递呈BAC5单抗识别位点的M13噬菌体克隆系的建立
作者:肖锡宾 张昌卿 李经略 冯凯涛 孙韵 叶永照
单位:中山医科大学肿瘤医院中心实验室, 广东 广州 510060
关键词:噬菌体M13;免疫学;肽库;抗体,单克隆
中山医科大学学报000302
摘 要:【目的】获得可递呈抗低分化和未分化癌细胞单克隆抗体(BAC5单抗)抗原表位的M13噬菌体克隆系。【方法】以BAC5单抗为靶抗体,对由M13噬菌体构建的随机12肽文库进行生物淘洗。用抗体竞争方法从阳性克隆中选出与BAC5单抗结合率较高的克隆系。通过ELISA方法检测BAC5单抗对上述克隆的选择性识别。【结果】经过3轮淘洗,获得的阳性克隆率为77%(35/45)。来自C2、C17和C29号克隆的噬菌体对外加BAC5单抗的结合率分别为71.6%、49.4%和64.0%,高于其它阳性克隆。BAC5单抗与来自上述3个克隆的噬菌体呈阳性反应,与来自辅助型M13株的噬菌体(VCSM13)和淘洗前的文库噬菌体(RPLM13)呈阴性反应。【结论】来自C2、C17和C29号克隆的噬菌体有可能递呈与BAC5单克隆抗相关的抗原表位。
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中图分类号:R 392.11 文献标识码:A 文章编号:1000-257X(2000)03-0165-03
The Establishment of M13 Phage Clones Displayed Epitope Recognized by BAC5 McAb
XIAO Xi-bin,ZHANG Chang-qing,LI Jing-lue,FENG Kai-tao,SUN Yun,YE Yong-zhao
(Central Labratory of Tumor Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,China)
Abstract:【Objectivel】To obtain M13 phages displayed antigenic epitope recognized by BAC5 McAb,a kind of monoclonal antibody located on poorly or undifferentiated squamous carcinoma cells.【Methods】Using BAC5 McAb as selected target,a 12-mers RPL was biopanned.The positive clones were selected by antibody competition assay.The clones combincd with BAC5 McAb were demonstrated by ELISA.【Results】77%(35/45) of positive clones from eluted phage clones were obtained by 3 rounds of biopanning.The combination rates of the phages from clone C2,C17,C29 with added BAC5 McAb were 71.6%,49.4% and 64.0% respectively much higher than those of phages from other positive clones.BAC5 McAb had positive reaction to M13 phages from C2,C17,C29 clones as compared with those from helper M13 phage strain,VCSM13 and no-biopanning RPL M13 phages(P/N>2.1).【Conclusion】The M13 phages from C2,C17,C29 clones may display antigenic epitope recognized by BAC5 McAb.
