重症肌无力患者胸腺提取液电泳及其活性分析*
作者：阮丽荣 杜英 张清勇 李富广 王东升
单位：阮丽荣 杜英 李富广 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州450052)；张清勇(河南医科大学第二附属医院胸外科 郑州450003)
关键词：重症肌无力；胸腺提取液；SDS-PAGE电泳；免疫活性；淋巴细胞
河南医科大学学报000115摘 要：目的：深入探讨胸腺在重症肌无力(MG)发病中的作用。方法：采用SDS-PAGE电泳对MG患者胸腺提取液进行分析，并用MTT法研究了胸腺提取液对外周血单个核细胞和胸腺细胞增殖的影响。结果：30%MG患者胸腺提取液中存在异常蛋白，其相对分子质量小于14400，而在先天性心脏病患者胸腺细胞培养上清中未见这种蛋白。异常蛋白组MG患者的胸腺提取液对正常人外周血单个核细胞(PBMC)增殖有显著的抑制作用，与非自身免疫病患者相比，差异有显著性(P<0.01)，与其他非异常蛋白组MG患者相比差异有显著性(P<0.05)，但对胸腺细胞的增殖未见显著差异。结论：MG患者免疫功能的异常与胸腺提取液中小分子异常蛋白的存在有关，与MG的发病有关。
, http://www.100md.com
中图分类号：R746.1
The immunology competence and electrophoresis of thymus extract of patients with Myasthenia Gravis
RUAN Lirong DU Ying LI Fuguang WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
ZHANG Qingyong
(Department of Surgery, the Second Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450003)
, 百拇医药
Abstract：Aim: To investigate the role of thymus of patients with myasthenia gravis(MG). Methods: The thymus extract was prepared from thymus of patients with MG, the protein was assayed with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Effects of thymus extract on the proliferation of thymocytes and peripheral blood mononuclear cell(PBMC) were evaluated with MTT assay. Results: There was abnormal protein, which molecular weight was less than 14 400 in the thymus extract of 30% patients with MG. The inhibition of thymus extract containing abnormal protein on proliferation of PHA-active normal human PBMC was obviously increased, and compared with that of other patients with MG, there was remarkable difference(P<0.05).Conclusion: The thymus extract of patients with MG possesses obvious abnormality, the abnormal protein in thymus extract of patients with MG is accociated with etiology of MG.
, 百拇医药
Key words：Myasthenia Gravis; thymus extract; SDS-PAGE;immunocompetence; lymphocytes▲
重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是主要累及神经肌肉接头处乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病，多数伴有胸腺异常(胸腺增生、胸腺瘤或胸腺萎缩)[1] ,但胸腺在MG发病中的作用机制尚不完全清楚。为探讨胸腺在MG发病中的作用，作者用MG患者手术摘除的胸腺制备胸腺提取液和胸腺细胞培养上清液，进行SDS-PAGE电泳，并观察了胸腺提取液对PHA 刺激的正常人外周血单个核细胞(PBMC)及胸腺细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象 MG患者40例，其中胸腺增生型29例，胸腺瘤7例，胸腺萎缩型4例；先天性心脏病患者12例为对照。
, 百拇医药
1.2 胸腺提取液及胸腺细胞培养上清液的制备 取MG患者手术摘除的胸腺实质1 g，剪碎，加入5 ml无菌蒸馏水，于玻璃匀浆器中研磨制成匀浆，2 000 r/min离心，取上清液即为胸腺提取液，-20℃ 冻存备用。另取少量胸腺组织剪碎后过80目不锈钢网，制备胸腺细胞悬液，用含体积分数为10%新生牛血清的1640液调细胞浓度为2×105/ml，加PHA(Sigma产品，终浓度为100 mg/L)培养48 h，离心留上清液。
