HPLC法测定金参润喉合剂中绿原酸的含量
作者：王 建
单位：杭州 浙江省药品检验所
关键词：金参润喉合剂；绿原酸；高效液相色谱法
中国现代应用药学990220摘要 目的：建立金参润喉合剂中绿原酸含量测定方法。方法：HPLC法，以NOVA-PAK C18(4.6×200mm)为色谱柱，流动相为0.5%冰醋酸溶液-甲醇(75∶25),检测波长为328nm。结果：平均回收率为102.9%,相对标准偏差为2.7%(n=5)。结论：与卫生部药品标准(试行)中的薄层扫描法相比，本法杂质分离更加有效、分析结果更为准确。
Determination of chlorogenic acid in Jinshen Runhou Heji by HPLC
Wang Jian(Wang J)(Zhejiang Institute for Drug Control,Hangzhou 310004)
, http://www.100md.com
ABSTRACT OBJECTIVE：To develop the method for determination of chlorogenic acid in Jinshen Runhou Heji.METHODS:Using HPLC,the column was NOVA-PAK C18(4.6×200mm),the mobile phase consisted 0.5% ice acetic acid solution-methanol(75∶25),the detective wavelength was 328nm.RESULTS:The average recovery was 102.9%(RSD=2.7%,n=5).CONCLUSION:Compared the TLCS method in CP,this method is better in the separation of impurity and more accurate.
KEY WORDS Jinshen Runhou Heji,chlorogenic acid,HPLC
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金参润喉合剂是由金银花、玄参、地黄等精制而成。金银花为该复方制剂的主药之一，金银花的主要活性成分为绿原酸，因此，以绿原酸作为本品的含量控制指标。卫生部药品标准(试行)[1]采用薄层扫描法测定金参润喉合剂中绿原酸的含量，存在着杂质分离不完全、误差大的缺点。本文选用分离效率高、准确度好的高效液相色谱法[2，3]用于该复方制剂中绿原酸的含量，结果满意。
1 实验部分
1.1 仪器、药品与试剂
Waters高效液相色谱仪，配有510泵，490UV检测器，U6K进样器，820数据工作站。
绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)；金参润喉合剂(批号：960612，960625，960629)及其中单味中药(浙江泰利森药业有限公司)。
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1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件：色谱柱为大连化物所NOVA-PAK C18(4.6×200mm)，流动相为0.5%冰醋酸溶液-甲醇(75∶25),流速0.5ml/min，检测波长为328nm。
对照品与样品的色谱图见图1(A，B)。按处方比例制备的缺金银花的空白样品，其色谱在绿原酸出峰区域没有干扰峰出现，见图1(C)。
图1 HPLC色谱图
A-对照品；B-样品；C-空白
1.2.2 样品处理：精密吸取样品5ml,用盐酸调节pH值为2，用醋酸乙酯分6次振摇提取，每次10ml,合并醋酸乙酯提取液，挥干，用甲醇分次溶解，定量转移至50ml棕色量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。
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1.2.3 标准曲线的制备：批号753-9406的绿原酸对照品，照前述色谱条件进行纯度检查，面积归一化法计算，绿原酸的含量为99.5%。
精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解制成41.5μg/ml的对照品溶液。按前述色谱条件分别进样2.5,5.0,7.5,10.0,12.5，15.0,17.5和20.0μl,测定峰面积。对照品色谱峰面积与进样量在0.10～0.83μg范围内呈良好线性关系。回归方程:Y=4.10×10-2+6.85x,r=0.9991。
1.2.4 精密度试验：将同一份样品液，重复测定5次,RSD为1.9%。
1.2.5 重现性试验：精密吸取同一批号样品5份，按样品处理，测定方法操作。结果RSD为2.2%。