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Key words:bacteriophage M13/immunology;peptide library;antibodies,monoclonal
蛋白质抗原表位分析是研究抗原的分子结构和功能,抗原-抗体反应机制的基础。研究和分离癌细胞表达的抗原表位,可以为肿瘤的血清学诊断,特异性免疫治疗和抗肿瘤疫苗设计提供重要的线索和依据。
BAC5单抗(BAC5 McAb)是本室制备的小鼠IgG1单克隆抗体[1]。其相关的抗原决定簇存在于低分化/未分化鼻咽癌细胞的表面。由于传统的抗原表位分析方法,即抗体筛选重叠(overlapping)方法,需要对分离纯化后的BAC5相关抗原进行氨基酸序列分析再合成肽后才能进行,工作比较复杂,因此有关BAC5单抗的抗原表位结构一直未能确定。
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一种新的生物技术--随机多肽文库(random peptide libraries,RPL)技术,使抗原表位分析趋向简单[2,3]。该技术可以直接用已知抗体从肽库中筛选出能与之结合的多肽。这些多肽或者是该抗体所相关的线性表位,或者是模拟(mimotope)相应抗原空间构型的构象型表位。多肽的量可随特异噬菌体的繁殖而增加。只要对携带相应抗原表位的噬菌体进行DNA序列测定,即可确定它所递呈的抗原表位的氨基酸序列。利用这一技术,我们已成功地筛选出可以和BAC5单抗相结合的M13噬菌体克隆系,为确定BAC5相关抗原表位的结构奠定了基础,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 M13噬菌体 M13噬菌体递呈的随机12肽文库(RPL)是美国NEW ENGLAND BIOLABS公司产品,肽库的滴度(噬斑形成单位,pfu/L)为2×1016pfu/L。随机多样性为2×109。受体菌是E.coli ER2537。VCSM13为辅助性M13噬菌体。上述材料由北京军事医学科学院王海涛教授提供。RPLM13为本室扩增的递呈随机12肽的M13噬菌体,滴度为1015pfu/L。
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1.1.2 抗 体 纯化的小鼠BAC5单克隆抗体(IgG1)由本室制备,抗体浓度为0.5 g/L。辣根过氧化物酶标记的兔抗M13噬菌体IgG(1∶250)由王海涛教授提供。鼠抗M13噬菌体血清(1∶3 200)本室用RPLM13免疫Balb/C小鼠后制备。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(1∶800)为丹麦DAKO公司产品。
1.1.3 主要试剂 TBS(50 mol/L Tris-HCl,150 mol/L NaCl,pH 7.5),TBST含体积分数为0.1% Tween 20的TBS,邻苯二胺(OPD)为Sigma公司产品。
1.2 方 法
1.2.1 肽库的生物淘洗(biopanning) 将BAC5单抗稀释至150 mg/L,每个微孔用150 μL包被,经体积分数为3%BSA-PBS封闭。300 μL TBST缓冲液稀释10 μL肽库原液,按100 μL/孔加到微孔内,室温1 h。TBST缓冲液洗涤10次后,每孔加入100 μL 0.2 mol/L甘氨酸-盐酸(pH 2.2)室温10 min洗脱结合的噬菌体。每孔加入20 μL pH 9.2的Tris溶液中和洗脱液。测定洗下的噬菌体滴度(pfu)然后加到20 mL LB培养液中,同时加入过夜培养的E.Coli ER2537′菌1 mL, 37 ℃,250 r/min,培养5 h制备繁殖后的噬菌体,并测定滴度作为下一轮淘洗的噬菌体。每次淘洗后计算噬菌体的产量,如此反复淘洗3次。用第3次淘洗下的噬菌体10 μL感染E.coli ER2537菌铺制平板,挑取平板内的单个噬斑制备噬菌体原种。
, 百拇医药
1.2.2 噬菌体原种的ELISA检测 依“1.2.1”法用BAC5单抗包被酶联板。经体积分数为3% BSA-PBS封闭后,加入用稀释液对倍稀释的噬菌体原种各100 μL,以E.coli ER2537菌培养上清为阴性对照,37 ℃孵育1 h后PBS洗板3次。加入1∶250稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗M13抗体,37 ℃反应1 h,充分洗涤后用邻苯二胺显色。凡A490吸光度值大于3倍阴性对照者为阳性噬菌体原种。
