慢性乙型肝炎病情再活动时血清HBV DNA水平的变化
作者：周小辉 高志良 姚集鲁
单位：周小辉(汕头大学医学院第二附属医院传染科， 广东 汕头 10031)；高志良 姚集鲁(中山医科大学附属第三医院传染科，广东 广州 510630)
关键词：肝炎，乙型；复发；DNA复制；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报000111
摘 要：目的 研究慢性乙型肝炎患者HBV复制水平与病情活动关系。方法 采用荧光标记定量PCR的方法，测定一组急性发作的慢性乙型肝炎患者(其中HBeAg阳性组38例，抗HBe阳性组22例)病情活动期和恢复期的血清HBV DNA含量。结果 血清HBV DNA含量在活动期明显高于恢复期(P<0.05)。血清HBV DNA含量与丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BLLI)之间无相关性。结论 HBV DNA复制水平与慢性乙型肝炎的活动密切相关。
, 百拇医药
分类号：R 512，62； R 373.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0037-03
Changes of Serum HBV DNA level of Disease Reactivations
in Patients with Chronic Hepatitis B
ZHOU Xiao-hui
(Department of Infectious Diseases, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou, 510031)
GAO Zhi-liang
, 百拇医药
(Department of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630， China)
YAO Ji-lu
(Department of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630， China)
Abstract：Objective We study the changes of HBV DNA serum level in acute hepatic exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients. Methods The serum HBV DNA concentration in 60 patients with acute exacerbation (AE) of chronic hepatitis B were tested by the quantitative PCR using the AmpliSensor assay. Results In 60 patients with CHB (38 HBeAg-positive and 22 anti-HBe-positive), levers of the serum HBV DNA in sera were higher during acute attacks than the one during recovery (P<0.05)； No correlation were found among the levels of HBV DNA, alanine aminotransferase(ALT)， aspartate aminotransferase (AST) and total bilirubin. Conclusions This investigation revealed there was significant correlation between the increasing levels of serum HBV DNA and the reactivations of patients in chronic hepatitis B. The increases in viral replication and subsequent host immune response to virus-infected hepatocytes play an important role in initiating reactivation of patients with CHB.
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Key words：hepatitis B/ relapse; DNA replication; PCR/method▲
在慢性乙型肝炎的自然病程中，病情常反复活动。病情再活动是慢性乙型肝炎病史中常见和重要的特征。既往对慢性乙型肝炎患者的血清和生化学等研究揭示了HBV复制与病情再活动之间的密切关系[1～2]，HBV DNA是乙型肝炎病毒复制最可靠的指标。本研究采用荧光标记(AmpliSensor)方法，测定一组急性自发性发作的慢性乙型肝炎患者病情活动时和恢复期的血清HBV DNA含量，以了解HBV复制水平与病情活动的关系。为进一步研究慢性乙型肝炎反复活动的机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 病例选择
