登革病毒大片段NS3基因扩增的方法探讨
作者：晏辉钧 江丽芳 潘文彤 李向群 方丹云 陈元 郭辉玉
单位：晏辉钧 江丽芳 潘文彤 方丹云 陈元 郭辉玉(中山医科大学微生物学教研室； 广州， 510089)；李向群(湖北医科大学病毒研究所； 武汉， 430071)
关键词：登革病毒；遗传学；基因，病毒；新几内亚；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报/990307
摘要 目的：探索一种快速、实用的扩增登革病毒大片段基因的方法。方法：用登革2型新几内亚C株(DV2，NGC株)的核酸(RNA)为模板，研究了在不同条件下(病毒和其变性液的量以及cDNA的浓度等)通过逆转录-聚合酶链式反应技术扩增大片段NS3基因，并对扩增的目的基因用巢式PCR进行了鉴定。结果：用大量的或小量的登革病毒培养上清中提取RNA的方法在一定条件下均可扩增出大片段NS3基因。结论：小量登革病毒提取RNA扩增大片段NS3基因法较大量登革病毒提取RNA扩增大片段NS3基因快速、实用。
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中图号 R 373.33； Q75
Studying of the Method of Amplifying Large NS3
Gene Fragment of Dengue Virus
Yan Huijun1 Jiang Lifang1 Pan Wentong1 Li Xiangchun2
Fang Danyun1 Chen Yuan1 Guo Huiyu1
( 1 Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089
, http://www.100md.com
2 Institute of Virology, Hubei Medical University, Wuhan, 430071)
Abstract Objective:To find out a rapid and practical method of amplifying large NS3 gene fragment of dengue virus. Methods: The large NS3 gene fragment was amplified using ribonucleic acid(RNA) isolated from the New Guinea C(NGC) strain of dengue 2 virus (DV2) as template by RT-PCR in different amounts of virus. Nested-PCR was used to identify the amplified target gene. Results:The large NS3 gene fragment were amplified from RNAs extracted from large or small amount of DV2-infected culture supernates. Conclusion: The method amplifying large NS3 gene fragment from small amount of dengue virus is faster and more practical than that amplifying from large amount of dengue virus.
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Subject headings Dengue virus/genetics; Genes,viral; new guinea; polymerase chain reaction/methods
登革病毒属黄病毒属，主要通过蚊媒传播给人。登革病毒根据抗原性不同分为4型，即DV1、DV2、DV3、DV4。登革病毒是一种单股正链RNA病毒，它编码3种结构蛋白(C、Prm、E)和至少7种非结构蛋白(NS1～NS5)，其编码的顺序为5′-C-Prm(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′[1]。其中，DV2 NGC株NS3基因位于4 522～6 375 nt，编码相对分子质量为69 ku的NS3蛋白，NS3蛋白是一种多功能蛋白，现已证明有蛋白酶，三磷酸核苷酶(NTPase)，螺旋酶和RNA三磷酸酶等酶的活性[2～4]。同时还已发现NS3蛋白可刺激机体产生保护性的抗体[5]，也可被体内特异的CD+4或CD+8 T淋巴细胞识别。因此，NS3蛋白对登革病毒疫苗的研制和病原学的诊断方面具有重要的意义。而目前通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增大片段基因尚存在一定难度，本研究利用RT-PCR技术，探讨扩增大片段登革病毒基因的最佳条件，旨在为进一步研究登革病毒的基因结构和功能的关系打下基础。
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1 材料与方法
1.1 病毒株和细胞株
登革2型病毒NGC株和C6/36细胞均为本室保存。
1.2 病毒RNA的提取
1.2.1 大量提取病毒核酸(RNA)
DV2感染的细胞50%～75%出现病变后，取其培养上清200～300 mL,按文献[6]方法大量提取DV2的核酸(RNA)，最后沉淀(RNA)按每1 mL DV2上清加1 μL ddH2O(去RNA酶)溶解。
1.2.2 小量提取DV2核酸(RNA)