1.2.3 抗体竞争试验 将50 μL从“1.2.2”中获得的阳性噬菌体原种与BAC5单抗50 μL(100 mg/L)混合放置37 ℃,1 h后,分别加到依“1.2.1”法包被了BAC5单抗的微孔中(实验孔)。每个实验孔均设置以稀释液代替外源BAC5单抗的对照孔。依“1.2.2”法进行ELISA测定,计算每个噬菌体原种在加入BAC5单抗后的抑制率。
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1.2.4 BAC5单抗对M13噬菌体的ELISA反应 选出从“1.2.3”中获得的抑制率接近/高于50%的噬菌体以及VCSM13、RPLM13噬菌体分别作为抗原,调节噬菌体密度为109 pfu/μL。各用50 μL包被微孔,每种噬菌体包被3个复孔,用体积分数为3%BSA-PBS封闭后,每孔加入50 μL BAC5单抗(100 mg/L),以小鼠抗M13血清(1∶1 000)为阳性对照。用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG作为二抗,依“1.2.2”法进行ELISA测定。取3个复孔的均值代表每株噬菌体的光吸收值(A490),观察BAC5单抗对不同来源的噬菌体的反应。
2 结 果
2.1 M13噬菌体随机肽库的淘洗
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表1显示3次淘洗的结果,洗出的噬菌体及其相对产率依次递增。
表1 噬菌体随机多肽文库的淘洗
Table 1 The phages eluted from RPL1) by biopanning Biopanning
Phages added
(pfu)
Phages eluted
(pfu)
Yield2)
(%)
First
, 百拇医药
4.0×1010
1.5×103
3.7×108
Second
1.2×1010
4.2×106
3.5×104
Third
5.4×1010
1.8×109
, 百拇医药
3.3×102
1) RPL:Random Peptide Libraries;2) Yield(%)=(pfu of phages eluted/pfu of phages added)×100%2.2 噬菌体原种的ELISA检测及抗体竞争试验
从第3次淘洗后铺制的平板中取出45个克隆(噬斑)进行ELISA测定,其中有阳性克隆35个占77%。经抗体竞争试验检测,其中8个能与外源BAC5单抗有不同程度结合,即加入外源BAC5单抗后,这8个克隆的噬菌体可以显示出对ELISA反应有不同程度的“抑制”作用,见表2。其中以来自C2、C17、C29克隆的噬菌体与外源BAC5 McAb的结合率(对ELISA反应的抑制率)最高,分别为71.6%、49.4%和64.0%。
表2 BAC5单抗对阳性噬菌体ELISA反应的竞争
, 百拇医药
Table 2 Competition of positive phages between coated and added BAC5 McAb1) by ELISA Eluted
Positive
Phages
Value of A490()
Inhibition
rate2)(%)
Before competition
, http://www.100md.com (coated BAC5 McAb)
After competition
(added BAC5 McAb)
C2
1.130
0.321
71.6
C12
0.827
0.484
41.5
C15
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0.895
0.534
40.3
C17
1.066
0.539
49.4
C25
0.773
0.466
39.7
C28
0.713
, 百拇医药
0.418
32.5
C29
0.951
0.342
64.0
C32
0.756
0.423
44.0
1) BAC5 McAb:A kind of monoclonal antibody located on the poorly or undifferentiated squamous carcinoma cells;2) Inhibition rate:[(Value of A490 before the Competition-Value of A490 after the competition)/Value of A490 before the Competition]×100%2.3 BAC5单抗对噬菌体的ELISA反应
, 百拇医药
鼠抗M13血清对所有的噬菌体都有阳性反应,而BAC5单抗只对来自C2、C17、C29的噬菌体才有阳性反应,对VCSM13、RPLM13为阴性反应。阳性与阴性反应光吸收值(A490)之比(P/N)大于2.1。见表3。
表3 BAC5单抗对M13噬菌体的ELISA反应
