乙型肝炎病毒核心基因克隆及其重组体的构建
作者：韦嘉 杨林 姚集鲁 姚春斓 卢建溪
单位：中山医科大学附属第三医院传染科，广东 广州 510630
关键词：肝炎病毒,乙型；免疫学；基因，扩增；聚合酶链反应；核酸，重组
中山医科大学学报000312
摘 要:【目的】构建含乙型肝炎病毒(HBV)编码核心蛋白(HBcAg)的核心(C)基因的真核表达重组体，以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型)全基因序列的质粒pHBV1为模板，用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～2457)，该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点，以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，以及重组体插入片段的DNA 序列测定，证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3-HBc。【结论】pcDNA3-HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。
, 百拇医药
中图分类号：R 512.6 文献标识码：A 文章编号：1000-257X(2000)03-0199-03
Amplification of Hepatitis B Virus Core Gene by PCR and Creating Eukaryotic Expression Vector Construct
WEI Jia,YANG Lin,YAO Ji-lu,YAO Chun-lan,LU Jian-xi
(Department of Infectious Diseases ,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630，China)
Abstract：【Objective】To creat Hepatitis B virus C gene eukaryotic expression construct,in order to study DNA-mediated immunization in mouse and related issues research.【Methods】Using plasmid pHBV1 which contained hepatitis B virus (ayw subtype) whole DNA sequences as the source of viral genes,HBV DNA fragment(nt1889～2457) encoding for nucleocapsid protein (HBcAg) was polymerase chain reaction cloned as BamHⅠ-EcoRⅠfragment.The gene was inserted into the multiple cloning site of eukaryotic expression plasmid vector pcDNA3.【Result】The recombinant plasmid was cleaved with EcoRⅠ and BamHⅠ.Agarose gel electrophoresis，and sequencing the insert fragment in pcDNA3 showed that pcDNA3-HBVc eukaryotic expression construct is successfully created.【Conclusion】The recombinant construct pcDNA3-HBc provides available conditions for further study about it's expression and immune response.
, 百拇医药
Key words：hepatitis B virus/immunology; gene/amplification/PCR; DNA/recombinant
核酸(DNA)免疫是近年研究的热点，通过内源性产生抗原和加工提呈的途径，DNA免疫可产生较强的体液和细胞免疫应答，不仅有预防而且还可能有治疗功效[1]。DNA疫苗在防治乙型肝炎的研究方面，对编码表面抗原(HBsAg)的S基因有较多报道，对C基因的研究相对较少[2]。有证据表明，人类感染HBV后核心蛋白对B细胞、Th(辅助性T细胞)和CTL(杀伤性T细胞)的应答均具有很高的免疫原性[3～5]，因此，对C基因DNA免疫的研究具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 质粒载体及关键试剂
含HBV(ayw亚型)全基因序列的质粒pHBV1、真核表达载体质粒pcDNA3、大肠杆菌HB101为本室所保存；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶、Taq酶均购自Promega公司；DNA回收及纯化试剂盒Prep-Gene-A购自Bio-Rad公司。荧光测序试剂盒为PE公司产品。
, 百拇医药
1.2 PCR引物的设计及扩增条件
根据HBV ayw亚型基因序列[5]设计一对引物，由上海细胞生物所合成，在上、下游引物中加入BamHⅠ、EcoRⅠ限制性酶切位点，以便于克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3中，上游引物为5′-TTACGGATTCTGGCTTTGGGGCATGGA-C-3′，下游引物为5′-CTCGAATTCATACTAACATTGAGATTCC-3′以质粒pHBV1为模板在MJ公司PTC-100TM热循环仪上按下列步骤进行PCR扩增C基因：共30个循环，每一循环94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min。
1.3 真核表达重组体的构建
