用抗肽抗体对豚鼠心肌行M2胆碱受体分布的研究
作者：朱琳 付蕾 赵荣瑞 李良晨
单位：朱琳(河南医科大学第一附属医院药剂科 郑州 450052)；付蕾(河南医科大学药学系 郑州 450052)；赵荣瑞(山西医科大学生理学教研室 太原 030001)；李良晨(河南医科大学生物化学教研室 郑州 450052)
关键词：M2胆碱受体；抗体；心肌；豚鼠
河南医科大学学报000323 摘要 目的：对比观察豚鼠左右心房和心室M2胆碱受体的分布位置及其特性。方法：采用M2胆碱受体自身抗体与用人M2胆碱受体肽段经免疫制备的抗受体抗体在豚鼠心肌进行免疫组织化学研究。结果：M2胆碱受体的免疫反应阳性颗粒主要位于胞膜及周缘胞浆内；心房和心室肌细胞均存在明显的免疫阳性反应物，但其分布密度存在有明显差异，心房免疫阳性颗粒明显多于心室；用阿托品后，心房心室细胞的免疫阳性反应产物明显降低，M2胆碱受体抗体和受体结合的位点可部分被M2胆碱受体拮抗剂阻断。结论：豚鼠心脏M2胆碱受体主要分布于心房和心室肌细胞的表面，心房M2胆碱受体密度明显大于心室。M胆碱受体拮抗剂具有阻滞M2胆碱受体抗体和其受体结合的效应。
, http://www.100md.com
分类号 R331.3
Immunocytochemical studies of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles using anti-peptide antibodies
ZHU Lin，(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FU Lei，(Department of Pharmacy,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
ZHAO Rongrui，(Department of Pharmacy,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
LI Liangchen
X(Department of Biochemistry,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract Aim: To compare and evaluate the localization and density of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles.Methods ：Immunocytochemical technigues were used to examine the localization and the density of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles,with anti-peptide antibodies against the second extracellular loop of human muscarinic receptor-2.Results： The positive immunoreactivity of M2 muscarinic receptor showed brownish granules in variable size and shape which were located mainly at the cell surface and peripheral cytoplasm.The positive immunoreactive granules appeared in both atrial and ventricular myocytes.The density of granules was greater in atria than that in ventricles.Pre-incubation with atropine,but not carbachol,significantly reduced the intensity of positive immunoreactivity.The results also showed that the binding of antibody to receptor site can be partially blocked by M2 muscarinic receptor antagonist.Conclusion：M2 muscarinic receptors were localized at the surface of both atrial and ventricular myocytes in guineapig.The density of receptor sites in atria was greater than that in ventricles and the binding of antibody to receptor site can be partially blocked by M2 receptor antagonist.
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Key words muscarinic receptor-2；antibody;muscarinic;guinea pig
乙酰胆碱引起心脏负性变力负性变时效应与心脏内M2受体密切相关[1]。近年来一些学者用药理学方法和放射配体方法对心脏M2胆碱能受体的分布进行了研究[2，3]，但是由于方法所限，未能对心脏部位M2胆碱受体的分布特性做具体的定位和定量比较。最近Fu等[4]在扩张性心肌病患者中研究发现了一种M2胆碱能受体抗肽抗体，作者用此抗体对豚鼠心脏M2胆碱受体的分布特性进行了免疫组织化学染色。观察了心房和心室M2胆碱受体的分布位置，并用图像分析系统比较心房和心室M2胆碱受体的分布密度，同时观察了M2受体激动剂卡巴可及其拮抗剂阿托品对受体免疫反应的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 抗人的M2胆碱受体抗肽抗体(多抗)(10 nmol/L)由瑞典哥德堡大学Wallenberg实验室馈赠。羊抗兔IgG抗体，兔PAP复合物(1∶100)，来源于上海医科大学。DAB和BSA、M2胆碱受体激动剂卡巴可及拮抗剂阿托品均购于上海华美公司。