DV2感染的细胞50%～75%出现病变后，取其培养上清200 μL，加入3倍体积的溶液D[6]，再加1/10体积(相对于溶液D的体积)2 mol/L NaAc(pH 4.0)、等体积的水饱和酚和1/5体积氯仿/异戊醇(49/1)，轻轻颠倒混2～3 min，冰浴15 min，4 ℃下15 000 r/min离心5 min，上清加等体积的异丙醇，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃下15 000 r/min离心15 min，沉淀用φ =70%乙醇洗1次，无水乙醇洗1次；真空抽干后，加DEPC处理过的ddH2O溶解沉淀(每管加5 μL ddH2O)。
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1.3 引物的合成
参考DV2 NGC株基因序列设计了如下3条引物，并在引物5′端引入酶切位点。引物由中科院上海细胞生物所合成。各引物的序列和核苷酸位置如下。
P1(正向，4 488～4 504 nt)： gcctg cag AGC ATG GTA CCT GTG GGA. P2(反向，6 453～6 435 nt):gc tct aga GTC CAG TGC GTC TCT TGC。 P3(正向，5 394～5 411 nt):gc AGC AAG TAT AGC GGC TAG(用于巢式PCR)。
1.4 逆转录反应
在20 μL的反应体积中加入10×RT buffer 2 μL、 25 mmol/L MgCl2 4 μL、10 mmol/L dNTP 2μL 、P2 1 μL(25 pmol)、RNase抑制剂0.5 μL(20 U)、AMV逆转录酶(Promega kit)1.8 μL(约16 U)、模板RNA(约2.0 μg)及ddH2O 8.7 μL；混匀后，室温放置10 min，然后置42 ℃反应1 h，接着95 ℃灭活 5 min,再立即冰浴，-20 ℃备用。
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1.5 PCR扩增DV2 NGC株NS3全长基因
取cDNA 5 μL加入50 μL的反应体积用P1和P2进行扩增，94 ℃ 5 min处理后，按94 ℃ 50 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 110 s在Hema 480基因扩增仪上进行30个循环扩增后，72 ℃下再延伸10 min，然后取样检查。
1.6 巢式PCR扩增NS3部分基因
取1 μL RT-PCR产物，用P2和P3按94 ℃ 40 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 70 s在Hema 480 基因扩增仪上进行30个循环扩增后，72 ℃下延伸 10 min，然后取样检查。
2 结果
用大量的或小量的登革2型病毒培养上清提取的核酸(RNA)为模板均扩增出大小约1 978 bp的特异条带，如图1，结果与预计值一致；用内引物(P3)与P2进行巢式PCR扩增出1 029 bp的特异条带，如图2，结果也与预计值一致。
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图1 RT-PCR产物
Fig.1 RT-PCR products
Lane l: 2 kb Marker Lane 2 and 3: RT-PCR product from large or small amount of DV2
图2 巢式PCR产物
Fig.2 Nested PCR products Lane M: λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ Lane 1 and 2:Nested PCR product
3 讨论
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登革2型病毒NGC株基因组全长10 723 bp，NS3 基因核苷酸位置为4 522～6 375 nt。本研究根据DV2 NGC株基因核苷酸序列，设计出两条可扩增包括整个NS3基因片段的引物，且在各自的5′端引入了酶切位点。由于DV是单股正链RNA病毒，需用RT-PCR进行基因扩增。秦鄂德、于曼[7，8]等人用抗体吸附并通过PEG6000浓缩病毒后提取DV2 RNA，并扩增出DV2全长E及NS1基因，但其长度均短于NS3基因。本研究用PEG6000浓缩病毒后，提取DV2的核酸(RNA)，并通过RT-PCR也扩增出DV2 NS3 整个基因，并发现提取DV的核酸(RNA)时必须经过两次变性裂解病毒。上述方法均存在操作繁琐、浪费大、耗时长等不足之处。本研究试采用小量病毒(DV2)培养上清(200 μL)提取DV2的核酸(RNA)，发现变性液(溶液D)的量如果远远多于(3倍)病毒培养上清的量，并尽量减少振荡，但必须充分混匀；这样提取出来的DV2的核酸(RNA)同样可通过RT-PCR扩增出大片段NS3基因。这不仅不需要浓缩病毒，而且实验时间大为缩短。因此我们认为病毒裂解是否完全以及能否保证RNA的长度是很重要的，至于病毒及RNA的量要多并非一定必要。由于登革病毒核酸RNA没有Poly A尾，因此，逆转录(RT)时采用的引物为特异的下游引物以合成所需的cDNA，同时，本研究发现用cDNA进行PCR扩增时，cDNA的容量以PCR扩增体积的1/10为宜。为了证实扩增出的1 978 bp片段是否是NS3基因，我们选用P2、P3进行了巢式PCR，结果扩增出预计的1 029 bp片段。这样，DV的NS3全基因扩增的成功，尤其是小量提取登革病毒核酸(RNA)扩增NS3全基因的成功为RT-PCR扩增大片段基因(1.5～2.0 kb)摸索出了一种简捷、实用的方法，也为NS3基因的克隆表达，深入了解NS3蛋白的基因结构及其生物学功能的研究，病原学诊断以及登革疫苗的研究奠定了基础。
, 百拇医药
参考文献
1.Hanh Y S, Galler R, Hunkapiller T, et al. Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses. Virology, 1988,162(1):167