PCR产物和质粒pcDNA3经Prep-Gene-A试剂盒纯化后，分别用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，酶切后同样经Prep-A-Gene回收纯化，用T4DNA连接酶连接目的基因HBV C和pcDNA3载体。连接物转化CaCl2法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞，在含氨苄青霉素的琼脂培养板上铺板，37 ℃过夜培养。挑选单菌落提取质粒进行酶切鉴定。
, 百拇医药
1.4 DNA序列测定
上述PCR扩增的引物，用PE公司的双脱氧法测序试剂盒在ABI PRISM 310型基因分析仪上进行DNA测序。
2 结 果
2.1 PCR扩增HBV C基因
以含HBV ayw亚型全基因序列的质粒pHBV1为模板扩增HBV核心(C)基因，PCR产物经10 g/L琼脂电泳鉴定，在569 bp处可见到清晰条带，与理论上C基因的大小完全符合(图1)。
2.2 pcDNA3-HBVBc重组体的构建及鉴定
目的基因HBV C和载体质粒经酶切、连接及转化后，将挑选到的单菌落扩大培养，提取质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示空载体酶切为1条带；重组体酶切为两条带，1条5.4 kb，为载体质粒；1条为569 bp，与插入的目的基因大小完全相同，表明HBV C基因真核表达重组体pcDNA3-HBVc构建成功(图2)。
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图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product
M:100 bp DNA ladder ; A: PCR product
图2 重组质粒的鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
M:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ;A:recombinant plasmid/EcoRⅠ+BamHⅠ; B:recombinant plasmid/EcoRⅠ;C:plasmid pcDNA3/EcoRⅠ+BamHⅠ;D:plasmid pcDNA3
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2.3 重组体中插入的DNA片段序列测定
测序结果表明插入的片段与文献报道[6]的HBV(ayw亚型)编码核心抗原的序列一致。
3 讨 论
乙型肝炎病毒持续感染的原因之一，是由于感染者未能产生针对HBV结构蛋白的细胞免疫[3]。DNA免疫由于具有良好的诱导细胞免疫作用而在乙肝防治策略研究上倍受关注。
乙型肝炎病毒(HBV)核心(C)基因编码的核心抗原(HBcAg)，由183个氨基酸自身聚集而成，为20面体衣壳。包装HBV的核酸及多聚酶外层覆盖病毒包膜后自肝细胞释放。HBcAg还可在感染的肝细胞浆和肝细胞膜表面表达，成为机体特异性杀伤T细胞(CTL)攻击的靶抗原。核心蛋白诱导的细胞免疫对清除病毒感染的细胞以及病理损伤方面均具有重要作用。
, http://www.100md.com
pcDNA3是含CMV启动子的高水平真核表达质粒载体，与其他真核表达载体(如pAp031)比较，由于pcDNA3上所含有的氨苄青霉素抗性基因包含一个短免疫刺激DNA序列而有利于DNA免疫后体液和细胞免疫应答的产生[7]。对HBV S基因的DNA免疫研究提示，以pcDNA3为载体的S区DNA免疫所诱导的抗体转化率高于其他载体[2]。pcDNA3-HBVc重组体的构建成功，为探讨HBV C基因的DNA免疫研究，选择优势载体及进行与C基因相关的免疫病理机制研究提供了物质基础。
基金项目：国家自然科学基金(39770681)和广东省自然科学基金(980094)资助课题
作者简介：韦 嘉(1963-)，男，广西右江人，硕士，在职博士生，讲师.
参考文献：
[1]Geissler M,Tokushige K,Wands J.Polynucleotide based immunization:study of the celluler and humoral immune reponse to hepatitis B virus(abstr)[J].Hepatology，1995,22(4):324A.
, http://www.100md.com
[2]Geissler M,Tokushige K,Chante C C,et al.Celluar and humoral immune response to hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based immunization[J].Gstroenterology，1997,112(4):1307.
[3]Chisari F V,Ferrari C.Hepatitis B virus immunopathgenesis[J].Annu Rev Immunol，1995,13:29.
[4]Rehermann B,Chang K M,McHutchinson J,et al.Differential cytotoxic T lyphocyte responsiveness to the hepatitis B and C chronically infected patients[J].J Virol，1996,70(10):7092.
, 百拇医药
[5]Tsai S L,Chen P J,Lai M Y,et al.Acute excerbation of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens.Implication for hepatitis B e antigen seroconversion[J].J Clin Invest，1992,89(1):87.
[6]Ono Y,Onda H,Sasada R,et al.The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw[J].Nucleic Acids Research，1983,11(6):1747
[7]Sato Y,Roman M,Tighhe H,et al.Immunolstimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization[J].Science，1996,273(5273):352.