Table 3 Reaction of BAC5 McAb to M13 phages by Elisa M13 Phages1)
(5×1010 pfu/well)
Value of A490(X)
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BAC5 McAb
100 mg/L
Mouse Sera to RPL M13
(1∶1 000)
C2
0.321
0.581
C17
0.295
0.501
C29
0.205
, 百拇医药
0.571
VCSM13
0.089
0.316
RPLM13
0.089
0.636
1) C2,C17,C29:Positive M13 phages clone eluted by biopanning,VCSM13;Helper M13 phages strain,RPLM13:M13 phages from Random Peptide Library3 讨 论
, 百拇医药
利用随机多肽文库技术进行抗原表位分析的关键是要从文库中筛选到能与特定抗体相结合的噬菌体克隆。本实验经过3轮淘洗后,最末1轮收获的噬菌体百分比(3.3×10-2)比初次淘洗得到的百分比(3.75×10-8)高出106。提示经淘洗→扩增→淘洗3次后,能被BAC5单抗俘获的噬菌体已得到极大的富集。将最后1轮淘洗后得到的噬菌体感染宿主菌后接种琼脂获得噬斑,经BAC5抗体捕获方法证实其阳性率达到77%(35/45),进一步支持了淘洗的效果。
由于缺少BAC5相关的抗原,我们对来自35个阳性克隆的噬菌体进行抗体俘获竞争试验。即在ELISA测定系统中加入外源BAC5单抗与包被在酶标板上的BAC5竞争特异性噬菌体。35个阳性克隆中只有来自8个克隆的噬菌体能与外源BAC5单抗结合影响ELISA测定结果,呈现出程度不等的“抑制”作用。其中来自C2、C17和C29号克隆的M13噬菌体所显示的抑制率较高,分别为71.6%、49.4%、64.0%。导致大部份阳性克隆(27/35)的噬菌体不与外源BAC5相结合的可能原因是①抗体本身:包被在酶标板上的BAC5单抗与液相中用以竞争噬菌体的外源BAC5单抗可能在构型上产生差异。由于淘洗过程是以固相的BAC5单抗作为靶抗体,所以大部分的噬菌体更适应于与包被在板上的BAC5单抗结合;②噬菌体间的差异:来自不同克隆的噬菌体,由于递呈的氨基酸序列不一样,其表面多肽所形成的构象之间会有差异,因此与液相中外源BAC5单抗的亲和力也会有差别。如果大部分噬菌体与包被在板上的BAC5单抗的亲和力比较高,则不容易受外加抗体的影响。因此,大部分的噬菌体克隆在加入外源BAC5单抗后也就不显示出对原有ELISA结果的“抑制”。
, 百拇医药
BAC5单抗只与C2、C17和C29的M13噬菌体有阳性反应,对VCSM13和RPLM13呈阴性反应,阳性与阴性反应的光吸收值(A490)之比大于2.1。导致这一特异性识别的原因是因为VCSM1是辅助性噬菌体,不存在外源随机多肽的DNA序列,因此表面蛋白构象没有特异性改变,不被BAC5所识别。虽然RPLM13噬菌体重组了外来随机多肽的DNA序列,但未进行淘洗,含特异序列的噬菌体的比例必定大大地低于经过BAC5单抗反复淘洗后所获得的C2、C17和C29克隆,因此RPLM13也呈现阴性反应。
通过3次淘洗和ELISA选择后所获得的,来自C2、C17和C29克隆的噬菌体不仅能被酶标板上的BAC5单抗所俘获,还能与液相中的BAC5单抗相结合。从它们有别于来自VCSM13和RPLM13的噬菌体的特点推测,这3个克隆的噬菌体表面可能具有相似的、能被BAC5单抗所识别的抗原表位。至于它们之间所递呈的外源肽段是否具有相同的氨基酸序列,其中哪一个能作为免疫原诱导实验动物产生相应的可定位于低分化/未分化癌细胞表面的抗体,还有待进一步研究。
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(北京军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛教授、杜勇博士对本工作给予了热情的指导和帮助,特此致谢)
基金项目:广东省卫生厅科研基金资助(A1999212)
作者简介:肖锡宾(1945-),男,广东兴宁人,硕士,副研究员.
参考文献:
[1]肖锡宾,张昌卿,刘长征,等.BAC5单抗的制备及其在鼻咽癌细胞上的反应[J].中山医科大学学报,1996,17(1):75.
[2]刘北一,富 宁.噬菌体表位文库在免疫学中的应用[J].国外医学免疫学分册,1997,20(5):252.
[3]杜 勇,王海涛.应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位[J].中华微生物学和免疫学杂志,1999,19(1):4.
