邻苯三酚—鲁米诺发光体系测定SOD活性
作者：徐 靖 杨秀岑
单位：徐 靖 郧阳医学院基础化学教研室；杨秀岑 华西医科大学药学院应用化学研究室
关键词：酚类；鲁米诺；超氧化物歧化酶；化学发光
郧阳医学院学报990203摘 要 目的：建立一种测定SOD活力的方法。方法：利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化—鲁米诺化学发光体系测SOD活性。结果：本方法一个活力单位(抑制50%发光程度)的SOD量为16 ng/ml。本法测定SOD浓度范围为5～150 ng/ml，线性回归方程的相关系数：r=0.998。检测限为1 ng。重复性：批内C.V.=1.0%，批间(隔7d)C.V.=5.1%。结论：本法具有简易、灵敏、试剂价廉等优点，特别适宜于植物样品的SOD活力测定。
中国图书资料分类法分类号 O621.25
, http://www.100md.com Chemiluminescence Assay for SOD Activity Using
Alkaline Pyrogallol as Superoxide Anion-Generating System
Xu Jing1,Yang Xiuchen2(1 Yunyang Medical College,Shiyan City 2 West Chian University of Medicine Science)
Abstract Objective:This article is to develop a simple sensitive method of SOD assay.Methods:The SOD activity was measured with the luminol chemiluminescence of superoxide anion generated by the autoxidation of alkaline pyrogallol.Results:Fifty percent inhibition,corresponding to one unit of the enzyme,was produced by 16 ng of pure SOD.SOD was determined in the range of 5～150 ng with a correlation coefficient of 0.998 for the linear regression equation by transforming SOD value into logarithms and a limit of detection of 1 ng of SOD.The coefficient of variance is 1.0%for the sample from an assay and 5.1%for the sample from an individual estimated at two different times (over a one-week interval).Conclusion:This method is simple,sensitive and cheap.It is especially appropriate for the SOD assay of botanical samples.
, 百拇医药
Key Words Phloroglucinol;Luminol;Superoxide Dismutase;Chemiluminescence
超氧化物歧化酶(简称SOD)能够催化以下歧化反应：
可依此测定SOD活性。SOD活力测定方法已有大量研究和报导[1～5]，但仍需寻求简便、快速、准确、灵敏的方法。本文利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化为O2-.发生系统，O-2.与化学发光剂鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)反应，使之激发当返回基态时，可发出化学冷光。当有SOD存在时，SOD使O2-.发生酶促歧化反应，从而清除O2-.，抑制发光，在一定范围内，SOD活力越强，发光被抑制的程度越高。据此，可测定SOD活力。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 试剂