1.2.6 加样回收实验：精密吸取已测知含量的样品液适量，精密加入适量绿原酸对照品，按样品处理项下操作，HPLC条件测定。结果见表1。表1 绿原酸回收率试验 编 号
, 百拇医药
绿原酸加入量
(mg)
绿原酸检出量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1
0.9250
0.979
, http://www.100md.com
105.9
2
0.9250
0.925
100.0
3
0.9250
0.943
101.9
102.9
2.7
4
0.9250
, http://www.100md.com
0.979
105.9
5
0.9250
0.934
101.0
1.2.7 样品测定：3批样品按前述方法操作，测定数据如表2。表2 样品测定结果 批号
绿原酸含量(mg/ml)
960625
0.511
960629
0.414
, 百拇医药
960612
0.533
1.2.8 金银花药材含量测定：为保证金参润喉合剂的质量，对金银花药材中绿原酸的含量也进行了测定。
精密称取金银花粗粉约0.2g,置100ml棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声振荡30min,加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即为供试品溶液。按前述色谱条件进行测定，3批药材含量测定结果见表3。
2 讨 论表3 金银花药材含量 编号
绿原酸含量(%)
1
3.42
2
, 百拇医药
3.42
3
1.06
2.1 选用醋酸乙酯萃取法纯化供试品，取供试品5ml,用醋酸乙酯萃取7次，每次10ml,照前述方法测定每次萃取液中绿原酸含量，结果见表4。说明用醋酸乙酯萃取6次，绿原酸已萃取完全，因此确定萃取次数为6次。表4 萃取次数与绿原酸峰面积的关系 萃取次数
峰面积
1
2.63×107
2
1.48×107
, 百拇医药 3
6.93×106
4
3.24×106
5
1.39×106
6
5.60×105
7
未检出
2.2 绿原酸为有机酸，易产生电离而使色谱峰扩散，因此采用离子抑制技术，在流动相中加入少量酸抑制其色谱峰拖尾，采用30.1%、0.2%、0.5%冰醋酸溶液，色谱峰拖尾现象逐渐减小，因此采用0.5%冰醋酸溶液(pH2.8)作为水相。
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2.3 取绿原酸对照品溶液，于岛津UV-260紫外可见分光光度计，在波长200～400nm波长范围内扫描，其一最大吸收波长为328nm,故选该波长为测定波长。
参考文献
[1] 卫生部药品标准(试行).WS-037(Z-010)-95.
[2] 王强，张晓平.中药复方感冒安中黄芩苷、绿原酸的高效液相色谱测定.中草药，1989，20(8)∶15.
[3] 孟品佳，孙毓庆.高效液相色谱法分离金银花成份及测定绿原酸含量.药物分析杂志，1990，10(1)∶58.
收稿日期：1997-12-29, http://www.100md.com
单位：杭州 浙江省药品检验所
关键词：金参润喉合剂；绿原酸；高效液相色谱法
中国现代应用药学990220摘要 目的：建立金参润喉合剂中绿原酸含量测定方法。方法：HPLC法，以NOVA-PAK C18(4.6×200mm)为色谱柱，流动相为0.5%冰醋酸溶液-甲醇(75∶25),检测波长为328nm。结果：平均回收率为102.9%,相对标准偏差为2.7%(n=5)。结论：与卫生部药品标准(试行)中的薄层扫描法相比，本法杂质分离更加有效、分析结果更为准确。
Determination of chlorogenic acid in Jinshen Runhou Heji by HPLC
Wang Jian(Wang J)(Zhejiang Institute for Drug Control,Hangzhou 310004)
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ABSTRACT OBJECTIVE：To develop the method for determination of chlorogenic acid in Jinshen Runhou Heji.METHODS:Using HPLC,the column was NOVA-PAK C18(4.6×200mm),the mobile phase consisted 0.5% ice acetic acid solution-methanol(75∶25),the detective wavelength was 328nm.RESULTS:The average recovery was 102.9%(RSD=2.7%,n=5).CONCLUSION:Compared the TLCS method in CP,this method is better in the separation of impurity and more accurate.