1.3 SDS-PAGE电泳分析 取10 μl胸腺提取液或胸腺细胞培养上清液，与10 μl 2×SDS加样缓冲液混匀，煮沸3 min，上样于120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶，每样品孔中加样品15 μl，用8 V/cm 的电压进行积层胶电泳，当蛋白进入分离胶后提高电压至15 V/cm，继续电泳1～2 h。考马斯亮蓝染色。蛋白电泳试剂和蛋白质标准品均购自华美生物工程公司。
1.4 淋巴细胞增殖实验 将含PHA(Sigma产品,终浓度为100 mg/L)的正常人胸腺细胞悬液及PBMC分别加入96孔细胞培养板，每孔100 μl，并加入20 μl胸腺提取液，设3个复孔，同时设不加胸腺提取液对照孔，体积分数为5% CO2培养箱中培养44 h，加入MTT继续培养4 h，于酶联检测仪测D(570 nm)值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=(1-加胸腺提取液孔D(570nm)值/无胸腺提取液孔D(570nm)值)×100%
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2 结果
2.1 胸腺提取液及胸腺细胞培养上清液的SDS-PAGE电泳 电泳发现，40例MG患者胸腺提取液中有12例发现异常蛋白，占MG患者的30%， 其相对分子质量小于14400，而在12例先天性心脏病患者胸腺提取液中无1例发现这种蛋白，说明重症肌无力患者胸腺提取液与对照组有显著差异，见图1。 胸腺细胞培养上清液中未发现这种蛋白。
图1 胸腺提取液SDS-PAGE电泳
10为蛋白标准对照，1，2，13，14为正常对照，3，4，8，9，11，12为有小分子异常蛋白，5，6，7，15，16，17，18，19为无异常蛋白
2.2 胸腺提取液对PHA刺激的正常人PBMC及胸腺细胞增殖的影响 异常小分子蛋白的胸腺提取液对PHA刺激的正常人PBMC及胸腺细胞的增殖有显著的抑制作用，与正常对照相比差异有显著性(P<0.01)，与无异常蛋白MG患者相比差异有显著性(P< 0.05)；但各种类型的MG胸腺提取液对胸腺细胞增殖的影响未见显著差异。见表1。
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表1 胸腺提取液对正常人PBMC及胸腺细胞增殖的影响% 组别
n
PBMC增殖抑制率
胸腺细胞增殖抑制率
非自身免疫病对照
12
46.32±13.50
42.51±11.23
异常蛋白组MG
12
73.33±21.31*
, 百拇医药
37.86±16.33
非异常蛋白组MG
28
58.76±17.21
35.25±17.62
*与对照组相比P<0.01，与非异常蛋白组相比P<0.05
3 讨论
重症肌无力属自身免疫病，其发病与胸腺有关已成共识，胸腺摘除治疗重症肌无力也成为目前主要治疗手段之一。胸腺摘除后MG患者外周血T细胞亚群有所改善[2]，自身抗体(AchRab)也有降低[3，4]。 但迄今为止，胸腺在重症肌无力发病中的作用尚不完全清楚。作者发现，约30%MG患者的胸腺提取液中存在相对分子质量小于14 400的异常蛋白，而在胸腺细胞培养上清液中未见这种蛋白，说明此蛋白极有可能是由胸腺基质细胞产生。为探讨胸腺提取液中异常蛋白与MG发病的关系，作者根据胸腺提取液中是否存在这一异常蛋白进行分组研究，发现蛋白异常组的胸腺提取液对PBMC的增殖有显著的抑制作用，且与正常对照组相比差异有显著性，与非异常蛋白组相比差异也有显著性。结合临床资料，统计研究发现，异常蛋白组在胸腺摘除后的疗效达到90%，明显高于其他的MG患者，提示这种蛋白可能与MG的发病过程有关。研究中还发现MG 胸腺提取液对正常人胸腺细胞的增殖与对照组相比未见显著差异，其原因可能是正常人胸腺细胞80%左右是CD4+、CD8+ 的双阳性细胞，其细胞膜上没有异常蛋白的相应受体，因此出现胸腺提取液对PBMC和胸腺细胞作用不一致的现象。吕良等[5]也报道，在MG患者血清中发现相对分子质量14 000的非免疫球蛋白组分，它对非自身血清的AchR、PsmR与相应抗体的反应有增强作用，说明血清中的14 000蛋白参与了自身抗体的致病过程。作者在MG患者胸腺提取液中发现的相对分子质量小于14 400的异常蛋白是否也有类似作用，与血清中的14 000 蛋白有何关系，尚待进一步探讨，胸腺提取液中这一小分子异常蛋白与MG发病机制的具体关系以及与自身抗体(AchRab)产生的影响尚待深入研究。
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从本研究结果可见，重症肌无力患者胸腺提取液中的异常小分子蛋白与疾病的发生有潜在关系，对这种蛋白的进一步分离研究，尤其是利用基因工程技术了解其产生和表达规律，将有望在重症肌无力的研究中有所突破。■
*河南省教委自然科学研究基金资助项目 97310007
作者简介：杜英，女，37岁，大学本科，研究方向：自身免疫病
参考文献：