1.2 标本制备 成年豚鼠，体重350～400 g，雌雄兼用，戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)。在活体条件下取出新鲜的心脏组织立即放入Bouin's固定液内，室温下固定24 h。按照文献报道的方法[4]组织在梯度酒精中依次脱水，石蜡包埋，然后切成5 μm厚切片。组织切片脱蜡至水，用0.05 mol/L TBS稀释的M2胆碱受体抗体(10 nm)孵育，4 ℃过夜。0.05 mol/L TBS浸洗3次，羊抗兔IgG(1∶200)37 ℃下孵育1 h，0.05 mol/L TBS洗3次。在1∶100的兔PAP液中孵育1 h，用TBS洗3次。最后样本在新鲜的DAB标准溶液中反应15 min。对照实验用正常兔血清和TBS代替特异性抗M2胆碱受体抗体。为了测定M2胆碱受体激动剂及其拮抗剂对上述免疫反应的影响，相邻切片在用M2胆碱受体抗体孵育之前，预先用M2受体激动剂卡巴可(1 μmol/L)或其拮抗剂阿托品(100 nmol/L)37 ℃下预处理2 h，然后重复上述免疫组化的步骤。
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1.3 免疫染色的定量分析 通过图像分析系统处理，根据免疫阳性反应的颗粒数，灰度值和阳性颗粒面积3个参数，比较心房和心室M2胆碱受体分布的密度。
1.4 统计处理 经图像分析系统测得的数据，采用t检验进行统计处理。统计结果以x±s表示。
2 结果
2.1 豚鼠心肌M2胆碱受体的定位 光镜下，M2胆碱受体免疫阳性反应产物呈棕黄色的细颗粒状，颗粒大小不一，形状不规则。它们主要位于心肌细胞的胞膜和膜下胞浆内。
2.2 心房和心室间M2胆碱受体的密度比较 见表1。
表1显示了心房和心室间M2胆碱受体的定量比较，用图像分析系统测量心房和心室肌细胞M2胆碱能受体的免疫阳性反应产物的颗粒数，颗粒面积及其灰度值，心房和心室肌细胞均明显存在有M2胆碱受体免疫阳性颗粒，但心房和心室间M2胆碱受体的分布密度存在有明显差异，心房部位免疫阳性颗粒及颗粒面积明显多于心室(P<0.01)。然而，左心房和右心房之间没有明显差异，同样左心室和右心室之间亦没有显著不同。所用图像分析系统，可将图像灰度由深至浅分为0～250级，即由黑至白有0～250灰度级。图像色深的灰度低，反之灰度高。因此免疫阳性反应强的部位(深染)，如表1中心房肌细胞比心室肌组强(P<0.01)，其灰度低(45±3.8)。心室肌免疫阳性反应弱(浅染)，其灰度高(81.0±6.9)。
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表1 心房和心室M2胆碱受体分布密度 部位
颗粒数
灰度值
颗粒面积/μm2
心房
149.0±13.5
45.0±3.8
550±60
心室
93.0±9.8*
81.0±6.9*
, 百拇医药
390±40*
*与心房比较，P<0.01
2.3 M2胆碱受体激动剂及其拮抗剂对受体免疫反应的影响 见表2。由表2可见，用M2胆碱能受体拮抗剂阿托品孵育后，M2胆碱能受体抗体与其受体的免疫反应显著降低，阳性颗粒数减少(见表2)。而预先用M2胆碱受体激动剂卡巴可处理后，房室肌细胞免疫阳性反应参数仅有轻微改变，与对照组相比，差异无显著性(P>0.05)。
表2 阿托品和卡巴可对豚鼠心房免疫反应的影响 药 物
颗粒数
灰度值
颗粒面积/μm2
, 百拇医药
对照
149.0±13.5
45.0±3.8
550±60
阿托品
73.0±6.4*
72.5±5.4*
210±40*
卡巴可
121.0±9.2
53.0±5.2
, 百拇医药 420±50
阿托品与对照组比：*P<0.01
3 讨论
该研究证明，用人的M2胆碱受体肽段经免疫制备的抗受体抗体可用于研究心肌M2胆碱受体的分布位置，是由于用非免疫血清替代此抗体后阳性免疫反应物消失。对于阳性免疫反应物的定位是特异性的，这一方法的优越性不仅能确定受体的分布部位，而且借助于图像分析系统可以比较不同部位的受体密度。近年来，关于心脏M2胆碱受体的分布问题，存在有明显的争议。一些作者报道，心脏M2胆碱受体主要位于心房[5]，而另一些作者指出心房和心室M2胆碱受体的分布存在有明显不同[6]，这些争议的原因可能与实验方法所限及动物种类的不同有关。本结果显示豚鼠心房和心室均有M2胆碱受体的分布，然而，心房和心室肌M2胆碱受体的分布密度存在明显差异，心房M2胆碱受体免疫阳性反应强度明显大于心室。而左右心房或左右心室之间比较，免疫阳性反应没有明显差异，从而提示心房M2胆碱受体密度大于心室，左右心房及左右心室之间，M2受体密度没有明显差别。
, 百拇医药
用M2胆碱拮抗剂阿托品后，心肌免疫阳性颗粒及颗粒面积明显减少，灰度值增高，表明抗肽抗体对M2胆碱受体的免疫反应部分被阿托品阻断，而激动剂卡巴可基本不影响其免疫反应。这一结果同Fu等[4]的报道基本一致。Fu等用放射配体法研究发现M2受体抗肽抗体不仅能减少拮抗剂的最大结合位点，而且还能减小拮抗剂的亲合力，抗体的这一抑制效应能被拮抗剂阿托品所阻断，但不能被激动剂卡巴可阻断，由拮抗剂阿托品所稳定的受体静息状态似乎缺乏能够被抗体识别的功能性抗原决定簇[4]，由此推测抗肽抗体对心肌功能活动的影响是通过特异性作用于M2受体来实现的。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39370304
研究方向：心血管受体药理学研究
作者简介：朱琳，女，40，副教授，博士，参考文献
, 百拇医药
[1]La Rala PJ,Sonnenblick EH.Autonomic control of cardiac cAMP.Circ Res,1971,28:377
[2]Woodcock EA,Leung E,Mcleod JK.A comparison of muscarinic acetylcholine receptors coupled to phosphatidylinositol turnover and to adenylate cyclase in guinea-pig atria and ventricles.Eur J Pharmacol,1987,133:283
[3]Wang WZ,Zhao RR,Wu BW.Effects of anti-peptide antibodies against human M2 muscarinic receptors on cardiac function in rats in vivo.Blood Pressure,1996,5(Suppl 3):25
, 百拇医药
