，用与K562细胞表达的BCR/ABL融合基因结合部序列互补的反义寡核苷酸AS-b3a2体外处理，K562细胞白血病集落形成单位(L-CFU)集落存活率明显下降，体外克隆抑制率(1-存活率)达60.69%(P<0.01)；而AS-b2a2及NS对K562细胞集落存活率无明显影响。上述3种寡核苷酸对HL-60细胞L-CFU存活率均无明显影响(P>0.05)。
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表1 反义核酸体外对K562及HL-60细胞L-CFU存活率的影响
Table 1 The influence on L-CFU survival rate of K562 and HL-60 cell lines by antisense oligonucleotide in vitro (
±s, %)K562(n=10)
P
HL-60 (n=10)
P
Clone
survival
, 百拇医药
rate
clone
survival
rate
Note:Contral
597.3±72.8
100
746.9±57.3
100.0
AS-b3a2
234.8±47.4
39.31)
, http://www.100md.com
<0.01
732.0±64.8
98.02)
>0.05
AS-b2a2
510.8±70.5
85.52)
>0.05
738.1±88.6
98.82)
>0.05
, 百拇医药 NS
541.9±87.7
90.72)
>0.05
718.5±85.8
96.12)
>0.05
Note:Compared with control group:1)P<0.01; 2)P>0.05
2.2 AS-b3a2体外对K562及HL-60细胞增殖和存活率的影响
由表2，3可见，与对照组相比，加入AS-b3a2后8h及16h的细胞增殖数无明显减少，24h和48h的K562细胞数较对照组明显减少(P<0.05)，而细胞死亡率从8h开始即较对照组明显升高(P<0.05)。24h细胞存活率84.5%，48h仅73.7%；而AS-b2a2和NS对K562细胞数和细胞存活率均无明显影响(P>0.05)。3种寡核苷酸对HL-60细胞的增殖数及其细胞存活率也无明显影响(P>0.05)。
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表2 反义核酸体外对液体培养的K562及HL-60细胞数的影响
Table 2 The influence on cell numbers of K562 and HL-60 cultured in liquid by antisense oligonucleotide in vitro (
±s, ×105) Cellsantisense
oligonucleotide
treatment time (t /h)
0
8
, 百拇医药
16
24
48
K562
contral
5.00
5.65±0.43
7.36±0.50
9.89±0.71
15.76±0.91
(n=10)
AS-b3a2
, 百拇医药 5.00
5.27±0.312)
6.71±0.762)
7.06±0.391)
9.19±0.811)
AS-b2a2
5.00
5.69±0.332)
6.94±0.482)
9.49±0.702)
, 百拇医药
14.95±0.892)
NS
5.00
5.68±0.352)
7.05±0.44
9.92±0.562)
15.48±0.612)
hL-60
contral
5.00
6.13±0.55
, 百拇医药
7.20±0.59
8.93±0.62
14.20±0.81
(n=10)
AS-b3a2
5.00
6.40±0.742)
7.33±1.022)
9.02±0.732)
14.53±0.852)
AS-b2a2
, http://www.100md.com
5.00
6.34±0.742)
7.15±0.602)
9.19±0.582)
14.41±0.522)
NS
5.00
6.39±0.632)
7.34±0.492)
9.04±0.592)
, 百拇医药
14.44±0.692)
Note:Compared with control group: 1) P<0.01；2) P>0.05
表3 反义核酸体外对液体培养的K562及HL-60细胞死亡率的影响
Table 3 The influence on death rate of K562 and HL-60 cell lines cultured in liquid by antisense oligonucleotide in vitro (
±s, %) Cellsantisense
oligonucleotide
, http://www.100md.com
treatment time (t /h)
0
8
16
24
48
K562
contral
2.20
3.40±0.97
3.80±0.77
4.40±1.17
, 百拇医药 5.70±1.25
(n=10)
AS-b3a2
2.20
6.60±1.581)
8.70±1.571)
15.50±3.831)
26.30±5.271)
AS-b2a2
2.20
4.30±0.062)
, 百拇医药
4.50±1.182)
4.90±1.102)
5.70±5.272)
NS
2.20
4.40±1.082)
5.10±0.992)
5.20±1.032)
5.60±0.842)
hL-60
, 百拇医药
contral
3.35
4.60±0.97
5.40±0.97
5.90±1.20
7.00±1.16
(n=10)
AS-b3a2
3.35
4.201±1.132)
5.20±1.232)
, http://www.100md.com
5.50±1.082)
6.60±0.972)
AS-b2a2
3.35
4.50±1.082)
5.30±1.642)
5.80±1.032)
