HBcAg 在乙型肝炎病毒携带者孕妇胎盘中的识别与意义
作者：刘颖琳 邝健全 刘新质 陈镆鎁
单位：中山医科大学附属孙逸仙纪念医院妇产科， 广东 广州 510120
关键词：肝炎核心抗原，乙型；肝炎病毒，乙型；疾病传播，垂直；胎盘；微生物学
中山医科大学学报000113
摘 要：目的 研究胎儿感染乙型肝炎病毒(HBV)与胎盘感染之间的关系及其意义。方法 用PCR 及斑点杂交法检测母血、新生儿静脉血 HBV DNA(确定胎儿感染者)，用免疫组化方法(LSAB法)检测61例HBV携带者母亲胎盘HBcAg。结果 ① 胎儿HBV感染率为22.92% (33/144); ② 61例胎盘HBcAg阳性率为68.85%(41/61)，胎儿感染组阳性率(82.14%)高于对照组(54.55%)，P<0.025； ③ 母血HBeAg/HBVDNA 阳性者，胎盘HBcAg阳性率(82.05%)高于母血HBeAg/HBVDNA阴性者(40.91%)，P<0.005； ④ 胎盘各种细胞成分中，以与母血直接接触的蜕膜细胞、末梢绒毛合体细胞及EVT(绒毛外滋养细胞)HBcAg阳性率较高(36.07%～49.18%)。结论 胎儿感染HBV与胎盘感染有关，胎盘屏障对HBV有一定阻挡作用。
, http://www.100md.com
分类号： R714.5；R373.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0043-04
The Expression of HBcAg in HBV Carrier Mothers' Placentas and
It's Significance
LIU Ying-lin
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
KUANG Jian-quan
, 百拇医药
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
LIU Xin-zhi
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
CHEN Mo-yie
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
Abstract：Objective To study the relationship between fetal infection and placental infection of HBV (Hepatitis B Virus).Method HBV DNA was detected in maternal and fetal peripheral blood by PCR and Southern-blot Hybridization. HBcAg was detected in 61 cases of HBV carrier mothers' placentas by immunocytochemistry (LSAB method). Result ① Fetal infection rate of HBV is 22.92%(33/144).② HBcAg positive incidence in carrier mothers' placentas was 68.85% (51/61).But the rate in fetal infection group (82.14%) was higher thanthat in control group (54.55%),P<0.025. ③ The placental HBcAg positive rate in mothers with HBeAg/HBV DNA+(82.05%) was higher than that in mothers with HBeAg-HBV DNA-(40.91%),P<0.005.④ The frequency of HBcAg positive syncytial cells which contact directly with mothers' blood was the highest among all other kinds of placental barrier cells. Conclusion The HBV was capable of infecting fetus by infecting the placental barrier. The placental barrier can considerably prevent the passage of HBV.
, 百拇医药
Key words：hepatitis B core antigens; hepatitis B virus; disease transmission,vertical; placenta/microbiology▲
对于乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的确切机制至今仍未阐明，而乙型肝炎病毒疫苗接种免疫失败者，往往是那些有胎儿期已通过胎盘感染了HBV的婴儿，因此，对HBV母胎传播的研究是一个重要的研究课题。本文试图通过检测乙型肝炎病毒携带者母亲胎盘中的HBcAg，说明胎盘感染HBV与胎儿感染HBV之间的关系。
1 材料与方法
1.1 一般资料
