利用复合PCR扩增荧光自动STR分型方法认定犯罪嫌疑人1例报告
作者：江斌
单位：江斌(湖南省衡阳医学院分子生物学研究中心，湖南 衡阳421001)
关键词：荧光自动DNA检测；聚合酶链反应；性犯罪；个人识别方法
中山医科大学学报000122中图分类号：R89 文献标识码：B
文章编号：1000-257X(2000)01-0072-02▲
某派出所送来蒋某(女)控告于1998年7月1日被嫌疑人张某(男)强奸的有关检材。送检样品：① 避孕套一只：套内精液少量，呈红棕色、恶臭、腐败状；② 受害者蒋某血纱一份；③ 嫌疑人张某血纱一份。送检目的：要求做DNA鉴定以确定避孕套内的精液是否为张某所留。本研究所利用复合PCR扩增荧光自动短片段串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型方法，最后定性为强奸案，现予以报道。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 DNA抽提
将送检样品以常规等体积酚—氯仿方法抽提DNA[1]。
1.2 PCR反应
体积为25 μL，每一批均附有阳性及阴性(水)对照。反应成分：模板DNA 3 μL、每种引物(美国PE公司)0.08～0.12 μmol/L、dNTPs(上海生工)0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶(上海生工)10 kU/L、10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、0.01 mL/L gelatin、MgCl2 0.15 mmol/L， PCR循环：90 ℃ 5 min,93 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循环28次，72 ℃延伸5 min。仪器为PE Gene-Amp PCR system 2400。
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1.3 电 泳1.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(ndPAGE) 取PCR扩增产物5～10 μL与1 μL加样缓冲液混匀，加入加样孔中，以Phix-174作为DNA标准参照物，8%聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺与双甲叉聚丙烯酰胺之比为29∶1)200 V恒压电泳至溴酚蓝染料迁移至下电泳槽内为止。银染检测扩增产物，电泳仪：Hoefer公司SE600型电泳仪，1.3.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE) 取荧光标记PCR扩增产物0.5 μL与适量加样缓冲液混匀，6%聚丙烯酰胺凝胶(6 mol/L Urea)在1680 V、51 ℃恒压恒温电泳4 h(电泳仪：美国PE公司Prism 377型荧光DNA自动检测仪)，GeneScan 672收集并分析数据。
2 结 果
2.1 ndPAGE、银染检测STR结果
精液与张某在D21S11、D19S253、PLA、ATT、ARA等STR位点的基因型均相同，但在TH01及TPOX两位点的基因型则不相同，部分结果见图1。
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图1 三样本非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳STR结果
Fig.1 Analysis of loci TPOX, FES, TH01 on non- denaturing PAGE of three samples
1. The victim; 2. The suspect; 3. The sperm
2.2 变性PAGE、荧光STR检测结果
精液与张某在所检测的6个STR位点及1个性别鉴定位点的分型均相同，将基因分型结果列于表1，其荧光扫描结果见图2。
表1 7个位点荧光检测结果
Table 1 Genotypes of the three samples obtained by fluorescent DNA detection at 7 loci No
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Sample
Amelogenin
VWA31A
TH01
F13A1
FES
TPOX
CSF1PO
1
Sperm
X/Y
18/18
7/9
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6/6
11/11
8/9
12/12
2
The suspect
X/Y
18/18
7/9
6/6
11/11
8/9
12/12
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3
The victim
X/X
14/16
7/9
3.2/4
8/8
7/8
10/12
图2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光STR部分检测结果
Fig.2 Analysis of 7 loci on denaturing PAGE by fluorescent
, 百拇医药
STR profiling assay
●: Internal size standard: ：TPOX； ★:TH01; upper, middle and lower lane; the sperm, the victim and the suspect respectively. The data in table show the length of corresponding DNA fragments(bp)