鲁米诺为Sigma公司产品，用0.1 mol/L Na2CO3溶解后配成1 mmol/L水溶液。邻苯三酚(AR级)，为遵义市第二化工厂产品，以1 mmol/L HCl配成0.01 mol/L溶液，保存于4 ℃冰箱中，临用前以重蒸水稀释至1.56×104 mol/L。pH=10.20,0.05 mol/L的NaCO3-NaHCO3缓冲溶液(含0.1 mmol/L EDTA),用前现配，以pH计较准pH至10.20，并与鲁米诺以2:1(V：V)混合。SOD标准品由华西医科大学药学院药理教研室提供，原液300,000 u/ml，以0.05 mol/L,pH=7.8的磷酸缓冲溶液(含0.1 mol/L EDTA)稀释至一定浓度。
1.2 方法
, 百拇医药
化学发光体系及发光测量：化学发光测量用LKB Wallac 1250型发光光度计。样品管为高6 cm，内径10 mm的无色透明硬质玻璃管。测定时先注入10 μl一定浓度的SOD标准溶液或样口粗提酶(作空白对照时加0.05 mol/L pH=7.8的磷酸缓冲溶液)，然后注入50 μl 1.56×10-4 mol/L邻苯三酚，最后注入鲁米诺和碳酸缓冲溶液混合液940 μl活动反应，立即开动记录仪，测定发光峰值。
SOD活力测定：将SOD用0.05 mol/L，pH=7.8磷酸缓冲溶液配制成不同浓度的酶溶液；样品以同一缓冲溶液制备匀浆，4 ℃、1，000g下离心，取上清液待测。当上述发光体系中有SOD存在时，发光强度下降，以空白的发光强度值为100%，计算加入SOD后抑制发光的百分数，以此对SOD浓度的对数值作直线回归方程，求出抑制50%发光强度时的SOD浓度(C50，单位为ng/ml)，定为一个活力单位；样品中SOD的单位活力可先由回归方程求出C样后再通过下式计算：
, http://www.100md.com
样品SOD单位活力(u/g鲜样或u/ml样品)
2 结果与讨论
2.1 邻苯三酚—鲁米诺体系发光强度曲线
见附图。
附图 发光强度曲线(操作条件见本文内容)
附图中曲线a、b、c分别代表SOD浓度为0、15、45 ng/ml时的发光强度曲线。反应混合物为：10 μl×10-4 mol/L邻苯三酚，940 μl鲁米诺与碳酸缓冲溶液的混合液，pH=10.20。抑制率在0%～88%范围内，本体系能在10～60 s内达到峰值，测定方便、快速。
, http://www.100md.com
2.2 标准SOD抑制率线性回归方程及样品测定结果
用本法测定SOD标准品抑制率结果见表1。每个数据取三次测定的平均值。
表1 SOD标准品抑制发光的百分率 SOD浓度(ng/ml)
5
7
10
15
20
50
100
150
, http://www.100md.com 抑制率(%)
27.2
36.0
42.6
49.5
54.3
69.8
81.5
87.8
测定范围:5～150 ng/ml
线性回归:y=1.5896+40.0122SOD
r=0.988 n=8
, http://www.100md.com
y代表抑制发光百分率,SOD代表SOD浓度。
由回归方程计算C50=16 ng/ml，检测限D.L.=1.0 ng
用本法测定不同植物样品,结果见表2表2 样品测定(用单位活力表示) 样品
测定值(μ/g)
样品
测定值(μ/g)
小白菜
62±2.4
黄瓜
70±2.0
西瓜皮
, 百拇医药
13±1.6
黄花菜
146±2.6
西瓜肉
14±3.2
麦冬
16±1.6
2.3 发光剂鲁米诺浓度对发光强度的影响
固定邻苯三酚浓度为1.56×10-4 mol/L,pH值为10.20,改变鲁米诺浓度,发光强度随之改变。当鲁米诺浓度在0.5×10-4～3.13×10-4 mol/L范围内变化时,发光值随鲁米诺浓度增大呈直线上升,当鲁米诺浓度超过3.13×10-4 mol/L时,发光值反而降低。见表3表3 鲁米诺浓度与发光强度的关系 浓度(×10-4mol/L)
, http://www.100md.com
0.5
0.94
1.88
3.13
3.76
7.52
发光强度(mV)
85
144
320
511
342
307
, http://www.100md.com
2.4 邻苯三酚浓度对测定的影响
邻苯三酚浓度既影响发光强度又影响SOD对发光的抑制,对测定灵敏度有很大影响。
固定鲁米诺浓度为3.13×10-4mol/L,pH为10.20,改变邻苯三酚浓度,在1.0×10-4～10.0×10-4mol/L范围内,发光强度随邻苯三酚浓度地增加而呈直线上线上升;邻苯三酚浓度超过20.0×10-4mol/L时，鲁米诺被迅速消耗，发光值衰减很快，不易捕捉到峰值。不同邻苯三酚浓度下的发光强度值见表4，表中C代表邻苯三酚浓度。表4 不同邻苯三酚浓度下的发光强度 C(×10-4mol/L)