自1995年1月～1996年2月到我院产科门诊进行产前检查的孕妇1 583人次，常规检查乙肝3对，肝功3项(AST、ALT及AST/ALT)，发现HBsAg阳性者157人，阳性率为9.92%，其中以材料齐全的149名孕妇为研究对象：平均年龄28.04岁，孕龄40周。初产妇138例，经产妇11例；阴道分娩107例，剖宫产42例，平均产后出血量为233.79 mL；分娩新生儿共152例(3名孕妇分娩双胎)均成活，男性71例，女性81例，平均出生体重3.21 kg，身长49.29 cm。出生1 min Apgar 评分<4分2例(1.32%)，4～7分13例(8.55%)，8～10分137例(90.13%)。
, 百拇医药
同期分娩的孕妇中随机抽出10例HBV标志物阴性的产妇作为阴性对照。上述孕妇临产后均抽取静脉血检测HBV DNA。新生儿出生后抽取脐血或24 h静脉血，检测HBV DNA(脐血结果阳性者须复查静脉血才能确诊为宫内感染)。
1.2 取材与分组
在证实为宫内感染的33例孕妇中，有28例留取了胎盘标本，作为胎儿感染组(fetal infection group)；在新生儿脐血或静脉血HBV DNA、HBV标志物均阴性的携带者孕妇中，随机选择33例作为对照组(control group)。上述两组孕妇年龄(maternal age )、孕周(gestational duration)，以及胎膜早破(PMRM：premature rupture of membranes)、孕高症(PIH-syndrom:pregnancy-induced hypertension syndrom)、早产 (preterm birth)、过期妊娠(postdatism)、高龄初产(elderly primiparity)等妊娠合并症发生率等比较均无显著性差异(表1)。
, 百拇医药
表1 胎儿感染组与对照组临床资料对比
Table 1 Comparison of the clinical data between fetal infection group and control group1)
[n(%),
±s] Clinical data
Fetal-infection group
n=28
Control group
n=33
Maternal age(y)
, 百拇医药
28.00±3.42
29.50±3.86
Gestational duration(wk)
39.71±1.57
39.57±1.57
PMRM
9(32.14)
6(18.18)
PIH syndrom
5(17.86)
4(12.12)
, http://www.100md.com
Preterm birth
2(7.14)
2(6.06)
Postdatism
1(3.57)
1(3.03)
Elderly primiparity
2(7.14)
3(9.09)
1) P>0.10
上述两组孕妇(共61例)胎盘娩出后测量其大小、重量、脐长，马上置于10%中性福尔马林液中固定，于胎盘中央处取材，包括胎盘各层，常规石蜡包埋，切片(切片厚5 μm)，作免疫组化检查。
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1.3 方法
1.3.1 血清HBV DNA 同一份标本分别用PCR及斑点杂交法检测，药盒分别由中山医科大学附属中山三院传染科及上海医科大学源力试剂公司提供，PCR扩增仪由美国MJ公司提供，操作步骤按药盒说明书进行。
1.3.2 血清HBV抗原 用ELISA法检测，药盒由深圳月亮湾工程有限公司提供，操作步聚按药盒说明书进行。
1.3.3 胎盘组织HBcAg 用免疫组化的方法——LSAB法[1]检测。主要试剂：一抗及LSAB药盒均由Dako公司提供，一抗工作浓度为1∶200。每批实验均设阳性及阴性对照：阳性对照标本为已证实HBV感染，且HBcAg显色良好的同1例肝癌标本的连续切片；阴性对照标本选在同期分娩、HBV标志物阴性，且母儿血HBV DNA均阴性的正常孕妇的胎盘组织。
阳性细胞的判断：细胞结构清楚，细胞浆内有明显的棕褐色颗粒显示，阳性细胞与背景对比清晰，背景结构清楚，不显色。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 孕妇血HBeAg和/或HBV DNA阳性与胎儿感染HBV的关系
152例新生儿中，符合胎儿宫内感染HBV标准者33例，另有8例新生儿出生时脐血HBsAg或 HBV DNA虽呈阳性，但未复查外周静脉血，因而未能确定是否宫内感染者，予以删除，因此胎儿HBV宫内感染率为22.92%(33/144)。从表2中可见，母亲HBeAg或HBV DNA阳性者，胎儿宫内感染率远高于HBeAg或HBV DNA阴性者，HBV DNA阴性母亲无1例胎儿宫内感染HBV。
表2 胎儿感染HBV与母血HBeAg及HBV DNA的关系
Table 2 The relationship of fetal infection and HBeAg or HBV DNA Positive in mother′s blood
, http://www.100md.com
n(%) HBVM/HBV DNA
in mothers's blood
Total case num-
ber of fetus
Fetal
infection
X2
P
HBeAg+
461)
31 (67.39)
, 百拇医药
75.88
<0.001
HBeAg-
98
2 (2.04)
HBV DNA+
571)
33 (57.89)
65.34
<0.001
HBV DNA-
87
, 百拇医药
0 (0)
1) One case mother with HBeAg+/HBV DNA+delivered twin2.2 HBV胎儿感染与胎盘感染的关系