全部病例来自中山三院传染科住院病区和门诊，共60例。其中男性45例，女性15例，平均年龄(32.2±8.6)岁(17～62岁)。按照1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议——病毒性肝炎防治方案(试行)[3]诊断为慢性乙型肝炎，选其中HBeAg阳性38例；抗HBe阳性22例。均为自发性急性再发作。发作时血清丙氨酸转氨酶(ALT)增高2倍以上，大多数患者有2次以上的发作，且伴有不同的自觉症状。患者无大量(酒精量>50 g/d)饮酒史。病情活动期患者卧床休息，给予一般的保肝对症治疗。未使用过免疫抑制剂、抗病毒及抗肿瘤等药物。全部患者抗HBsAg阳性，其它类型肝炎病毒感染标志均阴性。全部病例进行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B超检查。收集该组患者急性活动期和恢复期的血清。5例献血员(甲、乙、丙、丁、戊和庚型肝炎病毒标志阴性)做阴性对照。全部血贮于-20 ℃冰箱备测。
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1.2 血清HBV DNA含量测定
本实验采用美国Biotronics公司建立的荧光标记方法进行血清HBV DNA的定量检测[4～5]。该方法采用套式PCR通过荧光素标记的引物在扩增中能量的转换而检测初始HBV DNA模板数。检测灵敏度500拷贝/mL。
1.3 统计分析
假设检验采用t检验和相关回归分析等方法。检验水准a=0.05。所有统计学分析在SPSS软件完成。
2 结 果
2.1 慢性乙型肝炎急性活动期与恢复期血清HBV DNA含量
60例慢性乙型肝炎，HBeAg阳性组(38例)及抗HBe阳性组(32例)活动期与恢复期血清HBV DNA含量的变化(见表1)。两组病例血清HBV DNA含量在活动期均显著高于恢复期。此外，在HBeAg阳性患者的活动期显著高于抗HBe阳性组(P<0.01)；而恢复期则无显著性差异(P>0.05)。HBeAg阳性组中的6例患者(15.5%)及抗HBe阳性组的6例患者(27.3%)，血清HBV DNA水平在恢复期无明显变化或反而升高。
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表1 慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平的变化
Table 1 Changes of HBV DNA serum level of the disease in patients with chronic hepatitis B
(
±s) Groups
(positive)
Serum HBV DNA concentrations1)
P
Activation period
Recovery period
, 百拇医药
HBeAg(n=38)
9.564±1.721
6.577±2.142
<0.05
Anti-HBe(n=22)
7.241±1.355
4.428±2.012
<0.02
1) Logarithm2.2 血清HBV DNA含量与肝功能部分指标的关系
我们还分析了全部患者病情活动时，血清HBV DNA与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BLLI)之间的关系，经统计学处理没有发现有数量上的相关关系。
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2.3 5例献血员对照检测
全部献血员的血清HBV DNA为阴性。
3 讨 论
慢性乙型肝炎自发性再活动，多数学者认为与HBV复制有关[1，6，7]。但也有不同观点，Khakoo等[8]报道，在许多高水平病毒血症的病人并没有血清ALT的升高。
测定一组CHB患者活动期和恢复期的血清HBV DNA含量，结果无论是HBeAg阳性组还是在抗HBe阳性组，发作期均明显高于恢复期(P<0.05)。两组病例的血清HBV DNA含量均随肝功能的恢复而下降。抗HBe阳性慢性乙型肝炎是由HBV前C基因突变株感染引起，在我国抗HBe阳性反复复发的慢性肝炎和慢性重型肝炎极常见。本病例抗HBe阳性组经血清学检测证实为HBV前C区第83位核甘酸(即HBV全基因组第1 896位核甘酸)突变。表现出与HBeAg阳性组相似的特点，显示无论是HBV野生株还是变异株感染，HBV复制水平均与慢性肝炎的再活动关系密切。提示：CHB患者由于某些不明诱因(如感染等)，HBV开始大量复制，启动了机体的免疫反应，结果导致肝脏的损伤，临床上出现急性再活动。血清和细胞中增加的病毒复制和病毒抗原的累积及继发的免疫反应在慢性乙型肝炎肝损害的急性发作中具有重要意义[2，9]。
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但在研究中发现HBeAg阳性组中的6例患者(15.5%)及抗HBe阳性组的6例患者(27.3%)，其血清HBV DNA并没有向大多数的病例所显示的那种模式，血清HBV DNA水平恢复期与活动期比较无明显变化或反而升高。提示慢性乙型肝炎发病机制的复杂性。
此外，未发现血清HBV DNA含量与血清ALT、AST和T-BILI等肝功能指标有数量上的相关关系。HBV不直接致肝脏病变，须经宿主的免疫应答。一般认为对肝细胞表面的HBV抗原所引起的宿主免疫应答是肝细胞损伤程度的决定性因素。而机体的免疫反应和肝细胞的溶解是一系列的体液和细胞免疫介导的反应所决定。这些反应受许多因素影响，如宿主基因的异质性、病毒免疫反应的能力等。■
基金项目：卫生部优秀青年人才基金(97018)及美国中华医学基金资助课题
作者简介：周小辉(1964-)，女，云南人，学士，副主任医师.导师：姚集鲁，高志良.1997年9月～1998年7月，为中山医科大学国内访问学者(CMB)1998年9月起，在中山医科大学攻读在职硕士研究生学位. 作者自1984年毕业后，长期从事传染病临床、教学及科研工作. 目前，已在国内外杂志发表多篇论文，参编本专业书籍1本. 1997年获省卫生厅青年基金课题立项.