1.0
1.56
3.13
, 百拇医药
6.25
10.0
40.0
发光强度(mV)
395
511
750
1168
1700
2332
邻苯三酚自氧化产生的O2-.既可自发歧化亦可被SOD酶促歧化。所以，SOD是在同自发歧化反应竞争O2-.，O2-.稳态浓度越低，SOD竞争能力越强，测定的灵敏度就越高[2]。在反应系统中加入相同量的SOD，邻苯三酚浓度越低，抑制百分数越高。邻苯三酚浓度对测定灵敏度的影响还可以从不同邻苯三酚浓度上C50的值反映出来(见表5，其中C代表邻苯三酚浓度)。虽然邻苯三酚浓度低时灵敏度有所提高，但若太低则发光值也低，测定的相对误差增大。本体系选择其浓度 1.56×10-4mol/L,发光强度适宜，测定灵敏度也较高。在实际测定中可根据需要选择不同的邻苯三酚浓度。表5 邻苯三酚浓度对C50和抑制率的影响 C(×10-4mol/L)
, 百拇医药
1.56
3.13
6.25
C50(ng/ml)
16
38
84
抑制率*(%)
54.3
32.8
9.8
注：* SOD浓度为20 ng/ml。
, 百拇医药
2.5 pH值对测定的影响
pH值既影响鲁米诺发光,又影响邻苯三酚自氧化速度,也是影响测定灵敏度的一个因素。pH值愈高,鲁米诺发光愈强。当pH在9.69～10.60之间变化时,发光值从89.2 mV变到2，336 mV,发光强度和pH的关系为:mV=-9.4746+1.1803pH
n=5 r=0.999
可见pH值对发光强度影响十分显著。同时，pH值也影响邻苯三酚的自氧化速率。pH值越高，邻苯三酚自氧化速率越高[3]，O-2.的稳态浓度也越高，会使SOD竞争力下降，降低测定的灵敏度。根据条件试验，我们选择pH为10.20的体系，其稳定性，灵敏度均较好。由于pH值对测定的影响十分显著，故每次测定前必须在精密酸度计上校准碳酸缓冲溶液的pH值。
, 百拇医药
2.6 重复性
我们分别测定了本法的空白发光值、同一样品同批测定抑制率以及同一样品相隔7d分三批测定抑制率的重复性，结果见表6。
表6 重复性测定结果
n
±s(mV)
CV(%)
空白发光值
9
511±4.6
0.9
样品抑制率批内
, 百拇医药
10
39%±0.4%
1.0
样品抑制率批间
20
41%±2.1%
5.1
2.7 关于计算SOD单位活力的方法
许多文献[2,3]都是按照如下或类似公式计算样品中SOD的单位活力：单位活力(μ/g)
这样就必须保证SOD浓度与抑制率成直线关系否则就会产生很大误差。而通常与抑制率成直线关系的SOD浓度范围很小,因而大大缩小了测定范围,此外,当采用不同的测定条件时,用此公式计算会得到不同结果.如在反应体系中加入相同量的SOD(20 ng/ml),当邻苯三酚浓度分别为1.56×10-4 mol/L和3.13×10-4 mol/L时,抑制率分别为54.3%和23.8%,代入上述公式计算所得结果相差二倍多(见表5)。本文用实测浓度民C50之比作为样品单位活力，既可避免计算结果随条件不同而改变，也更符合单位活力的含义。同时，标准曲线采用抑制率与SOD浓度对数值的回归方程，扩大了线性范围，使测定方法更加方便、实用。
, http://www.100md.com
本法采用非用酶O2-.产生系统，具有试剂稳定、价廉等优点，廉有化学发光法的高灵敏度。检测SOD的灵敏度优于邻苯三酚自氧化分光光度法[3]，稳定性优于O2产生系统如黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系[5]。
参考文献
1 T P Huu,C Marquetty,C Pasquier, et al.Luminol Assay for Morcrodetermination of Super-oxide Dismutase Activity.Anal Biochem,1984,142:467
2 郭蔼光，王振镒.邻苯三酚自氧化—化学发光法测SOD活性.植物生理学通讯，1989,3：54
3 黄维嘉，陈宏础，黄天禄.邻苯三酚自氧化抑制法测定人红细胞超氧化物歧化酶.中华医学检验杂志，1989,12(4):206
4 Yi Sun,Larry W Oberley，Ying Li.A simple method for clinical assay of superoxide dismutase.Clin Chem,1988,34(3):497
5 张尔贤，肖湘.应用XOD-X-Luminol发光体系检测SOD活性.植物生理学通讯，1992,28(3):214
(1999-01-09 收稿), http://www.100md.com