61例HBsAg阳性携带者胎盘中，发现HBcAg阳性细胞共41例，阳性率为68.85%。HBsAg阳性细胞分散或簇状分布，阳性颗粒弥漫分布于胞浆内，未见明显的胞核着色。在该41例胎盘感染HBV的病例中，23例(56.10%)证实为胎儿感染。
胎儿感染组胎盘细胞HBcAg阳性率为82.14%(23/28)，高于对照组的54.55%(18/33)，差异有显著性(P<0.025)。表3显示在胎盘各种细胞成分中比较两组HBcAg阳性率，从表中可见，仅有羊膜细胞的阳性率有差异，胎儿感染组显著高于对照组，其余细胞成分则无显著性差异。
表3 胎儿感染组与对照组胎盘组织细胞HBcAg总的阳性率及各种细胞成分阳性率的比较
, 百拇医药
Table 3 Comparison HBcAg Positive rate in placental tissue between the two groups and among various cellular type
n(%) Cellular type with
HBcAg positive
Fetal infection group
Control group
P
(n=28)
(n=33)
Decidual cell
, 百拇医药
14
(50.00)
16
(48.48)
>0.10
EVT
13
(46.43)
9
(27.27)
>0.10
Syncytial cell
17
, 百拇医药
(60.71)
13
(39.39)
>0.05
Basal membrance
6
(21.43)
6
(18.18)
>0.10
Interstitial cell
3
, 百拇医药
(10.71)
7
(21.21)
>0.10
Endothelia of villous vessel
10
(35.71)
6
(18.18)
>0.10
Amnionic epithelia
9
, 百拇医药
(32.14)
2
(6.06)
<0.10
2.3 孕妇血HBeAg和/或HBV DNA阳性与胎盘感染HBV的关系
在61例HBsAg阳性携带者孕妇中，血HBeAg或HBV DNA阳性者39例，HBeAg和HBV DNA均阴性22例。两组胎盘HBcAg阳性率及在各层细胞分布阳性率对比见表4，从表中可见孕妇血HBeAg或HBV DNA阳性者中，82.05%胎盘有HBcAg阳性细胞，而两者均阴性者中仅40.91%胎盘有阳性细胞，两组差异有显著性，显示胎盘感染与母血中HBV感染程度有关。而胎盘蜕膜细胞及绒毛合体细胞HBcAg阳性率与母血HBeAg和HBV DNA有关，母血HBeAg或 HBV DNA阳性者，这两种细胞HBcAg阳性率远高于母血HBeAg及HBV DNA均阴性者。
, 百拇医药
表4 孕妇血HBeAg或HBV DNA阳性与胎盘组织细胞HBcAg阳性的关系及其在各种细胞成分中的分析
Table 4 Analysis the relationship between mothers with HBeAg or HBV DNA positive rate and the rate of placentas with
n(%) Type of HBcAg
positive cell
HBeAg+或HBV DNA+
HBeAg-/HBV DNA-
P
(n=39)
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(n=22)
Total cell
32
(82.05)
9
(40.91)
<0.005
Decidual cell
24
(61.54)
6
(27.27)
, 百拇医药 <0.01
EVT
17
(43.59)
5
(22.73)
>0.05
Syncytial cell
24
(61.54)
6
(27.27)
<0.01
, 百拇医药
Basal membrance
10
(25.64)
2
(9.09)
>0.10
Interstitial cell
7
(17.95)
3
(13.64)
>0.10
, 百拇医药
Endothelia of villous vessel
13
(33.33)
3
(13.64)
>0.05
Amnionic epithelia
10
(25.64)
1
(4.55)
>0.05
, 百拇医药
1)(+)positive, (-)negative2.4 HBcAg阳性细胞在胎盘组织各种细胞成分中的分布
从表5可见，在胎盘的各种细胞成分中，以蜕膜细胞(Decidual cell)、EVT (Extravillous traphoblast，绒毛外滋养细胞)、末梢绒毛合体细胞(Syncytial cell)的HBcAg阳性细胞发现率较高(36.07%～49.18%)，高于胎盘屏障的其他细胞成分：细胞基底膜(Basal membrance)、绒毛间质细胞(Interstitial cell)绒毛血管内皮细胞(Endothelia of villous vessel)，亦高于羊膜上皮细胞(Amnionic epithelia)(16.39%～26.23%)，差异有显著性(P<0.01)。
表5 HBcAg阳性细胞在胎盘组织细胞中的分布及阳性率的比较
, 百拇医药 Table 5 Distribution of HBcAg positive cells in placental tissue and comparing the positive rate
case=61,n(%) Type of HBcAg positive cell
n
(positive rate)
P
Decidual cell
30
(49.18)
>0.10
EVT
, 百拇医药
22
(36.07)
>0.10
Syncytial cell