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参考文献：
[1]Maruyama T, Linc S, Koike K, et al. Serology of acute exacerbation in chronic hepatitis B virus infection[J]. Gastroenterology, 1993,105(4):1141.
[2]Mills C T, Lee E, Perrilli R. Relationship between histology, Aminotransferase levels, and viral replication in chronic hepatitis B[J]. Gastroenterology, 1990,99(2):519.
[3]病毒性肝炎防治方案(试行)[J]. 中华传染病杂志，1995，13(4)：241.
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[4]Dieffenbach C W, Dveksler G S. PCR Primer. A Laboratory Manual[A]. In Wang C N, Wu K Y, Wang H T. Quantitative PCR using the AmpliSensor Assay[M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995.193.
[5]Chen S, Yee A, Giffiths M, et al. A rapid, sensitive and automated method for detection of Salmonella species in foods using AG-9600 AmpliSensor Analyzer[J]. J Appl Microbiol, 1997, 83(3):314.
[6]Liaw Y F, Pao C C, Ghu C M. Changes of serum HBV DNA in relation to serum transaminase level during acute exacerbation in patients with chronic hepatitis B[J]. Liver, 1988,8(4):231.
, 百拇医药
[7]Liaw Y F, Yang S S, Chen T J,et al. Acute exacerbation in hepatitis B antigen positive chronic type B hepatitis:a clinicopathological stud[J]. Journal of Hepatology, 1985,1(3):227.
[8]Khakoo S I, Soni P N, Brown D, et al. A clinical evaluation of a new method for HBV DNA quantitation in patients with chronic hepatitis B[J]. Journal of Medical Virology, 1996,50(3):112.
[9]Chu C M, Liaw Y E. Natural history of chronic hepatitis B virus infection. An immune pathological study[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 1997,12(9,10):5218.
收稿日期：1999-07-26, 百拇医药
单位：周小辉(汕头大学医学院第二附属医院传染科， 广东 汕头 10031)；高志良 姚集鲁(中山医科大学附属第三医院传染科，广东 广州 510630)
关键词：肝炎，乙型；复发；DNA复制；聚合酶链反应；方法
中山医科大学学报000111
摘 要：目的 研究慢性乙型肝炎患者HBV复制水平与病情活动关系。方法 采用荧光标记定量PCR的方法，测定一组急性发作的慢性乙型肝炎患者(其中HBeAg阳性组38例，抗HBe阳性组22例)病情活动期和恢复期的血清HBV DNA含量。结果 血清HBV DNA含量在活动期明显高于恢复期(P<0.05)。血清HBV DNA含量与丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BLLI)之间无相关性。结论 HBV DNA复制水平与慢性乙型肝炎的活动密切相关。
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分类号：R 512，62； R 373.2 文献标识码：A
文章编号：1000-257X(2000)01-0037-03
Changes of Serum HBV DNA level of Disease Reactivations
in Patients with Chronic Hepatitis B
ZHOU Xiao-hui
(Department of Infectious Diseases, The Second Affiliated Hospital, Shantou University Medical College, Shantou, 510031)
GAO Zhi-liang
, 百拇医药
(Department of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630， China)
YAO Ji-lu
(Department of Infectious Diseases, The Third Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou, 510630， China)
Abstract：Objective We study the changes of HBV DNA serum level in acute hepatic exacerbation of the disease in chronic hepatitis B patients. Methods The serum HBV DNA concentration in 60 patients with acute exacerbation (AE) of chronic hepatitis B were tested by the quantitative PCR using the AmpliSensor assay. Results In 60 patients with CHB (38 HBeAg-positive and 22 anti-HBe-positive), levers of the serum HBV DNA in sera were higher during acute attacks than the one during recovery (P<0.05)； No correlation were found among the levels of HBV DNA, alanine aminotransferase(ALT)， aspartate aminotransferase (AST) and total bilirubin. Conclusions This investigation revealed there was significant correlation between the increasing levels of serum HBV DNA and the reactivations of patients in chronic hepatitis B. The increases in viral replication and subsequent host immune response to virus-infected hepatocytes play an important role in initiating reactivation of patients with CHB.
