内源性血管生成抑制因子Endostatin基因的克隆、表达及活性研究(摘要)
作者：郝志芳 谈立松 曲建 沈琼 张云汉
单位：郝志芳 沈琼 张云汉(河南医科大学第一附属医院病理科 河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州 450052)；谈立松 曲建(上海市肺科医院肺癌研究室 上海 200433)
关键词：内源性心血管生成抑制因子；Endostatin基因；克隆
河南医科大学学报000334 传统的肿瘤治疗手段主要是针对肿瘤实质细胞进行杀灭，但是效果较差。手术一般难以彻底地清除肿瘤，而放疗及化疗由于其对人体毒性的限制，再加上可诱导抗药性的产生，也难以达到令人满意的效果。这样的治疗现状促使科学家另避蹊径，从另一个角度来探讨肿瘤的治疗问题。
肿瘤是典型的血管依赖性病变,其生长和转移主要依赖于新生血管的形成。在缺乏血管的条件下，肿瘤将趋向于休眠状态，内部细胞发生坏死和/或凋亡，肿瘤停止生长或其生长受到抑制，这为肿瘤治疗提供了一条新思路，即抗血管生成治疗肿瘤。因此，寻找高效低毒的血管生成抑制因子(angiogenesis inhibition factor, AIF),抑制血管生成，切断肿瘤的营养供给和转移途径，达到抑制肿瘤，治疗肿瘤的目的，成为当前肿瘤领域研究的热点之一。为了实施抗血管生成治疗方法，Folkman及其同事从70年代起就开始筛选数十种化合物以寻找有效的血管生成抑制剂，直到1990年才成功合成了高效低毒的O-烟曲霉醇(简称AGM-1470或TNP-470)。近年来，人们发现了一些内源性血管生成抑制因子，诸如血小板反应素(Thrombospondin)、血小板因子4、催乳素的N-末端片段、凝血酶原的一个片段等等，其中尤以Folkman实验室发现的Angiostatin和Endostatin尤为引人注目。1997年，O′Reilly和Folkman从鼠内皮细胞瘤(EOMA)细胞的条件培养液中分离纯化出一种新的蛋白质，相对分子质量为22 000，命名为Endostatin，氨基酸序列分析发现其为胶原蛋白18 C-末端片段。Endostatin能特异抑制内皮细胞的增殖和血管生成，并能抑制实验性动物肿瘤的生长和转移，显示了其在肿瘤治疗领域诱人的应用前景。由于天然Endostatin来源有限，人们寄希望于基因工程产品。
, 百拇医药
作者利用RT-PCR及重组DNA技术，从新鲜胎肝组织中克隆到人Endostatin基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。首先采用异硫氰酸胍酸酚一步法从新鲜胎肝组织中提取总RNA，将总RNA反转录合成cDNA第一链，以此cDNA为模板，进行PCR扩增反应 ，20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测反应产物 ，得到约549 bp左右的特异扩增条带，将此扩增片段定向插入克隆载体pSK的BamHⅠ/KpnⅠ的酶切位点中，构建重组质粒pSE，用双脱氧终止法测定序列，结果显示所扩增的基因片段全长549 bp，内部不含终止码，末端是一个终止密码子，共编码182个氨基酸，与文献报道一致。以BamHⅠ/KpnⅠ双酶从pSE克隆质粒中切取人Endostatin基因，定向插入表达载体pQE-31，构建表达重组质粒pQEN，转化入宿主菌M 15，挑选阳性克隆在IPTG诱导下进行表达，表达产物经SDS-PAGE检测可见诱导后的样品有相对分子质量约为22 000的新生蛋白带，凝胶扫描显示表达量占菌体总蛋白的34.6%。重组Endostatin主要以包涵体形式存在。复性后的表达产物作用于鼠肺动脉内皮细胞(1 H 11细胞)，以MTT法测定其对血管内皮细胞的抑制率。MTT法显示复性后的表达产物对1 H 11细胞的增殖有抑制作用，共配制三种稀释度：1∶5，1∶10，1∶50，抑制率分别为49.3%,31.2%,12.3%.另外其抑制肿瘤生长的作用也经动物实验证实。
Endostatin特异性地针对基因稳定的内皮细胞群，实验证明不会产生耐药性，而且对实体瘤的作用具有广谱性，而这一点正是放疗和化疗的缺憾所在, 因此采用Endostatin等血管生成抑制剂配合外科手术、放疗及化疗等常规疗法，将会大大提高恶性肿瘤的治疗效果。本研究结果还为基因工程技术生产血管生成抑制因子奠定了基础。