收稿日期:1999-09-02, http://www.100md.com
单位:中山医科大学肿瘤医院中心实验室, 广东 广州 510060
关键词:噬菌体M13;免疫学;肽库;抗体,单克隆
中山医科大学学报000302
摘 要:【目的】获得可递呈抗低分化和未分化癌细胞单克隆抗体(BAC5单抗)抗原表位的M13噬菌体克隆系。【方法】以BAC5单抗为靶抗体,对由M13噬菌体构建的随机12肽文库进行生物淘洗。用抗体竞争方法从阳性克隆中选出与BAC5单抗结合率较高的克隆系。通过ELISA方法检测BAC5单抗对上述克隆的选择性识别。【结果】经过3轮淘洗,获得的阳性克隆率为77%(35/45)。来自C2、C17和C29号克隆的噬菌体对外加BAC5单抗的结合率分别为71.6%、49.4%和64.0%,高于其它阳性克隆。BAC5单抗与来自上述3个克隆的噬菌体呈阳性反应,与来自辅助型M13株的噬菌体(VCSM13)和淘洗前的文库噬菌体(RPLM13)呈阴性反应。【结论】来自C2、C17和C29号克隆的噬菌体有可能递呈与BAC5单克隆抗相关的抗原表位。
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中图分类号:R 392.11 文献标识码:A 文章编号:1000-257X(2000)03-0165-03
The Establishment of M13 Phage Clones Displayed Epitope Recognized by BAC5 McAb
XIAO Xi-bin,ZHANG Chang-qing,LI Jing-lue,FENG Kai-tao,SUN Yun,YE Yong-zhao
(Central Labratory of Tumor Hospital,Sun Yat-sen University of Medical Sciences,Guangzhou 510060,China)
Abstract:【Objectivel】To obtain M13 phages displayed antigenic epitope recognized by BAC5 McAb,a kind of monoclonal antibody located on poorly or undifferentiated squamous carcinoma cells.【Methods】Using BAC5 McAb as selected target,a 12-mers RPL was biopanned.The positive clones were selected by antibody competition assay.The clones combincd with BAC5 McAb were demonstrated by ELISA.【Results】77%(35/45) of positive clones from eluted phage clones were obtained by 3 rounds of biopanning.The combination rates of the phages from clone C2,C17,C29 with added BAC5 McAb were 71.6%,49.4% and 64.0% respectively much higher than those of phages from other positive clones.BAC5 McAb had positive reaction to M13 phages from C2,C17,C29 clones as compared with those from helper M13 phage strain,VCSM13 and no-biopanning RPL M13 phages(P/N>2.1).【Conclusion】The M13 phages from C2,C17,C29 clones may display antigenic epitope recognized by BAC5 McAb.
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Key words:bacteriophage M13/immunology;peptide library;antibodies,monoclonal
蛋白质抗原表位分析是研究抗原的分子结构和功能,抗原-抗体反应机制的基础。研究和分离癌细胞表达的抗原表位,可以为肿瘤的血清学诊断,特异性免疫治疗和抗肿瘤疫苗设计提供重要的线索和依据。