[1]Moulian N, Bidanlt J, Truffanlt F, et al. Thymocyte Fas expression is dysregulated in myasthenia gravis patients with anti-acetylcholine receptor antibody. Blood, 1997,89(9):3 287
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[2]黄煜敏，许贤豪，林嘉友，等.胸腺摘除对重症肌无力患者T细胞亚群的影响.中华微生物学与免疫学杂志，1996，16(2)：92
[3]陈平，徐文桢，龚其美.重症肌力无力血清sIL-2R和AchRad水平变化的研究.上海免疫学杂志，1995，15(3)：138
[4]Kuks JB, Oosterhuis HJ, Limburg PC. Antibodies to acetylcholine receptors in myasthenia gravis. In vitro synthesis by peripheral blood lymphocytes before and after thymectory. Clin Exp lmmunol, 1992,87:249
[5]吕良，乔健，吕传真.重症肌无力患者血清非Ig成分对突触前、后膜受体及其相应抗体反应的影响.上海免疫学杂志，1998，8(2)：81
(1999-03-31收稿), 百拇医药
单位：阮丽荣 杜英 李富广 王东升(河南医科大学微生物学与免疫学教研室 郑州450052)；张清勇(河南医科大学第二附属医院胸外科 郑州450003)
关键词：重症肌无力；胸腺提取液；SDS-PAGE电泳；免疫活性；淋巴细胞
河南医科大学学报000115摘 要：目的：深入探讨胸腺在重症肌无力(MG)发病中的作用。方法：采用SDS-PAGE电泳对MG患者胸腺提取液进行分析，并用MTT法研究了胸腺提取液对外周血单个核细胞和胸腺细胞增殖的影响。结果：30%MG患者胸腺提取液中存在异常蛋白，其相对分子质量小于14400，而在先天性心脏病患者胸腺细胞培养上清中未见这种蛋白。异常蛋白组MG患者的胸腺提取液对正常人外周血单个核细胞(PBMC)增殖有显著的抑制作用，与非自身免疫病患者相比，差异有显著性(P<0.01)，与其他非异常蛋白组MG患者相比差异有显著性(P<0.05)，但对胸腺细胞的增殖未见显著差异。结论：MG患者免疫功能的异常与胸腺提取液中小分子异常蛋白的存在有关，与MG的发病有关。
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中图分类号：R746.1
The immunology competence and electrophoresis of thymus extract of patients with Myasthenia Gravis
RUAN Lirong DU Ying LI Fuguang WANG Dongsheng
(Department of Microbiology and Immunology, Henan Medical University, Zhengzhou 450052)
ZHANG Qingyong
(Department of Surgery, the Second Affiliated Hospital, Henan Medical University, Zhengzhou 450003)
, 百拇医药
Abstract：Aim: To investigate the role of thymus of patients with myasthenia gravis(MG). Methods: The thymus extract was prepared from thymus of patients with MG, the protein was assayed with SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Effects of thymus extract on the proliferation of thymocytes and peripheral blood mononuclear cell(PBMC) were evaluated with MTT assay. Results: There was abnormal protein, which molecular weight was less than 14 400 in the thymus extract of 30% patients with MG. The inhibition of thymus extract containing abnormal protein on proliferation of PHA-active normal human PBMC was obviously increased, and compared with that of other patients with MG, there was remarkable difference(P<0.05).Conclusion: The thymus extract of patients with MG possesses obvious abnormality, the abnormal protein in thymus extract of patients with MG is accociated with etiology of MG.