6.60±1.272)
NS
3.35
, http://www.100md.com
4.30±1.162)
5.10±0.992)
5.60±1.172)
7.10±1.292)
Note:Compared with control group: 1) P<0.01；2) P>0.05
3 讨 论
已知95%以上的CML携带BCR/ABL融合基因，据BCR/ABL基因断裂点位置的不同，Ph染色体阳性(Ph+)CML至少表现2种分子异构体，即BCR-exon3/ABL exon2 (b3a2)和BCR exon2/ABL exon2 (b2a2)，2种融合mRNA表达的P 210蛋白相差25个氨基酸，但均具有酪氨酸蛋白激酶活性。大量的研究已提示BCR/ABL基因及其表达产物P 210在CML发病中起重要作用，动物实验也证明导入BCR/ABL基因可引致转基因小鼠CML样改变。因此如果能从基因水平上封闭BCR/ABL基因的表达，对临床将有重要意义。现代CML的治疗也着眼于分子水平的CR，如干扰素(INF)可使部分病人获得Ph-骨髓造血而有延长慢性期的作用[5]。已有资料表明针对BCR/ABL融合区序列的反义DNA/RNA有抑制Ph+克隆的作用[4，6～8]。
, 百拇医药
本实验用针对K562细胞表达的b3a2型BCR/ABL融合基因设计的反义寡核苷酸AS-b3a2体外处理K562细胞，观察到它对K562细胞的克隆形成有明显的抑制作用，抑制率可达60.69%，而错配反义寡核苷酸AS-b2a2及NS均无抑制作用，各寡核苷酸对HL-60细胞集落形成也均无明显影响，提示反义BCR/ABL DNA在体外对CML L-CFU克隆有序列特异性的抑制作用。与文献[6]报道相符，Sezylih等用反义寡核苷酸处理CML病人细胞，结果显示L-CFU从未处理组的806降到108，而错配寡核苷酸处理组为786，且3组正常粒-单细胞集落形成单位(GM-CFU)的形成均无明显改变。
为探讨这种抑制作用的机制，我们观察了序列特异的反义寡核苷酸处理后K562细胞的增殖及其活性情况，发现AS-b3a2处理后24h内对K562的细胞增殖并无影响，而细胞的存活率从8h开始即有明显下降，提示这种作用主要对细胞的生存有明显抑制作用，即处理后细胞的存活期明显缩短。我们还从DNA水平观察到无血清培养下，序列特异的寡核苷酸处理后8h即出现细胞的凋亡，在48h达高峰，而未处理组的K562细胞在24h后才有少量细胞凋亡。通过电镜及流式细胞仪检测，我们观察到这种细胞凋亡的改变[9]，从而提示反义BCR/ABL寡核苷酸确有诱导细胞凋亡的作用，即BCR/ABL致CML作用可能在于抑制髓系细胞的凋亡，而反义BCR/ABL寡核苷酸抑制Ph+克隆的机制在于它诱导髓系细胞凋亡。支持1994年Bedi等[7]的报道，提示BCR/ABL基因与BCL-2基因一样，也是一种抗细胞凋亡基因。
, 百拇医药
从我们的结果可以看出，这种反义基因体外抑制细胞的作用有重要意义，用反义BCR/ABL体外净化Ph+克隆细胞后实施自体骨髓移植将为许多无HLA配型及Allo-BMT机会的CML病人提供了一种更有意义的根治措施，而这种方法或可与高温、单克隆抗体或INF及其它化疗药物联合应用来净化骨髓中微量残留Ph+白血病细胞，因而具有重要的临床意义。
参考文献
1 Butturini A, Gale R P. Chronic myelogenous leukemia as a model of cancer development. Semin Oncol, 1995, 22(4):374
2 戴木水，洪文德. Molecular biological aspects of evolution of chronic myelogenous leukemia to blast crisis. 实验血液学杂志，1995，3(1)：33
, 百拇医药
3 McGahon A, Bissonnette R, Schimitt M, et al. BCR-ABL maintains resistence of chronic myelogenous leukemia cells to apoptosis cell death. Blood, 1994, 83(5):1179
4 戴木水，洪文德，庞国元，等. 用PCR技术评价微量残留白血病细胞体外净化的效果. 中华血液学杂志，1995，16(1)：23
5 戴木水，洪文德. 慢性粒细胞白血病的现代治疗及其分子生物学基础. 国外医学内科学分册，1996，23(4)：156
6 Szczylik C, Skorski T, Nicolaides N C, et al. Selective inhibition of leukemia cell proliferation by BCR/ABL antisense oligodoxynucleotides. Science, 1991, 253(5019):562
, 百拇医药
7 Bedi A, Zehnbauer B A, Barber J P, et al. Inhibition of apoptosis by BCR/ABL in chronic myelogenous leukemia. Blood, 1994, 83(8):2038
8 Smetsers T F, Skorski T, Van de Locht L T, et al. Antisense BCR-ABL oligonucleotides induce apoptosis in the philadelphia chromosome-positive cell line BV173. Leukemia, 1994, 8(1):129
9 戴木水，罗绍凯，戴丽君，等. 反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡的研究. 中华血液学杂志，1997，18(5)：264
(1998 - 03 - 25收稿 1998 - 08 - 25修回), http://www.100md.com