BAC5单抗(BAC5 McAb)是本室制备的小鼠IgG1单克隆抗体[1]。其相关的抗原决定簇存在于低分化/未分化鼻咽癌细胞的表面。由于传统的抗原表位分析方法,即抗体筛选重叠(overlapping)方法,需要对分离纯化后的BAC5相关抗原进行氨基酸序列分析再合成肽后才能进行,工作比较复杂,因此有关BAC5单抗的抗原表位结构一直未能确定。
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一种新的生物技术--随机多肽文库(random peptide libraries,RPL)技术,使抗原表位分析趋向简单[2,3]。该技术可以直接用已知抗体从肽库中筛选出能与之结合的多肽。这些多肽或者是该抗体所相关的线性表位,或者是模拟(mimotope)相应抗原空间构型的构象型表位。多肽的量可随特异噬菌体的繁殖而增加。只要对携带相应抗原表位的噬菌体进行DNA序列测定,即可确定它所递呈的抗原表位的氨基酸序列。利用这一技术,我们已成功地筛选出可以和BAC5单抗相结合的M13噬菌体克隆系,为确定BAC5相关抗原表位的结构奠定了基础,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材 料
1.1.1 M13噬菌体 M13噬菌体递呈的随机12肽文库(RPL)是美国NEW ENGLAND BIOLABS公司产品,肽库的滴度(噬斑形成单位,pfu/L)为2×1016pfu/L。随机多样性为2×109。受体菌是E.coli ER2537。VCSM13为辅助性M13噬菌体。上述材料由北京军事医学科学院王海涛教授提供。RPLM13为本室扩增的递呈随机12肽的M13噬菌体,滴度为1015pfu/L。
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1.1.2 抗 体 纯化的小鼠BAC5单克隆抗体(IgG1)由本室制备,抗体浓度为0.5 g/L。辣根过氧化物酶标记的兔抗M13噬菌体IgG(1∶250)由王海涛教授提供。鼠抗M13噬菌体血清(1∶3 200)本室用RPLM13免疫Balb/C小鼠后制备。辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG(1∶800)为丹麦DAKO公司产品。
1.1.3 主要试剂 TBS(50 mol/L Tris-HCl,150 mol/L NaCl,pH 7.5),TBST含体积分数为0.1% Tween 20的TBS,邻苯二胺(OPD)为Sigma公司产品。
1.2 方 法
1.2.1 肽库的生物淘洗(biopanning) 将BAC5单抗稀释至150 mg/L,每个微孔用150 μL包被,经体积分数为3%BSA-PBS封闭。300 μL TBST缓冲液稀释10 μL肽库原液,按100 μL/孔加到微孔内,室温1 h。TBST缓冲液洗涤10次后,每孔加入100 μL 0.2 mol/L甘氨酸-盐酸(pH 2.2)室温10 min洗脱结合的噬菌体。每孔加入20 μL pH 9.2的Tris溶液中和洗脱液。测定洗下的噬菌体滴度(pfu)然后加到20 mL LB培养液中,同时加入过夜培养的E.Coli ER2537′菌1 mL, 37 ℃,250 r/min,培养5 h制备繁殖后的噬菌体,并测定滴度作为下一轮淘洗的噬菌体。每次淘洗后计算噬菌体的产量,如此反复淘洗3次。用第3次淘洗下的噬菌体10 μL感染E.coli ER2537菌铺制平板,挑取平板内的单个噬斑制备噬菌体原种。
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1.2.2 噬菌体原种的ELISA检测 依“1.2.1”法用BAC5单抗包被酶联板。经体积分数为3% BSA-PBS封闭后,加入用稀释液对倍稀释的噬菌体原种各100 μL,以E.coli ER2537菌培养上清为阴性对照,37 ℃孵育1 h后PBS洗板3次。加入1∶250稀释的辣根过氧化物酶标记兔抗M13抗体,37 ℃反应1 h,充分洗涤后用邻苯二胺显色。凡A490吸光度值大于3倍阴性对照者为阳性噬菌体原种。
1.2.3 抗体竞争试验 将50 μL从“1.2.2”中获得的阳性噬菌体原种与BAC5单抗50 μL(100 mg/L)混合放置37 ℃,1 h后,分别加到依“1.2.1”法包被了BAC5单抗的微孔中(实验孔)。每个实验孔均设置以稀释液代替外源BAC5单抗的对照孔。依“1.2.2”法进行ELISA测定,计算每个噬菌体原种在加入BAC5单抗后的抑制率。