[4]Fu MLX,Schulze W,Wolf WP,Hjalmarson A.Immunocytochemical localization of M2 muscarinic receptors in rat ventricles with antipeptide antibodies.J Histochem Cytochem,1994,42:337
[5]Hadjiconstantinou M,Mariani AP,Neff NH.GMI ganglioside-induced recovery of nigrostriatal dopaminergic neurons after MPTP:an immunohistochemical study.Brain Res,1989,484:297
[6]Yamamura HI,Snyder SH.Muscarinic cholinergic receptor binding in the longitudinal muscle of the guinea-pig ileum with [3H]quinuclidinyl benailate.Molec Pharmacol,1974,10:861
1999-11-24收稿, http://www.100md.com
单位：朱琳(河南医科大学第一附属医院药剂科 郑州 450052)；付蕾(河南医科大学药学系 郑州 450052)；赵荣瑞(山西医科大学生理学教研室 太原 030001)；李良晨(河南医科大学生物化学教研室 郑州 450052)
关键词：M2胆碱受体；抗体；心肌；豚鼠
河南医科大学学报000323 摘要 目的：对比观察豚鼠左右心房和心室M2胆碱受体的分布位置及其特性。方法：采用M2胆碱受体自身抗体与用人M2胆碱受体肽段经免疫制备的抗受体抗体在豚鼠心肌进行免疫组织化学研究。结果：M2胆碱受体的免疫反应阳性颗粒主要位于胞膜及周缘胞浆内；心房和心室肌细胞均存在明显的免疫阳性反应物，但其分布密度存在有明显差异，心房免疫阳性颗粒明显多于心室；用阿托品后，心房心室细胞的免疫阳性反应产物明显降低，M2胆碱受体抗体和受体结合的位点可部分被M2胆碱受体拮抗剂阻断。结论：豚鼠心脏M2胆碱受体主要分布于心房和心室肌细胞的表面，心房M2胆碱受体密度明显大于心室。M胆碱受体拮抗剂具有阻滞M2胆碱受体抗体和其受体结合的效应。
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分类号 R331.3
Immunocytochemical studies of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles using anti-peptide antibodies
ZHU Lin，(Department of Pharmacy,the First Affiliated Hospital,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
FU Lei，(Department of Pharmacy,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
ZHAO Rongrui，(Department of Pharmacy,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
, 百拇医药
LI Liangchen
X(Department of Biochemistry,Henan Medical University,Zhengzhou 450052)
Abstract Aim: To compare and evaluate the localization and density of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles.Methods ：Immunocytochemical technigues were used to examine the localization and the density of M2 muscarinic receptors in guinea pig atria and ventricles,with anti-peptide antibodies against the second extracellular loop of human muscarinic receptor-2.Results： The positive immunoreactivity of M2 muscarinic receptor showed brownish granules in variable size and shape which were located mainly at the cell surface and peripheral cytoplasm.The positive immunoreactive granules appeared in both atrial and ventricular myocytes.The density of granules was greater in atria than that in ventricles.Pre-incubation with atropine,but not carbachol,significantly reduced the intensity of positive immunoreactivity.The results also showed that the binding of antibody to receptor site can be partially blocked by M2 muscarinic receptor antagonist.Conclusion：M2 muscarinic receptors were localized at the surface of both atrial and ventricular myocytes in guineapig.The density of receptor sites in atria was greater than that in ventricles and the binding of antibody to receptor site can be partially blocked by M2 receptor antagonist.