2.Biedrzycka A, Cauchi M R, Bartholomeusz A, et al. Characterization of protease cleavage sites involved in the formation of the envelope glycoprotein and three nonstructural proteins of dengue virus type 2, New Guinea C strain. J Gen Virol, 1987,68(pt 5):1317
, http://www.100md.com
3.Wengler G, Wengler G. The NS3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. Virology, 1993,197(1):265
4.Arias C F, Preugschat F, Strauss J H, et al. Dengue 2 virus NS2B and NS3 form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain. Virology, 1993,193(2):888
5.Churdboonchart V, Bhamarapravati N, Peampramprecha S, et al. Antibodies against dengue viral protein in primary and secondary degue haeorrihagic fever. Am J Trop Hyp, 1991,44(5):481
, 百拇医药
6.Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987,162(1):156
7.于曼，秦鄂德，韩照中，等. 登革2型43株病毒包膜蛋白E基因的聚合酶链式反应扩增. 中华实验与临床微生物杂志，1995，9(2)：103
8.秦鄂德，于 曼，杨佩英，等. 我国登革病毒分离株NS1基因的扩增. 中华微生物学和免疫学杂志， 1994，14(2)：93
1998-09-07收稿
1999-01-02修回, 百拇医药
单位：晏辉钧 江丽芳 潘文彤 方丹云 陈元 郭辉玉(中山医科大学微生物学教研室； 广州， 510089)；李向群(湖北医科大学病毒研究所； 武汉， 430071)
关键词：登革病毒；遗传学；基因，病毒；新几内亚；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报/990307
摘要 目的：探索一种快速、实用的扩增登革病毒大片段基因的方法。方法：用登革2型新几内亚C株(DV2，NGC株)的核酸(RNA)为模板，研究了在不同条件下(病毒和其变性液的量以及cDNA的浓度等)通过逆转录-聚合酶链式反应技术扩增大片段NS3基因，并对扩增的目的基因用巢式PCR进行了鉴定。结果：用大量的或小量的登革病毒培养上清中提取RNA的方法在一定条件下均可扩增出大片段NS3基因。结论：小量登革病毒提取RNA扩增大片段NS3基因法较大量登革病毒提取RNA扩增大片段NS3基因快速、实用。
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中图号 R 373.33； Q75
Studying of the Method of Amplifying Large NS3
Gene Fragment of Dengue Virus
Yan Huijun1 Jiang Lifang1 Pan Wentong1 Li Xiangchun2
Fang Danyun1 Chen Yuan1 Guo Huiyu1
( 1 Department of Microbiology, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510089
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2 Institute of Virology, Hubei Medical University, Wuhan, 430071)
Abstract Objective:To find out a rapid and practical method of amplifying large NS3 gene fragment of dengue virus. Methods: The large NS3 gene fragment was amplified using ribonucleic acid(RNA) isolated from the New Guinea C(NGC) strain of dengue 2 virus (DV2) as template by RT-PCR in different amounts of virus. Nested-PCR was used to identify the amplified target gene. Results:The large NS3 gene fragment were amplified from RNAs extracted from large or small amount of DV2-infected culture supernates. Conclusion: The method amplifying large NS3 gene fragment from small amount of dengue virus is faster and more practical than that amplifying from large amount of dengue virus.