30
(49.18)
<0.01
Endothelium
16
(26.23)
>0.10
Interstitial cell
, http://www.100md.com
10
(16.39)
>0.10
Basal membrance
12
(19.67)
>0.10
Amnionic epithelium
11
(18.03)
3 讨 论
3.1 母血HBeAg或HBV DNA阳性是胎儿感染的高危因素
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在本研究中发现，144例HBsAg阳性携带者母亲所生新生儿中，胎儿感染率为22.92%。在母亲为HBeAg或HBV DNA阳性新生儿中，胎儿感染率远高于母亲为HBeAg或HBV DNA阴性者，可见，母血HBeAg或HBV DNA阳性者，胎儿更容易感染HBV。HBeAg阴性者有2.04%发生胎儿感染，因此HBeAg阴性，但HBV DNA阳性母亲仍具有一定的感染力，对这些母亲新生儿仍需注意监测，但HBV DNA阴性者无1例发生胎儿感染，因而HBV DNA阴性的母亲，无论HBeAg阳性与否，均无发生宫内感染，与钟玲的研究结果一致[2]。
3.2 胎盘感染与胎儿感染的关系
在61例胎盘中，发现HBcAg阳性细胞的机率为68.85%，细胞类型包括胎盘屏障中的各层细胞，与以往的报道类似[3，4]，说明HBV不仅可感染胎盘，在其中复制，且有HBcAg的表达。
, 百拇医药
3.2.1 胎盘感染与母血的感染程度有关 在母亲为HBeAg或HBV DNA阳性者中，胎盘HBcAg阳性率远高于HBeAg及HBV DNA阴性者，差异有显著性(P<0.005)，显示胎盘感染与母血HBV感染程度有关，而且母体成分的蜕膜细胞、与母血直接接触的末梢绒毛合体细胞感染率也与母血HBV感染程度有关，或者说，母亲血感染程度越高，越容易使胎盘感染。
3.2.2 胎儿感染与胎盘感染有关 本文结果显示，胎儿感染组胎盘组织细胞HBcAg阳性率(82.14%)远高于对照组(54.55%)，差异显著，提示胎盘感染HBV与胎儿感染有关，母亲胎盘感染了HBV，其胎儿更易获得感染，这与本人以往的研究结果相同[5]。本研究还发现，在胎儿感染组中羊膜上皮细胞的HBcAg阳性率显著高于对照组，显示母亲胎盘羊膜上皮细胞受HBV感杂者，其胎儿更易受感染，羊膜上皮细胞受HBV感染也是胎儿宫内感染的另一重要有关因素。
3.3 胎盘屏障对胎儿有一定的保护作用。
, 百拇医药
本研究结果可见，41例胎盘感染的病例中，只有56.10%发现胎儿感染，有18例携带者母亲胎盘HBcAg阳性，但其胎儿并没受HBV感染，说明胎盘受HBV感染后，并非必然会使胎儿感染，胎盘在一定程度上对胎儿有保护作用。此外，在胎盘屏障中，与母血直接接触的末梢绒毛合体细胞HBcAg阳性率最高(49.18%)，而胎儿侧的胎盘屏障其他细胞成分(细胞基底膜、绒毛间质细胞、绒毛血管内皮细胞)的阳性率(16.39%～26.23%)则较低，其HBcAg阳性率在胎盘屏障中呈现从母体侧到胎儿逐渐减弱的趋势，提示HBV可能通过逐渐感染胎盘屏障而感染胎儿。
3.4 导致胎儿感染的其他可能因素
有关胎儿感染HBV的具体机理仍未有一致的认识，有人[6]认为与胎盘渗漏有关，但也有学者[7]反对，也有报道HBV垂直感染与遗传等有关[8]。本文结果显示，胎儿感染组中胎盘细胞阴性率为17.86%(5/28)，因而未排除其他因素的存在。■
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基金项目：孙逸仙纪念医院科研基金资助课题
作者简介：刘颖琳(1965-)，女，广东台山人，讲师，临床博士.
参考文献：
[1]梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色[1]法——LSAB法[J].中华病理杂志，1993，22(6)：369.
[2]钟 玲，漆洪波，胡丽娜，等.应用聚合酶链反应技术监测乙型肝炎病毒的子宫内传播[J].中华妇产科杂志，1995，30(9)：553.
[3]杨淑青，彭文伟，姚集鲁，等.胎儿乙型肝炎病毒感染的研究——胎盘组织HBV DNA、HBcAg的检测及其意义[J].中山医科大学学报，1990，11(2)：23.
[4]Giovanna L,Fabio M, Santina C, et al. HBcAg identification in the placental cytotypes of symptom-free HBsAg-carrier mothers:A study with the immunoperoxidase method[J].Am J Obstet Gynecol,1990,163(1):235.
, 百拇医药
[5]刘颖琳，邝健全，刘新质，等.乙型肝炎病毒携带者母亲胎盘中HBsAg的表达及意义[J].中华围产医学杂志，1998，1(2)：116.
[6]Ghendon Y. Perinatal transmission of Hepatitis B virus in high incidence countries [J]. J Virol Method,1987,17(1):69.
[7]唐时幸，于光烈，程绍尧. 乙肝病毒宫内感染机制及影响因素的研究[J].中华妇产科杂志，1991，12(6)：325.
[8]Ghendon Y. Perinatal transmission of hepatitis B virus in high incidence countries[J].J Virol Method 1987,17(1):69.