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Key words：hepatitis B/ relapse; DNA replication; PCR/method▲
在慢性乙型肝炎的自然病程中，病情常反复活动。病情再活动是慢性乙型肝炎病史中常见和重要的特征。既往对慢性乙型肝炎患者的血清和生化学等研究揭示了HBV复制与病情再活动之间的密切关系[1～2]，HBV DNA是乙型肝炎病毒复制最可靠的指标。本研究采用荧光标记(AmpliSensor)方法，测定一组急性自发性发作的慢性乙型肝炎患者病情活动时和恢复期的血清HBV DNA含量，以了解HBV复制水平与病情活动的关系。为进一步研究慢性乙型肝炎反复活动的机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 病例选择
全部病例来自中山三院传染科住院病区和门诊，共60例。其中男性45例，女性15例，平均年龄(32.2±8.6)岁(17～62岁)。按照1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议——病毒性肝炎防治方案(试行)[3]诊断为慢性乙型肝炎，选其中HBeAg阳性38例；抗HBe阳性22例。均为自发性急性再发作。发作时血清丙氨酸转氨酶(ALT)增高2倍以上，大多数患者有2次以上的发作，且伴有不同的自觉症状。患者无大量(酒精量>50 g/d)饮酒史。病情活动期患者卧床休息，给予一般的保肝对症治疗。未使用过免疫抑制剂、抗病毒及抗肿瘤等药物。全部患者抗HBsAg阳性，其它类型肝炎病毒感染标志均阴性。全部病例进行腹部、肝脏、胆囊、脾脏及胰腺“B超检查。收集该组患者急性活动期和恢复期的血清。5例献血员(甲、乙、丙、丁、戊和庚型肝炎病毒标志阴性)做阴性对照。全部血贮于-20 ℃冰箱备测。
, http://www.100md.com
1.2 血清HBV DNA含量测定
本实验采用美国Biotronics公司建立的荧光标记方法进行血清HBV DNA的定量检测[4～5]。该方法采用套式PCR通过荧光素标记的引物在扩增中能量的转换而检测初始HBV DNA模板数。检测灵敏度500拷贝/mL。
1.3 统计分析
假设检验采用t检验和相关回归分析等方法。检验水准a=0.05。所有统计学分析在SPSS软件完成。
2 结 果
2.1 慢性乙型肝炎急性活动期与恢复期血清HBV DNA含量
60例慢性乙型肝炎，HBeAg阳性组(38例)及抗HBe阳性组(32例)活动期与恢复期血清HBV DNA含量的变化(见表1)。两组病例血清HBV DNA含量在活动期均显著高于恢复期。此外，在HBeAg阳性患者的活动期显著高于抗HBe阳性组(P<0.01)；而恢复期则无显著性差异(P>0.05)。HBeAg阳性组中的6例患者(15.5%)及抗HBe阳性组的6例患者(27.3%)，血清HBV DNA水平在恢复期无明显变化或反而升高。
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表1 慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平的变化
Table 1 Changes of HBV DNA serum level of the disease in patients with chronic hepatitis B
(
±s) Groups(positive)
Serum HBV DNA concentrations1)
P
Activation period
Recovery period
, 百拇医药
HBeAg(n=38)
9.564±1.721
6.577±2.142
<0.05
Anti-HBe(n=22)
7.241±1.355
4.428±2.012
<0.02
1) Logarithm2.2 血清HBV DNA含量与肝功能部分指标的关系
我们还分析了全部患者病情活动时，血清HBV DNA与血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶(AST)及总胆红素(T-BLLI)之间的关系，经统计学处理没有发现有数量上的相关关系。
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2.3 5例献血员对照检测
全部献血员的血清HBV DNA为阴性。
3 讨 论
慢性乙型肝炎自发性再活动，多数学者认为与HBV复制有关[1，6，7]。但也有不同观点，Khakoo等[8]报道，在许多高水平病毒血症的病人并没有血清ALT的升高。
测定一组CHB患者活动期和恢复期的血清HBV DNA含量，结果无论是HBeAg阳性组还是在抗HBe阳性组，发作期均明显高于恢复期(P<0.05)。两组病例的血清HBV DNA含量均随肝功能的恢复而下降。抗HBe阳性慢性乙型肝炎是由HBV前C基因突变株感染引起，在我国抗HBe阳性反复复发的慢性肝炎和慢性重型肝炎极常见。本病例抗HBe阳性组经血清学检测证实为HBV前C区第83位核甘酸(即HBV全基因组第1 896位核甘酸)突变。表现出与HBeAg阳性组相似的特点，显示无论是HBV野生株还是变异株感染，HBV复制水平均与慢性肝炎的再活动关系密切。提示：CHB患者由于某些不明诱因(如感染等)，HBV开始大量复制，启动了机体的免疫反应，结果导致肝脏的损伤，临床上出现急性再活动。血清和细胞中增加的病毒复制和病毒抗原的累积及继发的免疫反应在慢性乙型肝炎肝损害的急性发作中具有重要意义[2，9]。