根据DNA分型结果可知，送检避孕套内精液所检测的6个STR位点基因型、1个性别Amelogenin基因位点分型与嫌疑人张某的均相同，偶合率达1.059×10-10。
3 讨 论
荧光DNA自动检测技术具有准确、灵敏等优点，在国外已运用于实际办案，国内由江斌等[1，2]率先引进，进行了一系列法医学应用的研究工作，并率先用荧光STR技术进行办案，取得非常好的效果。多色荧光技术使复合PCR扩增的位点可达10个之多(本文暂应用7个位点)，极大幅度地提高了工作效率。
, 百拇医药
本案中，采用常规非变性PAGE STR分型发现精液及嫌疑人张某在TH01和TPOX两个STR位点的基因型不相同，送案单位ABO血型鉴定结果“不排除嫌疑人张某”，用相同STR位点进行PCR扩增并结合运用荧光DNA自动检测仪进行荧光自动STR分型，发现避孕套内精液及嫌疑人张某的一致，偶合率达到1.059×10-10，得出了“认定嫌疑人”的结论；该报告发出后，经侦察人员多方取证，嫌疑人张某供出全部作案经过，最后该案定性为强奸案。荧光自动STR分析为破获该案提供了科学依据。
变性和非变性PAGE所得结果不同的原因，与常规PAGE中存在泳道间泳动速率不一致，使相同等位基因在不同胶或同一板胶不同泳道中的泳动快慢不一有关，这种情况在作者以前的工作中亦出现过，尤其是非变性PAGE中出现较多；荧光自动检测在同一泳道中，PCR扩增产物与相对分子质量对照同时加样电泳，避免了泳道间差异，本文所用自动测量等位基因长度系统的百分精确度在99.42%～99.96%之间，分辨力可达1 bp。
, 百拇医药
此外，这种现象还与非变性PAGE中某些DNA片段表现出异常的泳动速率有关[3]，这种现象可能是DNA片段碱基排列结构的差异使双链DNA分子的曲率发生变化而阻碍其迁移，使该等位基因在非变性PAGE中的泳动失常。一个很好的例子，如本文图1所示受害者TPOX位点的基因型为7/8，但图中仅显示出一条泳带。故运用非变性PAGE进行STR位点的分型时应慎重。■
基金项目：广东省重点科技攻关项目(99M04813G)
作者简介：江斌(1968-)，女，法医博士，现任主检法医师。1998届中山医科大学校友。近两年来完成了广东及其邻近省市包括凶杀、碎尸、交通事故、强(轮)奸、伤害、亲子鉴定等各种案件70余宗的DNA鉴定工作。
参考文献：
[1]江 斌. STR分型和性别鉴定及其法医学应用[D]. 广州：中山医科大学，1998.
[2]江 斌，郭景元，梁赏猷. 运用变性PAGE和荧光检测技术对广州汉族人群六个STR位点的研究[J].法医学杂志， 1999，15(3)：141～143.
[3]Eng B, Ainsworth P, Waye J S. Anomalous migration of PCR products using nondenaturing polyacrylamide gel eletrophoresis: the amelogenin sex typing system[J]. J Forens Sci, 1994,39(6):1356～1359.
收稿日期：1999-01-13, 百拇医药
单位：江斌(湖南省衡阳医学院分子生物学研究中心，湖南 衡阳421001)
关键词：荧光自动DNA检测；聚合酶链反应；性犯罪；个人识别方法
中山医科大学学报000122中图分类号：R89 文献标识码：B
文章编号：1000-257X(2000)01-0072-02▲
某派出所送来蒋某(女)控告于1998年7月1日被嫌疑人张某(男)强奸的有关检材。送检样品：① 避孕套一只：套内精液少量，呈红棕色、恶臭、腐败状；② 受害者蒋某血纱一份；③ 嫌疑人张某血纱一份。送检目的：要求做DNA鉴定以确定避孕套内的精液是否为张某所留。本研究所利用复合PCR扩增荧光自动短片段串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型方法，最后定性为强奸案，现予以报道。
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1 材料与方法
1.1 DNA抽提
将送检样品以常规等体积酚—氯仿方法抽提DNA[1]。
1.2 PCR反应
体积为25 μL，每一批均附有阳性及阴性(水)对照。反应成分：模板DNA 3 μL、每种引物(美国PE公司)0.08～0.12 μmol/L、dNTPs(上海生工)0.2 mmol/L、Taq DNA聚合酶(上海生工)10 kU/L、10 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L KCl、0.01 mL/L gelatin、MgCl2 0.15 mmol/L， PCR循环：90 ℃ 5 min,93 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,循环28次，72 ℃延伸5 min。仪器为PE Gene-Amp PCR system 2400。
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1.3 电 泳1.3.1 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(ndPAGE) 取PCR扩增产物5～10 μL与1 μL加样缓冲液混匀，加入加样孔中，以Phix-174作为DNA标准参照物，8%聚丙烯酰胺凝胶(聚丙烯酰胺与双甲叉聚丙烯酰胺之比为29∶1)200 V恒压电泳至溴酚蓝染料迁移至下电泳槽内为止。银染检测扩增产物，电泳仪：Hoefer公司SE600型电泳仪，1.3.2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(dPAGE) 取荧光标记PCR扩增产物0.5 μL与适量加样缓冲液混匀，6%聚丙烯酰胺凝胶(6 mol/L Urea)在1680 V、51 ℃恒压恒温电泳4 h(电泳仪：美国PE公司Prism 377型荧光DNA自动检测仪)，GeneScan 672收集并分析数据。
2 结 果
2.1 ndPAGE、银染检测STR结果