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Key words：Myasthenia Gravis; thymus extract; SDS-PAGE;immunocompetence; lymphocytes▲
重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)是主要累及神经肌肉接头处乙酰胆碱受体的自身免疫性疾病，多数伴有胸腺异常(胸腺增生、胸腺瘤或胸腺萎缩)[1] ,但胸腺在MG发病中的作用机制尚不完全清楚。为探讨胸腺在MG发病中的作用，作者用MG患者手术摘除的胸腺制备胸腺提取液和胸腺细胞培养上清液，进行SDS-PAGE电泳，并观察了胸腺提取液对PHA 刺激的正常人外周血单个核细胞(PBMC)及胸腺细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 研究对象 MG患者40例，其中胸腺增生型29例，胸腺瘤7例，胸腺萎缩型4例；先天性心脏病患者12例为对照。
, 百拇医药
1.2 胸腺提取液及胸腺细胞培养上清液的制备 取MG患者手术摘除的胸腺实质1 g，剪碎，加入5 ml无菌蒸馏水，于玻璃匀浆器中研磨制成匀浆，2 000 r/min离心，取上清液即为胸腺提取液，-20℃ 冻存备用。另取少量胸腺组织剪碎后过80目不锈钢网，制备胸腺细胞悬液，用含体积分数为10%新生牛血清的1640液调细胞浓度为2×105/ml，加PHA(Sigma产品，终浓度为100 mg/L)培养48 h，离心留上清液。
1.3 SDS-PAGE电泳分析 取10 μl胸腺提取液或胸腺细胞培养上清液，与10 μl 2×SDS加样缓冲液混匀，煮沸3 min，上样于120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶，每样品孔中加样品15 μl，用8 V/cm 的电压进行积层胶电泳，当蛋白进入分离胶后提高电压至15 V/cm，继续电泳1～2 h。考马斯亮蓝染色。蛋白电泳试剂和蛋白质标准品均购自华美生物工程公司。
1.4 淋巴细胞增殖实验 将含PHA(Sigma产品,终浓度为100 mg/L)的正常人胸腺细胞悬液及PBMC分别加入96孔细胞培养板，每孔100 μl，并加入20 μl胸腺提取液，设3个复孔，同时设不加胸腺提取液对照孔，体积分数为5% CO2培养箱中培养44 h，加入MTT继续培养4 h，于酶联检测仪测D(570 nm)值。按下列公式计算细胞增殖抑制率：细胞增殖抑制率(%)=(1-加胸腺提取液孔D(570nm)值/无胸腺提取液孔D(570nm)值)×100%
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2 结果
2.1 胸腺提取液及胸腺细胞培养上清液的SDS-PAGE电泳 电泳发现，40例MG患者胸腺提取液中有12例发现异常蛋白，占MG患者的30%， 其相对分子质量小于14400，而在12例先天性心脏病患者胸腺提取液中无1例发现这种蛋白，说明重症肌无力患者胸腺提取液与对照组有显著差异，见图1。 胸腺细胞培养上清液中未发现这种蛋白。
图1 胸腺提取液SDS-PAGE电泳
10为蛋白标准对照，1，2，13，14为正常对照，3，4，8，9，11，12为有小分子异常蛋白，5，6，7，15，16，17，18，19为无异常蛋白
2.2 胸腺提取液对PHA刺激的正常人PBMC及胸腺细胞增殖的影响 异常小分子蛋白的胸腺提取液对PHA刺激的正常人PBMC及胸腺细胞的增殖有显著的抑制作用，与正常对照相比差异有显著性(P<0.01)，与无异常蛋白MG患者相比差异有显著性(P< 0.05)；但各种类型的MG胸腺提取液对胸腺细胞增殖的影响未见显著差异。见表1。
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表1 胸腺提取液对正常人PBMC及胸腺细胞增殖的影响% 组别
n