收稿日期：1999-07-16, 百拇医药
单位：中山医科大学附属第三医院传染科，广东 广州 510630
关键词：肝炎病毒,乙型；免疫学；基因，扩增；聚合酶链反应；核酸，重组
中山医科大学学报000312
摘 要:【目的】构建含乙型肝炎病毒(HBV)编码核心蛋白(HBcAg)的核心(C)基因的真核表达重组体，以进行核酸免疫及相关研究。【方法】以含HBV(ayw亚型)全基因序列的质粒pHBV1为模板，用PCR的方法获得编码HBcAg的C基因片段(nt1889～2457)，该基因片段两端设计了BamHⅠ和EcoRⅠ的限制性内切酶位点，以便通过定向克隆将其插入真核表达质粒载体pcDNA3相应的多克隆位点。【结果】经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，以及重组体插入片段的DNA 序列测定，证实成功地构建了含C基因的真核表达重组体pcDNA3-HBc。【结论】pcDNA3-HBc的构建成功为研究其表达及进行动物免疫研究提供了物质基础。
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中图分类号：R 512.6 文献标识码：A 文章编号：1000-257X(2000)03-0199-03
Amplification of Hepatitis B Virus Core Gene by PCR and Creating Eukaryotic Expression Vector Construct
WEI Jia,YANG Lin,YAO Ji-lu,YAO Chun-lan,LU Jian-xi
(Department of Infectious Diseases ,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510630，China)
Abstract：【Objective】To creat Hepatitis B virus C gene eukaryotic expression construct,in order to study DNA-mediated immunization in mouse and related issues research.【Methods】Using plasmid pHBV1 which contained hepatitis B virus (ayw subtype) whole DNA sequences as the source of viral genes,HBV DNA fragment(nt1889～2457) encoding for nucleocapsid protein (HBcAg) was polymerase chain reaction cloned as BamHⅠ-EcoRⅠfragment.The gene was inserted into the multiple cloning site of eukaryotic expression plasmid vector pcDNA3.【Result】The recombinant plasmid was cleaved with EcoRⅠ and BamHⅠ.Agarose gel electrophoresis，and sequencing the insert fragment in pcDNA3 showed that pcDNA3-HBVc eukaryotic expression construct is successfully created.【Conclusion】The recombinant construct pcDNA3-HBc provides available conditions for further study about it's expression and immune response.
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Key words：hepatitis B virus/immunology; gene/amplification/PCR; DNA/recombinant
核酸(DNA)免疫是近年研究的热点，通过内源性产生抗原和加工提呈的途径，DNA免疫可产生较强的体液和细胞免疫应答，不仅有预防而且还可能有治疗功效[1]。DNA疫苗在防治乙型肝炎的研究方面，对编码表面抗原(HBsAg)的S基因有较多报道，对C基因的研究相对较少[2]。有证据表明，人类感染HBV后核心蛋白对B细胞、Th(辅助性T细胞)和CTL(杀伤性T细胞)的应答均具有很高的免疫原性[3～5]，因此，对C基因DNA免疫的研究具有十分重要的意义。
1 材料与方法
1.1 质粒载体及关键试剂
含HBV(ayw亚型)全基因序列的质粒pHBV1、真核表达载体质粒pcDNA3、大肠杆菌HB101为本室所保存；限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、T4DNA连接酶、Taq酶均购自Promega公司；DNA回收及纯化试剂盒Prep-Gene-A购自Bio-Rad公司。荧光测序试剂盒为PE公司产品。
, 百拇医药
1.2 PCR引物的设计及扩增条件
根据HBV ayw亚型基因序列[5]设计一对引物，由上海细胞生物所合成，在上、下游引物中加入BamHⅠ、EcoRⅠ限制性酶切位点，以便于克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3中，上游引物为5′-TTACGGATTCTGGCTTTGGGGCATGGA-C-3′，下游引物为5′-CTCGAATTCATACTAACATTGAGATTCC-3′以质粒pHBV1为模板在MJ公司PTC-100TM热循环仪上按下列步骤进行PCR扩增C基因：共30个循环，每一循环94 ℃变性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min。
1.3 真核表达重组体的构建
PCR产物和质粒pcDNA3经Prep-Gene-A试剂盒纯化后，分别用BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，酶切后同样经Prep-A-Gene回收纯化，用T4DNA连接酶连接目的基因HBV C和pcDNA3载体。连接物转化CaCl2法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞，在含氨苄青霉素的琼脂培养板上铺板，37 ℃过夜培养。挑选单菌落提取质粒进行酶切鉴定。