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但在研究中发现HBeAg阳性组中的6例患者(15.5%)及抗HBe阳性组的6例患者(27.3%)，其血清HBV DNA并没有向大多数的病例所显示的那种模式，血清HBV DNA水平恢复期与活动期比较无明显变化或反而升高。提示慢性乙型肝炎发病机制的复杂性。
此外，未发现血清HBV DNA含量与血清ALT、AST和T-BILI等肝功能指标有数量上的相关关系。HBV不直接致肝脏病变，须经宿主的免疫应答。一般认为对肝细胞表面的HBV抗原所引起的宿主免疫应答是肝细胞损伤程度的决定性因素。而机体的免疫反应和肝细胞的溶解是一系列的体液和细胞免疫介导的反应所决定。这些反应受许多因素影响，如宿主基因的异质性、病毒免疫反应的能力等。■
基金项目：卫生部优秀青年人才基金(97018)及美国中华医学基金资助课题
作者简介：周小辉(1964-)，女，云南人，学士，副主任医师.导师：姚集鲁，高志良.1997年9月～1998年7月，为中山医科大学国内访问学者(CMB)1998年9月起，在中山医科大学攻读在职硕士研究生学位. 作者自1984年毕业后，长期从事传染病临床、教学及科研工作. 目前，已在国内外杂志发表多篇论文，参编本专业书籍1本. 1997年获省卫生厅青年基金课题立项.
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参考文献：
[1]Maruyama T, Linc S, Koike K, et al. Serology of acute exacerbation in chronic hepatitis B virus infection[J]. Gastroenterology, 1993,105(4):1141.
[2]Mills C T, Lee E, Perrilli R. Relationship between histology, Aminotransferase levels, and viral replication in chronic hepatitis B[J]. Gastroenterology, 1990,99(2):519.
[3]病毒性肝炎防治方案(试行)[J]. 中华传染病杂志，1995，13(4)：241.
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[4]Dieffenbach C W, Dveksler G S. PCR Primer. A Laboratory Manual[A]. In Wang C N, Wu K Y, Wang H T. Quantitative PCR using the AmpliSensor Assay[M]. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1995.193.
[5]Chen S, Yee A, Giffiths M, et al. A rapid, sensitive and automated method for detection of Salmonella species in foods using AG-9600 AmpliSensor Analyzer[J]. J Appl Microbiol, 1997, 83(3):314.
[6]Liaw Y F, Pao C C, Ghu C M. Changes of serum HBV DNA in relation to serum transaminase level during acute exacerbation in patients with chronic hepatitis B[J]. Liver, 1988,8(4):231.
, 百拇医药
[7]Liaw Y F, Yang S S, Chen T J,et al. Acute exacerbation in hepatitis B antigen positive chronic type B hepatitis:a clinicopathological stud[J]. Journal of Hepatology, 1985,1(3):227.
[8]Khakoo S I, Soni P N, Brown D, et al. A clinical evaluation of a new method for HBV DNA quantitation in patients with chronic hepatitis B[J]. Journal of Medical Virology, 1996,50(3):112.
[9]Chu C M, Liaw Y E. Natural history of chronic hepatitis B virus infection. An immune pathological study[J]. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 1997,12(9,10):5218.
收稿日期：1999-07-26, 百拇医药