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1.2.4 BAC5单抗对M13噬菌体的ELISA反应 选出从“1.2.3”中获得的抑制率接近/高于50%的噬菌体以及VCSM13、RPLM13噬菌体分别作为抗原,调节噬菌体密度为109 pfu/μL。各用50 μL包被微孔,每种噬菌体包被3个复孔,用体积分数为3%BSA-PBS封闭后,每孔加入50 μL BAC5单抗(100 mg/L),以小鼠抗M13血清(1∶1 000)为阳性对照。用辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG作为二抗,依“1.2.2”法进行ELISA测定。取3个复孔的均值代表每株噬菌体的光吸收值(A490),观察BAC5单抗对不同来源的噬菌体的反应。
2 结 果
2.1 M13噬菌体随机肽库的淘洗
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表1显示3次淘洗的结果,洗出的噬菌体及其相对产率依次递增。
表1 噬菌体随机多肽文库的淘洗
Table 1 The phages eluted from RPL1) by biopanning Biopanning
Phages added
(pfu)
Phages eluted
(pfu)
Yield2)
(%)
First
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4.0×1010
1.5×103
3.7×108
Second
1.2×1010
4.2×106
3.5×104
Third
5.4×1010
1.8×109
, 百拇医药
3.3×102
1) RPL:Random Peptide Libraries;2) Yield(%)=(pfu of phages eluted/pfu of phages added)×100%2.2 噬菌体原种的ELISA检测及抗体竞争试验
从第3次淘洗后铺制的平板中取出45个克隆(噬斑)进行ELISA测定,其中有阳性克隆35个占77%。经抗体竞争试验检测,其中8个能与外源BAC5单抗有不同程度结合,即加入外源BAC5单抗后,这8个克隆的噬菌体可以显示出对ELISA反应有不同程度的“抑制”作用,见表2。其中以来自C2、C17、C29克隆的噬菌体与外源BAC5 McAb的结合率(对ELISA反应的抑制率)最高,分别为71.6%、49.4%和64.0%。
表2 BAC5单抗对阳性噬菌体ELISA反应的竞争
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Table 2 Competition of positive phages between coated and added BAC5 McAb1) by ELISA Eluted
Positive
Phages
Value of A490()
Inhibition
rate2)(%)
Before competition
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After competition
(added BAC5 McAb)
C2
1.130
0.321
71.6
C12
0.827
0.484
41.5
C15
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0.895
0.534
40.3
C17
1.066
0.539
49.4
C25
0.773
0.466
39.7
C28
0.713
, 百拇医药
0.418
32.5
C29
0.951
0.342
64.0
C32
0.756
0.423
44.0
1) BAC5 McAb:A kind of monoclonal antibody located on the poorly or undifferentiated squamous carcinoma cells;2) Inhibition rate:[(Value of A490 before the Competition-Value of A490 after the competition)/Value of A490 before the Competition]×100%2.3 BAC5单抗对噬菌体的ELISA反应
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鼠抗M13血清对所有的噬菌体都有阳性反应,而BAC5单抗只对来自C2、C17、C29的噬菌体才有阳性反应,对VCSM13、RPLM13为阴性反应。阳性与阴性反应光吸收值(A490)之比(P/N)大于2.1。见表3。
表3 BAC5单抗对M13噬菌体的ELISA反应
Table 3 Reaction of BAC5 McAb to M13 phages by Elisa M13 Phages1)
(5×1010 pfu/well)
Value of A490(X)
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BAC5 McAb