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药
单位：中山医科大学附属孙逸仙纪念医院妇产科， 广东 广州 510120
关键词：肝炎核心抗原，乙型；肝炎病毒，乙型；疾病传播，垂直；胎盘；微生物学
中山医科大学学报000113
摘 要：目的 研究胎儿感染乙型肝炎病毒(HBV)与胎盘感染之间的关系及其意义。方法 用PCR 及斑点杂交法检测母血、新生儿静脉血 HBV DNA(确定胎儿感染者)，用免疫组化方法(LSAB法)检测61例HBV携带者母亲胎盘HBcAg。结果 ① 胎儿HBV感染率为22.92% (33/144); ② 61例胎盘HBcAg阳性率为68.85%(41/61)，胎儿感染组阳性率(82.14%)高于对照组(54.55%)，P<0.025； ③ 母血HBeAg/HBVDNA 阳性者，胎盘HBcAg阳性率(82.05%)高于母血HBeAg/HBVDNA阴性者(40.91%)，P<0.005； ④ 胎盘各种细胞成分中，以与母血直接接触的蜕膜细胞、末梢绒毛合体细胞及EVT(绒毛外滋养细胞)HBcAg阳性率较高(36.07%～49.18%)。结论 胎儿感染HBV与胎盘感染有关，胎盘屏障对HBV有一定阻挡作用。
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分类号： R714.5；R373.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0043-04
The Expression of HBcAg in HBV Carrier Mothers' Placentas and
It's Significance
LIU Ying-lin
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
KUANG Jian-quan
, 百拇医药
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
LIU Xin-zhi
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
CHEN Mo-yie
(Department of Obstetric and Gynecology,Sun Yat-sen Memorial Hospital, Guangzhou, 510120,China)
Abstract：Objective To study the relationship between fetal infection and placental infection of HBV (Hepatitis B Virus).Method HBV DNA was detected in maternal and fetal peripheral blood by PCR and Southern-blot Hybridization. HBcAg was detected in 61 cases of HBV carrier mothers' placentas by immunocytochemistry (LSAB method). Result ① Fetal infection rate of HBV is 22.92%(33/144).② HBcAg positive incidence in carrier mothers' placentas was 68.85% (51/61).But the rate in fetal infection group (82.14%) was higher thanthat in control group (54.55%),P<0.025. ③ The placental HBcAg positive rate in mothers with HBeAg/HBV DNA+(82.05%) was higher than that in mothers with HBeAg-HBV DNA-(40.91%),P<0.005.④ The frequency of HBcAg positive syncytial cells which contact directly with mothers' blood was the highest among all other kinds of placental barrier cells. Conclusion The HBV was capable of infecting fetus by infecting the placental barrier. The placental barrier can considerably prevent the passage of HBV.
, 百拇医药
Key words：hepatitis B core antigens; hepatitis B virus; disease transmission,vertical; placenta/microbiology▲
对于乙型肝炎病毒(HBV)宫内感染的确切机制至今仍未阐明，而乙型肝炎病毒疫苗接种免疫失败者，往往是那些有胎儿期已通过胎盘感染了HBV的婴儿，因此，对HBV母胎传播的研究是一个重要的研究课题。本文试图通过检测乙型肝炎病毒携带者母亲胎盘中的HBcAg，说明胎盘感染HBV与胎儿感染HBV之间的关系。
1 材料与方法
1.1 一般资料