PBMC增殖抑制率
胸腺细胞增殖抑制率
非自身免疫病对照
12
46.32±13.50
42.51±11.23
异常蛋白组MG
12
73.33±21.31*
, 百拇医药
37.86±16.33
非异常蛋白组MG
28
58.76±17.21
35.25±17.62
*与对照组相比P<0.01，与非异常蛋白组相比P<0.05
3 讨论
重症肌无力属自身免疫病，其发病与胸腺有关已成共识，胸腺摘除治疗重症肌无力也成为目前主要治疗手段之一。胸腺摘除后MG患者外周血T细胞亚群有所改善[2]，自身抗体(AchRab)也有降低[3，4]。 但迄今为止，胸腺在重症肌无力发病中的作用尚不完全清楚。作者发现，约30%MG患者的胸腺提取液中存在相对分子质量小于14 400的异常蛋白，而在胸腺细胞培养上清液中未见这种蛋白，说明此蛋白极有可能是由胸腺基质细胞产生。为探讨胸腺提取液中异常蛋白与MG发病的关系，作者根据胸腺提取液中是否存在这一异常蛋白进行分组研究，发现蛋白异常组的胸腺提取液对PBMC的增殖有显著的抑制作用，且与正常对照组相比差异有显著性，与非异常蛋白组相比差异也有显著性。结合临床资料，统计研究发现，异常蛋白组在胸腺摘除后的疗效达到90%，明显高于其他的MG患者，提示这种蛋白可能与MG的发病过程有关。研究中还发现MG 胸腺提取液对正常人胸腺细胞的增殖与对照组相比未见显著差异，其原因可能是正常人胸腺细胞80%左右是CD4+、CD8+ 的双阳性细胞，其细胞膜上没有异常蛋白的相应受体，因此出现胸腺提取液对PBMC和胸腺细胞作用不一致的现象。吕良等[5]也报道，在MG患者血清中发现相对分子质量14 000的非免疫球蛋白组分，它对非自身血清的AchR、PsmR与相应抗体的反应有增强作用，说明血清中的14 000蛋白参与了自身抗体的致病过程。作者在MG患者胸腺提取液中发现的相对分子质量小于14 400的异常蛋白是否也有类似作用，与血清中的14 000 蛋白有何关系，尚待进一步探讨，胸腺提取液中这一小分子异常蛋白与MG发病机制的具体关系以及与自身抗体(AchRab)产生的影响尚待深入研究。
, http://www.100md.com
从本研究结果可见，重症肌无力患者胸腺提取液中的异常小分子蛋白与疾病的发生有潜在关系，对这种蛋白的进一步分离研究，尤其是利用基因工程技术了解其产生和表达规律，将有望在重症肌无力的研究中有所突破。■
*河南省教委自然科学研究基金资助项目 97310007
作者简介：杜英，女，37岁，大学本科，研究方向：自身免疫病
参考文献：
[1]Moulian N, Bidanlt J, Truffanlt F, et al. Thymocyte Fas expression is dysregulated in myasthenia gravis patients with anti-acetylcholine receptor antibody. Blood, 1997,89(9):3 287
, http://www.100md.com
[2]黄煜敏，许贤豪，林嘉友，等.胸腺摘除对重症肌无力患者T细胞亚群的影响.中华微生物学与免疫学杂志，1996，16(2)：92
[3]陈平，徐文桢，龚其美.重症肌力无力血清sIL-2R和AchRad水平变化的研究.上海免疫学杂志，1995，15(3)：138
[4]Kuks JB, Oosterhuis HJ, Limburg PC. Antibodies to acetylcholine receptors in myasthenia gravis. In vitro synthesis by peripheral blood lymphocytes before and after thymectory. Clin Exp lmmunol, 1992,87:249
[5]吕良，乔健，吕传真.重症肌无力患者血清非Ig成分对突触前、后膜受体及其相应抗体反应的影响.上海免疫学杂志，1998，8(2)：81
(1999-03-31收稿), 百拇医药