2000-03-05收稿, 百拇医药
单位：郝志芳 沈琼 张云汉(河南医科大学第一附属医院病理科 河南省肿瘤病理学重点实验室 郑州 450052)；谈立松 曲建(上海市肺科医院肺癌研究室 上海 200433)
关键词：内源性心血管生成抑制因子；Endostatin基因；克隆
河南医科大学学报000334 传统的肿瘤治疗手段主要是针对肿瘤实质细胞进行杀灭，但是效果较差。手术一般难以彻底地清除肿瘤，而放疗及化疗由于其对人体毒性的限制，再加上可诱导抗药性的产生，也难以达到令人满意的效果。这样的治疗现状促使科学家另避蹊径，从另一个角度来探讨肿瘤的治疗问题。
肿瘤是典型的血管依赖性病变,其生长和转移主要依赖于新生血管的形成。在缺乏血管的条件下，肿瘤将趋向于休眠状态，内部细胞发生坏死和/或凋亡，肿瘤停止生长或其生长受到抑制，这为肿瘤治疗提供了一条新思路，即抗血管生成治疗肿瘤。因此，寻找高效低毒的血管生成抑制因子(angiogenesis inhibition factor, AIF),抑制血管生成，切断肿瘤的营养供给和转移途径，达到抑制肿瘤，治疗肿瘤的目的，成为当前肿瘤领域研究的热点之一。为了实施抗血管生成治疗方法，Folkman及其同事从70年代起就开始筛选数十种化合物以寻找有效的血管生成抑制剂，直到1990年才成功合成了高效低毒的O-烟曲霉醇(简称AGM-1470或TNP-470)。近年来，人们发现了一些内源性血管生成抑制因子，诸如血小板反应素(Thrombospondin)、血小板因子4、催乳素的N-末端片段、凝血酶原的一个片段等等，其中尤以Folkman实验室发现的Angiostatin和Endostatin尤为引人注目。1997年，O′Reilly和Folkman从鼠内皮细胞瘤(EOMA)细胞的条件培养液中分离纯化出一种新的蛋白质，相对分子质量为22 000，命名为Endostatin，氨基酸序列分析发现其为胶原蛋白18 C-末端片段。Endostatin能特异抑制内皮细胞的增殖和血管生成，并能抑制实验性动物肿瘤的生长和转移，显示了其在肿瘤治疗领域诱人的应用前景。由于天然Endostatin来源有限，人们寄希望于基因工程产品。
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作者利用RT-PCR及重组DNA技术，从新鲜胎肝组织中克隆到人Endostatin基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。首先采用异硫氰酸胍酸酚一步法从新鲜胎肝组织中提取总RNA，将总RNA反转录合成cDNA第一链，以此cDNA为模板，进行PCR扩增反应 ，20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测反应产物 ，得到约549 bp左右的特异扩增条带，将此扩增片段定向插入克隆载体pSK的BamHⅠ/KpnⅠ的酶切位点中，构建重组质粒pSE，用双脱氧终止法测定序列，结果显示所扩增的基因片段全长549 bp，内部不含终止码，末端是一个终止密码子，共编码182个氨基酸，与文献报道一致。以BamHⅠ/KpnⅠ双酶从pSE克隆质粒中切取人Endostatin基因，定向插入表达载体pQE-31，构建表达重组质粒pQEN，转化入宿主菌M 15，挑选阳性克隆在IPTG诱导下进行表达，表达产物经SDS-PAGE检测可见诱导后的样品有相对分子质量约为22 000的新生蛋白带，凝胶扫描显示表达量占菌体总蛋白的34.6%。重组Endostatin主要以包涵体形式存在。复性后的表达产物作用于鼠肺动脉内皮细胞(1 H 11细胞)，以MTT法测定其对血管内皮细胞的抑制率。MTT法显示复性后的表达产物对1 H 11细胞的增殖有抑制作用，共配制三种稀释度：1∶5，1∶10，1∶50，抑制率分别为49.3%,31.2%,12.3%.另外其抑制肿瘤生长的作用也经动物实验证实。
Endostatin特异性地针对基因稳定的内皮细胞群，实验证明不会产生耐药性，而且对实体瘤的作用具有广谱性，而这一点正是放疗和化疗的缺憾所在, 因此采用Endostatin等血管生成抑制剂配合外科手术、放疗及化疗等常规疗法，将会大大提高恶性肿瘤的治疗效果。本研究结果还为基因工程技术生产血管生成抑制因子奠定了基础。
2000-03-05收稿, 百拇医药