单位：徐 靖 郧阳医学院基础化学教研室；杨秀岑 华西医科大学药学院应用化学研究室
关键词：酚类；鲁米诺；超氧化物歧化酶；化学发光
郧阳医学院学报990203摘 要 目的：建立一种测定SOD活力的方法。方法：利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化—鲁米诺化学发光体系测SOD活性。结果：本方法一个活力单位(抑制50%发光程度)的SOD量为16 ng/ml。本法测定SOD浓度范围为5～150 ng/ml，线性回归方程的相关系数：r=0.998。检测限为1 ng。重复性：批内C.V.=1.0%，批间(隔7d)C.V.=5.1%。结论：本法具有简易、灵敏、试剂价廉等优点，特别适宜于植物样品的SOD活力测定。
中国图书资料分类法分类号 O621.25
, http://www.100md.com Chemiluminescence Assay for SOD Activity Using
Alkaline Pyrogallol as Superoxide Anion-Generating System
Xu Jing1,Yang Xiuchen2(1 Yunyang Medical College,Shiyan City 2 West Chian University of Medicine Science)
Abstract Objective:This article is to develop a simple sensitive method of SOD assay.Methods:The SOD activity was measured with the luminol chemiluminescence of superoxide anion generated by the autoxidation of alkaline pyrogallol.Results:Fifty percent inhibition,corresponding to one unit of the enzyme,was produced by 16 ng of pure SOD.SOD was determined in the range of 5～150 ng with a correlation coefficient of 0.998 for the linear regression equation by transforming SOD value into logarithms and a limit of detection of 1 ng of SOD.The coefficient of variance is 1.0%for the sample from an assay and 5.1%for the sample from an individual estimated at two different times (over a one-week interval).Conclusion:This method is simple,sensitive and cheap.It is especially appropriate for the SOD assay of botanical samples.
, 百拇医药
Key Words Phloroglucinol;Luminol;Superoxide Dismutase;Chemiluminescence
超氧化物歧化酶(简称SOD)能够催化以下歧化反应：
可依此测定SOD活性。SOD活力测定方法已有大量研究和报导[1～5]，但仍需寻求简便、快速、准确、灵敏的方法。本文利用邻苯三酚在碱性条件下自氧化为O2-.发生系统，O-2.与化学发光剂鲁米诺(3-氨基邻苯二甲酰肼)反应，使之激发当返回基态时，可发出化学冷光。当有SOD存在时，SOD使O2-.发生酶促歧化反应，从而清除O2-.，抑制发光，在一定范围内，SOD活力越强，发光被抑制的程度越高。据此，可测定SOD活力。
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1 材料与方法
1.1 试剂
鲁米诺为Sigma公司产品，用0.1 mol/L Na2CO3溶解后配成1 mmol/L水溶液。邻苯三酚(AR级)，为遵义市第二化工厂产品，以1 mmol/L HCl配成0.01 mol/L溶液，保存于4 ℃冰箱中，临用前以重蒸水稀释至1.56×104 mol/L。pH=10.20,0.05 mol/L的NaCO3-NaHCO3缓冲溶液(含0.1 mmol/L EDTA),用前现配，以pH计较准pH至10.20，并与鲁米诺以2:1(V：V)混合。SOD标准品由华西医科大学药学院药理教研室提供，原液300,000 u/ml，以0.05 mol/L,pH=7.8的磷酸缓冲溶液(含0.1 mol/L EDTA)稀释至一定浓度。