自1995年1月～1996年2月到我院产科门诊进行产前检查的孕妇1 583人次，常规检查乙肝3对，肝功3项(AST、ALT及AST/ALT)，发现HBsAg阳性者157人，阳性率为9.92%，其中以材料齐全的149名孕妇为研究对象：平均年龄28.04岁，孕龄40周。初产妇138例，经产妇11例；阴道分娩107例，剖宫产42例，平均产后出血量为233.79 mL；分娩新生儿共152例(3名孕妇分娩双胎)均成活，男性71例，女性81例，平均出生体重3.21 kg，身长49.29 cm。出生1 min Apgar 评分<4分2例(1.32%)，4～7分13例(8.55%)，8～10分137例(90.13%)。
, 百拇医药
同期分娩的孕妇中随机抽出10例HBV标志物阴性的产妇作为阴性对照。上述孕妇临产后均抽取静脉血检测HBV DNA。新生儿出生后抽取脐血或24 h静脉血，检测HBV DNA(脐血结果阳性者须复查静脉血才能确诊为宫内感染)。
1.2 取材与分组
在证实为宫内感染的33例孕妇中，有28例留取了胎盘标本，作为胎儿感染组(fetal infection group)；在新生儿脐血或静脉血HBV DNA、HBV标志物均阴性的携带者孕妇中，随机选择33例作为对照组(control group)。上述两组孕妇年龄(maternal age )、孕周(gestational duration)，以及胎膜早破(PMRM：premature rupture of membranes)、孕高症(PIH-syndrom:pregnancy-induced hypertension syndrom)、早产 (preterm birth)、过期妊娠(postdatism)、高龄初产(elderly primiparity)等妊娠合并症发生率等比较均无显著性差异(表1)。
, 百拇医药
表1 胎儿感染组与对照组临床资料对比
Table 1 Comparison of the clinical data between fetal infection group and control group1)
[n(%),
±s] Clinical dataFetal-infection group
n=28
Control group
n=33
Maternal age(y)
, 百拇医药
28.00±3.42
29.50±3.86
Gestational duration(wk)
39.71±1.57
39.57±1.57
PMRM
9(32.14)
6(18.18)
PIH syndrom
5(17.86)
4(12.12)
, http://www.100md.com
Preterm birth
2(7.14)
2(6.06)
Postdatism
1(3.57)
1(3.03)
Elderly primiparity
2(7.14)
3(9.09)
1) P>0.10
上述两组孕妇(共61例)胎盘娩出后测量其大小、重量、脐长，马上置于10%中性福尔马林液中固定，于胎盘中央处取材，包括胎盘各层，常规石蜡包埋，切片(切片厚5 μm)，作免疫组化检查。
, http://www.100md.com
1.3 方法
1.3.1 血清HBV DNA 同一份标本分别用PCR及斑点杂交法检测，药盒分别由中山医科大学附属中山三院传染科及上海医科大学源力试剂公司提供，PCR扩增仪由美国MJ公司提供，操作步骤按药盒说明书进行。
1.3.2 血清HBV抗原 用ELISA法检测，药盒由深圳月亮湾工程有限公司提供，操作步聚按药盒说明书进行。
1.3.3 胎盘组织HBcAg 用免疫组化的方法——LSAB法[1]检测。主要试剂：一抗及LSAB药盒均由Dako公司提供，一抗工作浓度为1∶200。每批实验均设阳性及阴性对照：阳性对照标本为已证实HBV感染，且HBcAg显色良好的同1例肝癌标本的连续切片；阴性对照标本选在同期分娩、HBV标志物阴性，且母儿血HBV DNA均阴性的正常孕妇的胎盘组织。
阳性细胞的判断：细胞结构清楚，细胞浆内有明显的棕褐色颗粒显示，阳性细胞与背景对比清晰，背景结构清楚，不显色。
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2 结 果
2.1 孕妇血HBeAg和/或HBV DNA阳性与胎儿感染HBV的关系
152例新生儿中，符合胎儿宫内感染HBV标准者33例，另有8例新生儿出生时脐血HBsAg或 HBV DNA虽呈阳性，但未复查外周静脉血，因而未能确定是否宫内感染者，予以删除，因此胎儿HBV宫内感染率为22.92%(33/144)。从表2中可见，母亲HBeAg或HBV DNA阳性者，胎儿宫内感染率远高于HBeAg或HBV DNA阴性者，HBV DNA阴性母亲无1例胎儿宫内感染HBV。
表2 胎儿感染HBV与母血HBeAg及HBV DNA的关系
Table 2 The relationship of fetal infection and HBeAg or HBV DNA Positive in mother′s blood
, http://www.100md.com
n(%) HBVM/HBV DNA
in mothers's blood
Total case num-
ber of fetus
Fetal
infection
X2
P
HBeAg+
461)
31 (67.39)
, 百拇医药
75.88
<0.001
HBeAg-
98
2 (2.04)
HBV DNA+
571)
33 (57.89)
65.34
<0.001
HBV DNA-
87
, 百拇医药
0 (0)
1) One case mother with HBeAg+/HBV DNA+delivered twin2.2 HBV胎儿感染与胎盘感染的关系
61例HBsAg阳性携带者胎盘中，发现HBcAg阳性细胞共41例，阳性率为68.85%。HBsAg阳性细胞分散或簇状分布，阳性颗粒弥漫分布于胞浆内，未见明显的胞核着色。在该41例胎盘感染HBV的病例中，23例(56.10%)证实为胎儿感染。