100 mg/L
Mouse Sera to RPL M13
(1∶1 000)
C2
0.321
0.581
C17
0.295
0.501
C29
0.205
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0.571
VCSM13
0.089
0.316
RPLM13
0.089
0.636
1) C2,C17,C29:Positive M13 phages clone eluted by biopanning,VCSM13;Helper M13 phages strain,RPLM13:M13 phages from Random Peptide Library3 讨 论
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利用随机多肽文库技术进行抗原表位分析的关键是要从文库中筛选到能与特定抗体相结合的噬菌体克隆。本实验经过3轮淘洗后,最末1轮收获的噬菌体百分比(3.3×10-2)比初次淘洗得到的百分比(3.75×10-8)高出106。提示经淘洗→扩增→淘洗3次后,能被BAC5单抗俘获的噬菌体已得到极大的富集。将最后1轮淘洗后得到的噬菌体感染宿主菌后接种琼脂获得噬斑,经BAC5抗体捕获方法证实其阳性率达到77%(35/45),进一步支持了淘洗的效果。
由于缺少BAC5相关的抗原,我们对来自35个阳性克隆的噬菌体进行抗体俘获竞争试验。即在ELISA测定系统中加入外源BAC5单抗与包被在酶标板上的BAC5竞争特异性噬菌体。35个阳性克隆中只有来自8个克隆的噬菌体能与外源BAC5单抗结合影响ELISA测定结果,呈现出程度不等的“抑制”作用。其中来自C2、C17和C29号克隆的M13噬菌体所显示的抑制率较高,分别为71.6%、49.4%、64.0%。导致大部份阳性克隆(27/35)的噬菌体不与外源BAC5相结合的可能原因是①抗体本身:包被在酶标板上的BAC5单抗与液相中用以竞争噬菌体的外源BAC5单抗可能在构型上产生差异。由于淘洗过程是以固相的BAC5单抗作为靶抗体,所以大部分的噬菌体更适应于与包被在板上的BAC5单抗结合;②噬菌体间的差异:来自不同克隆的噬菌体,由于递呈的氨基酸序列不一样,其表面多肽所形成的构象之间会有差异,因此与液相中外源BAC5单抗的亲和力也会有差别。如果大部分噬菌体与包被在板上的BAC5单抗的亲和力比较高,则不容易受外加抗体的影响。因此,大部分的噬菌体克隆在加入外源BAC5单抗后也就不显示出对原有ELISA结果的“抑制”。
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BAC5单抗只与C2、C17和C29的M13噬菌体有阳性反应,对VCSM13和RPLM13呈阴性反应,阳性与阴性反应的光吸收值(A490)之比大于2.1。导致这一特异性识别的原因是因为VCSM1是辅助性噬菌体,不存在外源随机多肽的DNA序列,因此表面蛋白构象没有特异性改变,不被BAC5所识别。虽然RPLM13噬菌体重组了外来随机多肽的DNA序列,但未进行淘洗,含特异序列的噬菌体的比例必定大大地低于经过BAC5单抗反复淘洗后所获得的C2、C17和C29克隆,因此RPLM13也呈现阴性反应。
通过3次淘洗和ELISA选择后所获得的,来自C2、C17和C29克隆的噬菌体不仅能被酶标板上的BAC5单抗所俘获,还能与液相中的BAC5单抗相结合。从它们有别于来自VCSM13和RPLM13的噬菌体的特点推测,这3个克隆的噬菌体表面可能具有相似的、能被BAC5单抗所识别的抗原表位。至于它们之间所递呈的外源肽段是否具有相同的氨基酸序列,其中哪一个能作为免疫原诱导实验动物产生相应的可定位于低分化/未分化癌细胞表面的抗体,还有待进一步研究。
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(北京军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛教授、杜勇博士对本工作给予了热情的指导和帮助,特此致谢)
基金项目:广东省卫生厅科研基金资助(A1999212)
作者简介:肖锡宾(1945-),男,广东兴宁人,硕士,副研究员.
参考文献:
[1]肖锡宾,张昌卿,刘长征,等.BAC5单抗的制备及其在鼻咽癌细胞上的反应[J].中山医科大学学报,1996,17(1):75.
[2]刘北一,富 宁.噬菌体表位文库在免疫学中的应用[J].国外医学免疫学分册,1997,20(5):252.
[3]杜 勇,王海涛.应用噬菌体随机肽库研究丙型肝炎病毒核心蛋白B细胞抗原表位[J].中华微生物学和免疫学杂志,1999,19(1):4.
收稿日期:1999-09-02, http://www.100md.com