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Key words muscarinic receptor-2；antibody;muscarinic;guinea pig
乙酰胆碱引起心脏负性变力负性变时效应与心脏内M2受体密切相关[1]。近年来一些学者用药理学方法和放射配体方法对心脏M2胆碱能受体的分布进行了研究[2，3]，但是由于方法所限，未能对心脏部位M2胆碱受体的分布特性做具体的定位和定量比较。最近Fu等[4]在扩张性心肌病患者中研究发现了一种M2胆碱能受体抗肽抗体，作者用此抗体对豚鼠心脏M2胆碱受体的分布特性进行了免疫组织化学染色。观察了心房和心室M2胆碱受体的分布位置，并用图像分析系统比较心房和心室M2胆碱受体的分布密度，同时观察了M2受体激动剂卡巴可及其拮抗剂阿托品对受体免疫反应的影响。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 试剂 抗人的M2胆碱受体抗肽抗体(多抗)(10 nmol/L)由瑞典哥德堡大学Wallenberg实验室馈赠。羊抗兔IgG抗体，兔PAP复合物(1∶100)，来源于上海医科大学。DAB和BSA、M2胆碱受体激动剂卡巴可及拮抗剂阿托品均购于上海华美公司。
1.2 标本制备 成年豚鼠，体重350～400 g，雌雄兼用，戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)。在活体条件下取出新鲜的心脏组织立即放入Bouin's固定液内，室温下固定24 h。按照文献报道的方法[4]组织在梯度酒精中依次脱水，石蜡包埋，然后切成5 μm厚切片。组织切片脱蜡至水，用0.05 mol/L TBS稀释的M2胆碱受体抗体(10 nm)孵育，4 ℃过夜。0.05 mol/L TBS浸洗3次，羊抗兔IgG(1∶200)37 ℃下孵育1 h，0.05 mol/L TBS洗3次。在1∶100的兔PAP液中孵育1 h，用TBS洗3次。最后样本在新鲜的DAB标准溶液中反应15 min。对照实验用正常兔血清和TBS代替特异性抗M2胆碱受体抗体。为了测定M2胆碱受体激动剂及其拮抗剂对上述免疫反应的影响，相邻切片在用M2胆碱受体抗体孵育之前，预先用M2受体激动剂卡巴可(1 μmol/L)或其拮抗剂阿托品(100 nmol/L)37 ℃下预处理2 h，然后重复上述免疫组化的步骤。
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1.3 免疫染色的定量分析 通过图像分析系统处理，根据免疫阳性反应的颗粒数，灰度值和阳性颗粒面积3个参数，比较心房和心室M2胆碱受体分布的密度。
1.4 统计处理 经图像分析系统测得的数据，采用t检验进行统计处理。统计结果以x±s表示。
2 结果
2.1 豚鼠心肌M2胆碱受体的定位 光镜下，M2胆碱受体免疫阳性反应产物呈棕黄色的细颗粒状，颗粒大小不一，形状不规则。它们主要位于心肌细胞的胞膜和膜下胞浆内。
2.2 心房和心室间M2胆碱受体的密度比较 见表1。
表1显示了心房和心室间M2胆碱受体的定量比较，用图像分析系统测量心房和心室肌细胞M2胆碱能受体的免疫阳性反应产物的颗粒数，颗粒面积及其灰度值，心房和心室肌细胞均明显存在有M2胆碱受体免疫阳性颗粒，但心房和心室间M2胆碱受体的分布密度存在有明显差异，心房部位免疫阳性颗粒及颗粒面积明显多于心室(P<0.01)。然而，左心房和右心房之间没有明显差异，同样左心室和右心室之间亦没有显著不同。所用图像分析系统，可将图像灰度由深至浅分为0～250级，即由黑至白有0～250灰度级。图像色深的灰度低，反之灰度高。因此免疫阳性反应强的部位(深染)，如表1中心房肌细胞比心室肌组强(P<0.01)，其灰度低(45±3.8)。心室肌免疫阳性反应弱(浅染)，其灰度高(81.0±6.9)。
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表1 心房和心室M2胆碱受体分布密度 部位
颗粒数
灰度值
颗粒面积/μm2
心房
149.0±13.5
45.0±3.8
550±60
心室
93.0±9.8*
81.0±6.9*
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390±40*
*与心房比较，P<0.01
2.3 M2胆碱受体激动剂及其拮抗剂对受体免疫反应的影响 见表2。由表2可见，用M2胆碱能受体拮抗剂阿托品孵育后，M2胆碱能受体抗体与其受体的免疫反应显著降低，阳性颗粒数减少(见表2)。而预先用M2胆碱受体激动剂卡巴可处理后，房室肌细胞免疫阳性反应参数仅有轻微改变，与对照组相比，差异无显著性(P>0.05)。