精液与张某在D21S11、D19S253、PLA、ATT、ARA等STR位点的基因型均相同，但在TH01及TPOX两位点的基因型则不相同，部分结果见图1。
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图1 三样本非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳STR结果
Fig.1 Analysis of loci TPOX, FES, TH01 on non- denaturing PAGE of three samples
1. The victim; 2. The suspect; 3. The sperm
2.2 变性PAGE、荧光STR检测结果
精液与张某在所检测的6个STR位点及1个性别鉴定位点的分型均相同，将基因分型结果列于表1，其荧光扫描结果见图2。
表1 7个位点荧光检测结果
Table 1 Genotypes of the three samples obtained by fluorescent DNA detection at 7 loci No
, http://www.100md.com
Sample
Amelogenin
VWA31A
TH01
F13A1
FES
TPOX
CSF1PO
1
Sperm
X/Y
18/18
7/9
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6/6
11/11
8/9
12/12
2
The suspect
X/Y
18/18
7/9
6/6
11/11
8/9
12/12
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3
The victim
X/X
14/16
7/9
3.2/4
8/8
7/8
10/12
图2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光STR部分检测结果
Fig.2 Analysis of 7 loci on denaturing PAGE by fluorescent
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STR profiling assay
●: Internal size standard: ：TPOX； ★:TH01; upper, middle and lower lane; the sperm, the victim and the suspect respectively. The data in table show the length of corresponding DNA fragments(bp)
根据DNA分型结果可知，送检避孕套内精液所检测的6个STR位点基因型、1个性别Amelogenin基因位点分型与嫌疑人张某的均相同，偶合率达1.059×10-10。
3 讨 论
荧光DNA自动检测技术具有准确、灵敏等优点，在国外已运用于实际办案，国内由江斌等[1，2]率先引进，进行了一系列法医学应用的研究工作，并率先用荧光STR技术进行办案，取得非常好的效果。多色荧光技术使复合PCR扩增的位点可达10个之多(本文暂应用7个位点)，极大幅度地提高了工作效率。
, 百拇医药
本案中，采用常规非变性PAGE STR分型发现精液及嫌疑人张某在TH01和TPOX两个STR位点的基因型不相同，送案单位ABO血型鉴定结果“不排除嫌疑人张某”，用相同STR位点进行PCR扩增并结合运用荧光DNA自动检测仪进行荧光自动STR分型，发现避孕套内精液及嫌疑人张某的一致，偶合率达到1.059×10-10，得出了“认定嫌疑人”的结论；该报告发出后，经侦察人员多方取证，嫌疑人张某供出全部作案经过，最后该案定性为强奸案。荧光自动STR分析为破获该案提供了科学依据。
变性和非变性PAGE所得结果不同的原因，与常规PAGE中存在泳道间泳动速率不一致，使相同等位基因在不同胶或同一板胶不同泳道中的泳动快慢不一有关，这种情况在作者以前的工作中亦出现过，尤其是非变性PAGE中出现较多；荧光自动检测在同一泳道中，PCR扩增产物与相对分子质量对照同时加样电泳，避免了泳道间差异，本文所用自动测量等位基因长度系统的百分精确度在99.42%～99.96%之间，分辨力可达1 bp。
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此外，这种现象还与非变性PAGE中某些DNA片段表现出异常的泳动速率有关[3]，这种现象可能是DNA片段碱基排列结构的差异使双链DNA分子的曲率发生变化而阻碍其迁移，使该等位基因在非变性PAGE中的泳动失常。一个很好的例子，如本文图1所示受害者TPOX位点的基因型为7/8，但图中仅显示出一条泳带。故运用非变性PAGE进行STR位点的分型时应慎重。■
基金项目：广东省重点科技攻关项目(99M04813G)
作者简介：江斌(1968-)，女，法医博士，现任主检法医师。1998届中山医科大学校友。近两年来完成了广东及其邻近省市包括凶杀、碎尸、交通事故、强(轮)奸、伤害、亲子鉴定等各种案件70余宗的DNA鉴定工作。
参考文献：
[1]江 斌. STR分型和性别鉴定及其法医学应用[D]. 广州：中山医科大学，1998.
[2]江 斌，郭景元，梁赏猷. 运用变性PAGE和荧光检测技术对广州汉族人群六个STR位点的研究[J].法医学杂志， 1999，15(3)：141～143.
[3]Eng B, Ainsworth P, Waye J S. Anomalous migration of PCR products using nondenaturing polyacrylamide gel eletrophoresis: the amelogenin sex typing system[J]. J Forens Sci, 1994,39(6):1356～1359.
收稿日期：1999-01-13, 百拇医药