胎儿感染组胎盘细胞HBcAg阳性率为82.14%(23/28)，高于对照组的54.55%(18/33)，差异有显著性(P<0.025)。表3显示在胎盘各种细胞成分中比较两组HBcAg阳性率，从表中可见，仅有羊膜细胞的阳性率有差异，胎儿感染组显著高于对照组，其余细胞成分则无显著性差异。
表3 胎儿感染组与对照组胎盘组织细胞HBcAg总的阳性率及各种细胞成分阳性率的比较
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Table 3 Comparison HBcAg Positive rate in placental tissue between the two groups and among various cellular type
n(%) Cellular type with
HBcAg positive
Fetal infection group
Control group
P
(n=28)
(n=33)
Decidual cell
, 百拇医药
14
(50.00)
16
(48.48)
>0.10
EVT
13
(46.43)
9
(27.27)
>0.10
Syncytial cell
17
, 百拇医药
(60.71)
13
(39.39)
>0.05
Basal membrance
6
(21.43)
6
(18.18)
>0.10
Interstitial cell
3
, 百拇医药
(10.71)
7
(21.21)
>0.10
Endothelia of villous vessel
10
(35.71)
6
(18.18)
>0.10
Amnionic epithelia
9
, 百拇医药
(32.14)
2
(6.06)
<0.10
2.3 孕妇血HBeAg和/或HBV DNA阳性与胎盘感染HBV的关系
在61例HBsAg阳性携带者孕妇中，血HBeAg或HBV DNA阳性者39例，HBeAg和HBV DNA均阴性22例。两组胎盘HBcAg阳性率及在各层细胞分布阳性率对比见表4，从表中可见孕妇血HBeAg或HBV DNA阳性者中，82.05%胎盘有HBcAg阳性细胞，而两者均阴性者中仅40.91%胎盘有阳性细胞，两组差异有显著性，显示胎盘感染与母血中HBV感染程度有关。而胎盘蜕膜细胞及绒毛合体细胞HBcAg阳性率与母血HBeAg和HBV DNA有关，母血HBeAg或 HBV DNA阳性者，这两种细胞HBcAg阳性率远高于母血HBeAg及HBV DNA均阴性者。
, 百拇医药
表4 孕妇血HBeAg或HBV DNA阳性与胎盘组织细胞HBcAg阳性的关系及其在各种细胞成分中的分析
Table 4 Analysis the relationship between mothers with HBeAg or HBV DNA positive rate and the rate of placentas with
n(%) Type of HBcAg
positive cell
HBeAg+或HBV DNA+
HBeAg-/HBV DNA-
P
(n=39)
, http://www.100md.com
(n=22)
Total cell
32
(82.05)
9
(40.91)
<0.005
Decidual cell
24
(61.54)
6
(27.27)
, 百拇医药 <0.01
EVT
17
(43.59)
5
(22.73)
>0.05
Syncytial cell
24
(61.54)
6
(27.27)
<0.01
, 百拇医药
Basal membrance
10
(25.64)
2
(9.09)
>0.10
Interstitial cell
7
(17.95)
3
(13.64)
>0.10
, 百拇医药
Endothelia of villous vessel
13
(33.33)
3
(13.64)
>0.05
Amnionic epithelia
10
(25.64)
1
(4.55)
>0.05
, 百拇医药
1)(+)positive, (-)negative2.4 HBcAg阳性细胞在胎盘组织各种细胞成分中的分布
从表5可见，在胎盘的各种细胞成分中，以蜕膜细胞(Decidual cell)、EVT (Extravillous traphoblast，绒毛外滋养细胞)、末梢绒毛合体细胞(Syncytial cell)的HBcAg阳性细胞发现率较高(36.07%～49.18%)，高于胎盘屏障的其他细胞成分：细胞基底膜(Basal membrance)、绒毛间质细胞(Interstitial cell)绒毛血管内皮细胞(Endothelia of villous vessel)，亦高于羊膜上皮细胞(Amnionic epithelia)(16.39%～26.23%)，差异有显著性(P<0.01)。
表5 HBcAg阳性细胞在胎盘组织细胞中的分布及阳性率的比较
, 百拇医药 Table 5 Distribution of HBcAg positive cells in placental tissue and comparing the positive rate
case=61,n(%) Type of HBcAg positive cell
n
(positive rate)
P
Decidual cell
30
(49.18)
>0.10
EVT
, 百拇医药
22
(36.07)
>0.10
Syncytial cell
30
(49.18)
<0.01
Endothelium
16
(26.23)
>0.10
Interstitial cell