1.2 方法
, 百拇医药
化学发光体系及发光测量：化学发光测量用LKB Wallac 1250型发光光度计。样品管为高6 cm，内径10 mm的无色透明硬质玻璃管。测定时先注入10 μl一定浓度的SOD标准溶液或样口粗提酶(作空白对照时加0.05 mol/L pH=7.8的磷酸缓冲溶液)，然后注入50 μl 1.56×10-4 mol/L邻苯三酚，最后注入鲁米诺和碳酸缓冲溶液混合液940 μl活动反应，立即开动记录仪，测定发光峰值。
SOD活力测定：将SOD用0.05 mol/L，pH=7.8磷酸缓冲溶液配制成不同浓度的酶溶液；样品以同一缓冲溶液制备匀浆，4 ℃、1，000g下离心，取上清液待测。当上述发光体系中有SOD存在时，发光强度下降，以空白的发光强度值为100%，计算加入SOD后抑制发光的百分数，以此对SOD浓度的对数值作直线回归方程，求出抑制50%发光强度时的SOD浓度(C50，单位为ng/ml)，定为一个活力单位；样品中SOD的单位活力可先由回归方程求出C样后再通过下式计算：
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样品SOD单位活力(u/g鲜样或u/ml样品)
2 结果与讨论
2.1 邻苯三酚—鲁米诺体系发光强度曲线
见附图。
附图 发光强度曲线(操作条件见本文内容)
附图中曲线a、b、c分别代表SOD浓度为0、15、45 ng/ml时的发光强度曲线。反应混合物为：10 μl×10-4 mol/L邻苯三酚，940 μl鲁米诺与碳酸缓冲溶液的混合液，pH=10.20。抑制率在0%～88%范围内，本体系能在10～60 s内达到峰值，测定方便、快速。
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2.2 标准SOD抑制率线性回归方程及样品测定结果
用本法测定SOD标准品抑制率结果见表1。每个数据取三次测定的平均值。
表1 SOD标准品抑制发光的百分率 SOD浓度(ng/ml)
5
7
10
15
20
50
100
150
, http://www.100md.com 抑制率(%)
27.2
36.0
42.6
49.5
54.3
69.8
81.5
87.8
测定范围:5～150 ng/ml
线性回归:y=1.5896+40.0122SOD
r=0.988 n=8
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y代表抑制发光百分率,SOD代表SOD浓度。
由回归方程计算C50=16 ng/ml，检测限D.L.=1.0 ng
用本法测定不同植物样品,结果见表2表2 样品测定(用单位活力表示) 样品
测定值(μ/g)
样品
测定值(μ/g)
小白菜
62±2.4
黄瓜
70±2.0
西瓜皮
, 百拇医药
13±1.6
黄花菜
146±2.6
西瓜肉
14±3.2
麦冬
16±1.6
2.3 发光剂鲁米诺浓度对发光强度的影响
固定邻苯三酚浓度为1.56×10-4 mol/L,pH值为10.20,改变鲁米诺浓度,发光强度随之改变。当鲁米诺浓度在0.5×10-4～3.13×10-4 mol/L范围内变化时,发光值随鲁米诺浓度增大呈直线上升,当鲁米诺浓度超过3.13×10-4 mol/L时,发光值反而降低。见表3表3 鲁米诺浓度与发光强度的关系 浓度(×10-4mol/L)
, http://www.100md.com
0.5
0.94
1.88
3.13
3.76
7.52
发光强度(mV)
85
144
320
511
342
307
, http://www.100md.com
2.4 邻苯三酚浓度对测定的影响
邻苯三酚浓度既影响发光强度又影响SOD对发光的抑制,对测定灵敏度有很大影响。
固定鲁米诺浓度为3.13×10-4mol/L,pH为10.20,改变邻苯三酚浓度,在1.0×10-4～10.0×10-4mol/L范围内,发光强度随邻苯三酚浓度地增加而呈直线上线上升;邻苯三酚浓度超过20.0×10-4mol/L时，鲁米诺被迅速消耗，发光值衰减很快，不易捕捉到峰值。不同邻苯三酚浓度下的发光强度值见表4，表中C代表邻苯三酚浓度。表4 不同邻苯三酚浓度下的发光强度 C(×10-4mol/L)
1.0