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Subject headings Dengue virus/genetics; Genes,viral; new guinea; polymerase chain reaction/methods
登革病毒属黄病毒属，主要通过蚊媒传播给人。登革病毒根据抗原性不同分为4型，即DV1、DV2、DV3、DV4。登革病毒是一种单股正链RNA病毒，它编码3种结构蛋白(C、Prm、E)和至少7种非结构蛋白(NS1～NS5)，其编码的顺序为5′-C-Prm(M)-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3′[1]。其中，DV2 NGC株NS3基因位于4 522～6 375 nt，编码相对分子质量为69 ku的NS3蛋白，NS3蛋白是一种多功能蛋白，现已证明有蛋白酶，三磷酸核苷酶(NTPase)，螺旋酶和RNA三磷酸酶等酶的活性[2～4]。同时还已发现NS3蛋白可刺激机体产生保护性的抗体[5]，也可被体内特异的CD+4或CD+8 T淋巴细胞识别。因此，NS3蛋白对登革病毒疫苗的研制和病原学的诊断方面具有重要的意义。而目前通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增大片段基因尚存在一定难度，本研究利用RT-PCR技术，探讨扩增大片段登革病毒基因的最佳条件，旨在为进一步研究登革病毒的基因结构和功能的关系打下基础。
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1 材料与方法
1.1 病毒株和细胞株
登革2型病毒NGC株和C6/36细胞均为本室保存。
1.2 病毒RNA的提取
1.2.1 大量提取病毒核酸(RNA)
DV2感染的细胞50%～75%出现病变后，取其培养上清200～300 mL,按文献[6]方法大量提取DV2的核酸(RNA)，最后沉淀(RNA)按每1 mL DV2上清加1 μL ddH2O(去RNA酶)溶解。
1.2.2 小量提取DV2核酸(RNA)
DV2感染的细胞50%～75%出现病变后，取其培养上清200 μL，加入3倍体积的溶液D[6]，再加1/10体积(相对于溶液D的体积)2 mol/L NaAc(pH 4.0)、等体积的水饱和酚和1/5体积氯仿/异戊醇(49/1)，轻轻颠倒混2～3 min，冰浴15 min，4 ℃下15 000 r/min离心5 min，上清加等体积的异丙醇，-20 ℃沉淀30 min以上，4 ℃下15 000 r/min离心15 min，沉淀用φ =70%乙醇洗1次，无水乙醇洗1次；真空抽干后，加DEPC处理过的ddH2O溶解沉淀(每管加5 μL ddH2O)。
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1.3 引物的合成
参考DV2 NGC株基因序列设计了如下3条引物，并在引物5′端引入酶切位点。引物由中科院上海细胞生物所合成。各引物的序列和核苷酸位置如下。
P1(正向，4 488～4 504 nt)： gcctg cag AGC ATG GTA CCT GTG GGA. P2(反向，6 453～6 435 nt):gc tct aga GTC CAG TGC GTC TCT TGC。 P3(正向，5 394～5 411 nt):gc AGC AAG TAT AGC GGC TAG(用于巢式PCR)。
1.4 逆转录反应
在20 μL的反应体积中加入10×RT buffer 2 μL、 25 mmol/L MgCl2 4 μL、10 mmol/L dNTP 2μL 、P2 1 μL(25 pmol)、RNase抑制剂0.5 μL(20 U)、AMV逆转录酶(Promega kit)1.8 μL(约16 U)、模板RNA(约2.0 μg)及ddH2O 8.7 μL；混匀后，室温放置10 min，然后置42 ℃反应1 h，接着95 ℃灭活 5 min,再立即冰浴，-20 ℃备用。
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1.5 PCR扩增DV2 NGC株NS3全长基因
取cDNA 5 μL加入50 μL的反应体积用P1和P2进行扩增，94 ℃ 5 min处理后，按94 ℃ 50 s、55 ℃ 40 s、72 ℃ 110 s在Hema 480基因扩增仪上进行30个循环扩增后，72 ℃下再延伸10 min，然后取样检查。
1.6 巢式PCR扩增NS3部分基因
取1 μL RT-PCR产物，用P2和P3按94 ℃ 40 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 70 s在Hema 480 基因扩增仪上进行30个循环扩增后，72 ℃下延伸 10 min，然后取样检查。
2 结果
用大量的或小量的登革2型病毒培养上清提取的核酸(RNA)为模板均扩增出大小约1 978 bp的特异条带，如图1，结果与预计值一致；用内引物(P3)与P2进行巢式PCR扩增出1 029 bp的特异条带，如图2，结果也与预计值一致。
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图1 RT-PCR产物
Fig.1 RT-PCR products