, 百拇医药
1.4 DNA序列测定
上述PCR扩增的引物，用PE公司的双脱氧法测序试剂盒在ABI PRISM 310型基因分析仪上进行DNA测序。
2 结 果
2.1 PCR扩增HBV C基因
以含HBV ayw亚型全基因序列的质粒pHBV1为模板扩增HBV核心(C)基因，PCR产物经10 g/L琼脂电泳鉴定，在569 bp处可见到清晰条带，与理论上C基因的大小完全符合(图1)。
2.2 pcDNA3-HBVBc重组体的构建及鉴定
目的基因HBV C和载体质粒经酶切、连接及转化后，将挑选到的单菌落扩大培养，提取质粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示空载体酶切为1条带；重组体酶切为两条带，1条5.4 kb，为载体质粒；1条为569 bp，与插入的目的基因大小完全相同，表明HBV C基因真核表达重组体pcDNA3-HBVc构建成功(图2)。
, 百拇医药
图1 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of the PCR product
M:100 bp DNA ladder ; A: PCR product
图2 重组质粒的鉴定
Fig.2 Identification of recombinant plasmid
M:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ;A:recombinant plasmid/EcoRⅠ+BamHⅠ; B:recombinant plasmid/EcoRⅠ;C:plasmid pcDNA3/EcoRⅠ+BamHⅠ;D:plasmid pcDNA3
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2.3 重组体中插入的DNA片段序列测定
测序结果表明插入的片段与文献报道[6]的HBV(ayw亚型)编码核心抗原的序列一致。
3 讨 论
乙型肝炎病毒持续感染的原因之一，是由于感染者未能产生针对HBV结构蛋白的细胞免疫[3]。DNA免疫由于具有良好的诱导细胞免疫作用而在乙肝防治策略研究上倍受关注。
乙型肝炎病毒(HBV)核心(C)基因编码的核心抗原(HBcAg)，由183个氨基酸自身聚集而成，为20面体衣壳。包装HBV的核酸及多聚酶外层覆盖病毒包膜后自肝细胞释放。HBcAg还可在感染的肝细胞浆和肝细胞膜表面表达，成为机体特异性杀伤T细胞(CTL)攻击的靶抗原。核心蛋白诱导的细胞免疫对清除病毒感染的细胞以及病理损伤方面均具有重要作用。
, http://www.100md.com
pcDNA3是含CMV启动子的高水平真核表达质粒载体，与其他真核表达载体(如pAp031)比较，由于pcDNA3上所含有的氨苄青霉素抗性基因包含一个短免疫刺激DNA序列而有利于DNA免疫后体液和细胞免疫应答的产生[7]。对HBV S基因的DNA免疫研究提示，以pcDNA3为载体的S区DNA免疫所诱导的抗体转化率高于其他载体[2]。pcDNA3-HBVc重组体的构建成功，为探讨HBV C基因的DNA免疫研究，选择优势载体及进行与C基因相关的免疫病理机制研究提供了物质基础。
基金项目：国家自然科学基金(39770681)和广东省自然科学基金(980094)资助课题
作者简介：韦 嘉(1963-)，男，广西右江人，硕士，在职博士生，讲师.
参考文献：
[1]Geissler M,Tokushige K,Wands J.Polynucleotide based immunization:study of the celluler and humoral immune reponse to hepatitis B virus(abstr)[J].Hepatology，1995,22(4):324A.
, http://www.100md.com
[2]Geissler M,Tokushige K,Chante C C,et al.Celluar and humoral immune response to hepatitis B virus structural proteins in mice after DNA-based immunization[J].Gstroenterology，1997,112(4):1307.
[3]Chisari F V,Ferrari C.Hepatitis B virus immunopathgenesis[J].Annu Rev Immunol，1995,13:29.
[4]Rehermann B,Chang K M,McHutchinson J,et al.Differential cytotoxic T lyphocyte responsiveness to the hepatitis B and C chronically infected patients[J].J Virol，1996,70(10):7092.
, 百拇医药
[5]Tsai S L,Chen P J,Lai M Y,et al.Acute excerbation of chronic type B hepatitis are accompanied by increased T cell responses to hepatitis B core and e antigens.Implication for hepatitis B e antigen seroconversion[J].J Clin Invest，1992,89(1):87.
[6]Ono Y,Onda H,Sasada R,et al.The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus DNA; subtype adr and adw[J].Nucleic Acids Research，1983,11(6):1747
[7]Sato Y,Roman M,Tighhe H,et al.Immunolstimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization[J].Science，1996,273(5273):352.
收稿日期：1999-07-16, 百拇医药