1.56
3.13
, 百拇医药
6.25
10.0
40.0
发光强度(mV)
395
511
750
1168
1700
2332
邻苯三酚自氧化产生的O2-.既可自发歧化亦可被SOD酶促歧化。所以，SOD是在同自发歧化反应竞争O2-.，O2-.稳态浓度越低，SOD竞争能力越强，测定的灵敏度就越高[2]。在反应系统中加入相同量的SOD，邻苯三酚浓度越低，抑制百分数越高。邻苯三酚浓度对测定灵敏度的影响还可以从不同邻苯三酚浓度上C50的值反映出来(见表5，其中C代表邻苯三酚浓度)。虽然邻苯三酚浓度低时灵敏度有所提高，但若太低则发光值也低，测定的相对误差增大。本体系选择其浓度 1.56×10-4mol/L,发光强度适宜，测定灵敏度也较高。在实际测定中可根据需要选择不同的邻苯三酚浓度。表5 邻苯三酚浓度对C50和抑制率的影响 C(×10-4mol/L)
, 百拇医药
1.56
3.13
6.25
C50(ng/ml)
16
38
84
抑制率*(%)
54.3
32.8
9.8
注：* SOD浓度为20 ng/ml。
, 百拇医药
2.5 pH值对测定的影响
pH值既影响鲁米诺发光,又影响邻苯三酚自氧化速度,也是影响测定灵敏度的一个因素。pH值愈高,鲁米诺发光愈强。当pH在9.69～10.60之间变化时,发光值从89.2 mV变到2，336 mV,发光强度和pH的关系为:mV=-9.4746+1.1803pH
n=5 r=0.999
可见pH值对发光强度影响十分显著。同时，pH值也影响邻苯三酚的自氧化速率。pH值越高，邻苯三酚自氧化速率越高[3]，O-2.的稳态浓度也越高，会使SOD竞争力下降，降低测定的灵敏度。根据条件试验，我们选择pH为10.20的体系，其稳定性，灵敏度均较好。由于pH值对测定的影响十分显著，故每次测定前必须在精密酸度计上校准碳酸缓冲溶液的pH值。
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2.6 重复性
我们分别测定了本法的空白发光值、同一样品同批测定抑制率以及同一样品相隔7d分三批测定抑制率的重复性，结果见表6。
表6 重复性测定结果
n
±s(mV)CV(%)
空白发光值
9
511±4.6
0.9
样品抑制率批内
, 百拇医药
10
39%±0.4%
1.0
样品抑制率批间
20
41%±2.1%
5.1
2.7 关于计算SOD单位活力的方法
许多文献[2,3]都是按照如下或类似公式计算样品中SOD的单位活力：单位活力(μ/g)
这样就必须保证SOD浓度与抑制率成直线关系否则就会产生很大误差。而通常与抑制率成直线关系的SOD浓度范围很小,因而大大缩小了测定范围,此外,当采用不同的测定条件时,用此公式计算会得到不同结果.如在反应体系中加入相同量的SOD(20 ng/ml),当邻苯三酚浓度分别为1.56×10-4 mol/L和3.13×10-4 mol/L时,抑制率分别为54.3%和23.8%,代入上述公式计算所得结果相差二倍多(见表5)。本文用实测浓度民C50之比作为样品单位活力，既可避免计算结果随条件不同而改变，也更符合单位活力的含义。同时，标准曲线采用抑制率与SOD浓度对数值的回归方程，扩大了线性范围，使测定方法更加方便、实用。
, http://www.100md.com
本法采用非用酶O2-.产生系统，具有试剂稳定、价廉等优点，廉有化学发光法的高灵敏度。检测SOD的灵敏度优于邻苯三酚自氧化分光光度法[3]，稳定性优于O2产生系统如黄嘌呤—黄嘌呤氧化酶体系[5]。
参考文献
1 T P Huu,C Marquetty,C Pasquier, et al.Luminol Assay for Morcrodetermination of Super-oxide Dismutase Activity.Anal Biochem,1984,142:467
2 郭蔼光，王振镒.邻苯三酚自氧化—化学发光法测SOD活性.植物生理学通讯，1989,3：54
3 黄维嘉，陈宏础，黄天禄.邻苯三酚自氧化抑制法测定人红细胞超氧化物歧化酶.中华医学检验杂志，1989,12(4):206
4 Yi Sun,Larry W Oberley，Ying Li.A simple method for clinical assay of superoxide dismutase.Clin Chem,1988,34(3):497
5 张尔贤，肖湘.应用XOD-X-Luminol发光体系检测SOD活性.植物生理学通讯，1992,28(3):214
(1999-01-09 收稿), http://www.100md.com