, http://www.100md.com
10
(16.39)
>0.10
Basal membrance
12
(19.67)
>0.10
Amnionic epithelium
11
(18.03)
3 讨 论
3.1 母血HBeAg或HBV DNA阳性是胎儿感染的高危因素
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在本研究中发现，144例HBsAg阳性携带者母亲所生新生儿中，胎儿感染率为22.92%。在母亲为HBeAg或HBV DNA阳性新生儿中，胎儿感染率远高于母亲为HBeAg或HBV DNA阴性者，可见，母血HBeAg或HBV DNA阳性者，胎儿更容易感染HBV。HBeAg阴性者有2.04%发生胎儿感染，因此HBeAg阴性，但HBV DNA阳性母亲仍具有一定的感染力，对这些母亲新生儿仍需注意监测，但HBV DNA阴性者无1例发生胎儿感染，因而HBV DNA阴性的母亲，无论HBeAg阳性与否，均无发生宫内感染，与钟玲的研究结果一致[2]。
3.2 胎盘感染与胎儿感染的关系
在61例胎盘中，发现HBcAg阳性细胞的机率为68.85%，细胞类型包括胎盘屏障中的各层细胞，与以往的报道类似[3，4]，说明HBV不仅可感染胎盘，在其中复制，且有HBcAg的表达。
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3.2.1 胎盘感染与母血的感染程度有关 在母亲为HBeAg或HBV DNA阳性者中，胎盘HBcAg阳性率远高于HBeAg及HBV DNA阴性者，差异有显著性(P<0.005)，显示胎盘感染与母血HBV感染程度有关，而且母体成分的蜕膜细胞、与母血直接接触的末梢绒毛合体细胞感染率也与母血HBV感染程度有关，或者说，母亲血感染程度越高，越容易使胎盘感染。
3.2.2 胎儿感染与胎盘感染有关 本文结果显示，胎儿感染组胎盘组织细胞HBcAg阳性率(82.14%)远高于对照组(54.55%)，差异显著，提示胎盘感染HBV与胎儿感染有关，母亲胎盘感染了HBV，其胎儿更易获得感染，这与本人以往的研究结果相同[5]。本研究还发现，在胎儿感染组中羊膜上皮细胞的HBcAg阳性率显著高于对照组，显示母亲胎盘羊膜上皮细胞受HBV感杂者，其胎儿更易受感染，羊膜上皮细胞受HBV感染也是胎儿宫内感染的另一重要有关因素。
3.3 胎盘屏障对胎儿有一定的保护作用。
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本研究结果可见，41例胎盘感染的病例中，只有56.10%发现胎儿感染，有18例携带者母亲胎盘HBcAg阳性，但其胎儿并没受HBV感染，说明胎盘受HBV感染后，并非必然会使胎儿感染，胎盘在一定程度上对胎儿有保护作用。此外，在胎盘屏障中，与母血直接接触的末梢绒毛合体细胞HBcAg阳性率最高(49.18%)，而胎儿侧的胎盘屏障其他细胞成分(细胞基底膜、绒毛间质细胞、绒毛血管内皮细胞)的阳性率(16.39%～26.23%)则较低，其HBcAg阳性率在胎盘屏障中呈现从母体侧到胎儿逐渐减弱的趋势，提示HBV可能通过逐渐感染胎盘屏障而感染胎儿。
3.4 导致胎儿感染的其他可能因素
有关胎儿感染HBV的具体机理仍未有一致的认识，有人[6]认为与胎盘渗漏有关，但也有学者[7]反对，也有报道HBV垂直感染与遗传等有关[8]。本文结果显示，胎儿感染组中胎盘细胞阴性率为17.86%(5/28)，因而未排除其他因素的存在。■
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基金项目：孙逸仙纪念医院科研基金资助课题
作者简介：刘颖琳(1965-)，女，广东台山人，讲师，临床博士.
参考文献：
[1]梁英杰，凌启波.一种快速高敏感的免疫组织化学染色[1]法——LSAB法[J].中华病理杂志，1993，22(6)：369.
[2]钟 玲，漆洪波，胡丽娜，等.应用聚合酶链反应技术监测乙型肝炎病毒的子宫内传播[J].中华妇产科杂志，1995，30(9)：553.
[3]杨淑青，彭文伟，姚集鲁，等.胎儿乙型肝炎病毒感染的研究——胎盘组织HBV DNA、HBcAg的检测及其意义[J].中山医科大学学报，1990，11(2)：23.
[4]Giovanna L,Fabio M, Santina C, et al. HBcAg identification in the placental cytotypes of symptom-free HBsAg-carrier mothers:A study with the immunoperoxidase method[J].Am J Obstet Gynecol,1990,163(1):235.
, 百拇医药
[5]刘颖琳，邝健全，刘新质，等.乙型肝炎病毒携带者母亲胎盘中HBsAg的表达及意义[J].中华围产医学杂志，1998，1(2)：116.
[6]Ghendon Y. Perinatal transmission of Hepatitis B virus in high incidence countries [J]. J Virol Method,1987,17(1):69.
[7]唐时幸，于光烈，程绍尧. 乙肝病毒宫内感染机制及影响因素的研究[J].中华妇产科杂志，1991，12(6)：325.
[8]Ghendon Y. Perinatal transmission of hepatitis B virus in high incidence countries[J].J Virol Method 1987,17(1):69.
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药