Lane l: 2 kb Marker Lane 2 and 3: RT-PCR product from large or small amount of DV2
图2 巢式PCR产物
Fig.2 Nested PCR products Lane M: λDNA/HindⅢ+EcoRⅠ Lane 1 and 2:Nested PCR product
3 讨论
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登革2型病毒NGC株基因组全长10 723 bp，NS3 基因核苷酸位置为4 522～6 375 nt。本研究根据DV2 NGC株基因核苷酸序列，设计出两条可扩增包括整个NS3基因片段的引物，且在各自的5′端引入了酶切位点。由于DV是单股正链RNA病毒，需用RT-PCR进行基因扩增。秦鄂德、于曼[7，8]等人用抗体吸附并通过PEG6000浓缩病毒后提取DV2 RNA，并扩增出DV2全长E及NS1基因，但其长度均短于NS3基因。本研究用PEG6000浓缩病毒后，提取DV2的核酸(RNA)，并通过RT-PCR也扩增出DV2 NS3 整个基因，并发现提取DV的核酸(RNA)时必须经过两次变性裂解病毒。上述方法均存在操作繁琐、浪费大、耗时长等不足之处。本研究试采用小量病毒(DV2)培养上清(200 μL)提取DV2的核酸(RNA)，发现变性液(溶液D)的量如果远远多于(3倍)病毒培养上清的量，并尽量减少振荡，但必须充分混匀；这样提取出来的DV2的核酸(RNA)同样可通过RT-PCR扩增出大片段NS3基因。这不仅不需要浓缩病毒，而且实验时间大为缩短。因此我们认为病毒裂解是否完全以及能否保证RNA的长度是很重要的，至于病毒及RNA的量要多并非一定必要。由于登革病毒核酸RNA没有Poly A尾，因此，逆转录(RT)时采用的引物为特异的下游引物以合成所需的cDNA，同时，本研究发现用cDNA进行PCR扩增时，cDNA的容量以PCR扩增体积的1/10为宜。为了证实扩增出的1 978 bp片段是否是NS3基因，我们选用P2、P3进行了巢式PCR，结果扩增出预计的1 029 bp片段。这样，DV的NS3全基因扩增的成功，尤其是小量提取登革病毒核酸(RNA)扩增NS3全基因的成功为RT-PCR扩增大片段基因(1.5～2.0 kb)摸索出了一种简捷、实用的方法，也为NS3基因的克隆表达，深入了解NS3蛋白的基因结构及其生物学功能的研究，病原学诊断以及登革疫苗的研究奠定了基础。
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参考文献
1.Hanh Y S, Galler R, Hunkapiller T, et al. Nucleotide sequence of dengue 2 RNA and comparison of the encoded proteins with those of other flaviviruses. Virology, 1988,162(1):167
2.Biedrzycka A, Cauchi M R, Bartholomeusz A, et al. Characterization of protease cleavage sites involved in the formation of the envelope glycoprotein and three nonstructural proteins of dengue virus type 2, New Guinea C strain. J Gen Virol, 1987,68(pt 5):1317
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3.Wengler G, Wengler G. The NS3 nonstructural protein of flaviviruses contains an RNA triphosphatase activity. Virology, 1993,197(1):265
4.Arias C F, Preugschat F, Strauss J H, et al. Dengue 2 virus NS2B and NS3 form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain. Virology, 1993,193(2):888
5.Churdboonchart V, Bhamarapravati N, Peampramprecha S, et al. Antibodies against dengue viral protein in primary and secondary degue haeorrihagic fever. Am J Trop Hyp, 1991,44(5):481
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6.Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 1987,162(1):156
7.于曼，秦鄂德，韩照中，等. 登革2型43株病毒包膜蛋白E基因的聚合酶链式反应扩增. 中华实验与临床微生物杂志，1995，9(2)：103
8.秦鄂德，于 曼，杨佩英，等. 我国登革病毒分离株NS1基因的扩增. 中华微生物学和免疫学杂志， 1994，14(2)：93
1998-09-07收稿
1999-01-02修回, 百拇医药