表2 阿托品和卡巴可对豚鼠心房免疫反应的影响 药 物
颗粒数
灰度值
颗粒面积/μm2
, 百拇医药
对照
149.0±13.5
45.0±3.8
550±60
阿托品
73.0±6.4*
72.5±5.4*
210±40*
卡巴可
121.0±9.2
53.0±5.2
, 百拇医药 420±50
阿托品与对照组比：*P<0.01
3 讨论
该研究证明，用人的M2胆碱受体肽段经免疫制备的抗受体抗体可用于研究心肌M2胆碱受体的分布位置，是由于用非免疫血清替代此抗体后阳性免疫反应物消失。对于阳性免疫反应物的定位是特异性的，这一方法的优越性不仅能确定受体的分布部位，而且借助于图像分析系统可以比较不同部位的受体密度。近年来，关于心脏M2胆碱受体的分布问题，存在有明显的争议。一些作者报道，心脏M2胆碱受体主要位于心房[5]，而另一些作者指出心房和心室M2胆碱受体的分布存在有明显不同[6]，这些争议的原因可能与实验方法所限及动物种类的不同有关。本结果显示豚鼠心房和心室均有M2胆碱受体的分布，然而，心房和心室肌M2胆碱受体的分布密度存在明显差异，心房M2胆碱受体免疫阳性反应强度明显大于心室。而左右心房或左右心室之间比较，免疫阳性反应没有明显差异，从而提示心房M2胆碱受体密度大于心室，左右心房及左右心室之间，M2受体密度没有明显差别。
, 百拇医药
用M2胆碱拮抗剂阿托品后，心肌免疫阳性颗粒及颗粒面积明显减少，灰度值增高，表明抗肽抗体对M2胆碱受体的免疫反应部分被阿托品阻断，而激动剂卡巴可基本不影响其免疫反应。这一结果同Fu等[4]的报道基本一致。Fu等用放射配体法研究发现M2受体抗肽抗体不仅能减少拮抗剂的最大结合位点，而且还能减小拮抗剂的亲合力，抗体的这一抑制效应能被拮抗剂阿托品所阻断，但不能被激动剂卡巴可阻断，由拮抗剂阿托品所稳定的受体静息状态似乎缺乏能够被抗体识别的功能性抗原决定簇[4]，由此推测抗肽抗体对心肌功能活动的影响是通过特异性作用于M2受体来实现的。
基金项目：国家自然科学基金资助项目 39370304
研究方向：心血管受体药理学研究
作者简介：朱琳，女，40，副教授，博士，参考文献
, 百拇医药
[1]La Rala PJ,Sonnenblick EH.Autonomic control of cardiac cAMP.Circ Res,1971,28:377
[2]Woodcock EA,Leung E,Mcleod JK.A comparison of muscarinic acetylcholine receptors coupled to phosphatidylinositol turnover and to adenylate cyclase in guinea-pig atria and ventricles.Eur J Pharmacol,1987,133:283
[3]Wang WZ,Zhao RR,Wu BW.Effects of anti-peptide antibodies against human M2 muscarinic receptors on cardiac function in rats in vivo.Blood Pressure,1996,5(Suppl 3):25
, 百拇医药
[4]Fu MLX,Schulze W,Wolf WP,Hjalmarson A.Immunocytochemical localization of M2 muscarinic receptors in rat ventricles with antipeptide antibodies.J Histochem Cytochem,1994,42:337
[5]Hadjiconstantinou M,Mariani AP,Neff NH.GMI ganglioside-induced recovery of nigrostriatal dopaminergic neurons after MPTP:an immunohistochemical study.Brain Res,1989,484:297
[6]Yamamura HI,Snyder SH.Muscarinic cholinergic receptor binding in the longitudinal muscle of the guinea-pig ileum with [3H]quinuclidinyl benailate.Molec Pharmacol,1974,10:861
1999-11-24收稿, http://www.100md.com