KEY WORDS Jinshen Runhou Heji,chlorogenic acid,HPLC
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金参润喉合剂是由金银花、玄参、地黄等精制而成。金银花为该复方制剂的主药之一，金银花的主要活性成分为绿原酸，因此，以绿原酸作为本品的含量控制指标。卫生部药品标准(试行)[1]采用薄层扫描法测定金参润喉合剂中绿原酸的含量，存在着杂质分离不完全、误差大的缺点。本文选用分离效率高、准确度好的高效液相色谱法[2，3]用于该复方制剂中绿原酸的含量，结果满意。
1 实验部分
1.1 仪器、药品与试剂
Waters高效液相色谱仪，配有510泵，490UV检测器，U6K进样器，820数据工作站。
绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)；金参润喉合剂(批号：960612，960625，960629)及其中单味中药(浙江泰利森药业有限公司)。
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1.2 方法与结果
1.2.1 色谱条件：色谱柱为大连化物所NOVA-PAK C18(4.6×200mm)，流动相为0.5%冰醋酸溶液-甲醇(75∶25),流速0.5ml/min，检测波长为328nm。
对照品与样品的色谱图见图1(A，B)。按处方比例制备的缺金银花的空白样品，其色谱在绿原酸出峰区域没有干扰峰出现，见图1(C)。
图1 HPLC色谱图
A-对照品；B-样品；C-空白
1.2.2 样品处理：精密吸取样品5ml,用盐酸调节pH值为2，用醋酸乙酯分6次振摇提取，每次10ml,合并醋酸乙酯提取液，挥干，用甲醇分次溶解，定量转移至50ml棕色量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。
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1.2.3 标准曲线的制备：批号753-9406的绿原酸对照品，照前述色谱条件进行纯度检查，面积归一化法计算，绿原酸的含量为99.5%。
精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解制成41.5μg/ml的对照品溶液。按前述色谱条件分别进样2.5,5.0,7.5,10.0,12.5，15.0,17.5和20.0μl,测定峰面积。对照品色谱峰面积与进样量在0.10～0.83μg范围内呈良好线性关系。回归方程:Y=4.10×10-2+6.85x,r=0.9991。
1.2.4 精密度试验：将同一份样品液，重复测定5次,RSD为1.9%。
1.2.5 重现性试验：精密吸取同一批号样品5份，按样品处理，测定方法操作。结果RSD为2.2%。
1.2.6 加样回收实验：精密吸取已测知含量的样品液适量，精密加入适量绿原酸对照品，按样品处理项下操作，HPLC条件测定。结果见表1。表1 绿原酸回收率试验 编 号
, 百拇医药
绿原酸加入量
(mg)
绿原酸检出量
(mg)
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1
0.9250
0.979
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105.9
2
0.9250
0.925
100.0
3
0.9250
0.943
101.9
102.9
2.7
4
0.9250
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0.979
105.9
5
0.9250
0.934
101.0
1.2.7 样品测定：3批样品按前述方法操作，测定数据如表2。表2 样品测定结果 批号
绿原酸含量(mg/ml)
960625
0.511
960629
0.414
, 百拇医药
960612
0.533
1.2.8 金银花药材含量测定：为保证金参润喉合剂的质量，对金银花药材中绿原酸的含量也进行了测定。
精密称取金银花粗粉约0.2g,置100ml棕色量瓶中，加入甲醇适量，超声振荡30min,加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即为供试品溶液。按前述色谱条件进行测定，3批药材含量测定结果见表3。
2 讨 论表3 金银花药材含量 编号
绿原酸含量(%)
1
3.42
2
, 百拇医药
3.42
3
1.06
2.1 选用醋酸乙酯萃取法纯化供试品，取供试品5ml,用醋酸乙酯萃取7次，每次10ml,照前述方法测定每次萃取液中绿原酸含量，结果见表4。说明用醋酸乙酯萃取6次，绿原酸已萃取完全，因此确定萃取次数为6次。表4 萃取次数与绿原酸峰面积的关系 萃取次数
峰面积
1
2.63×107
2
1.48×107
, 百拇医药 3
6.93×106
4
3.24×106
5
1.39×106
6
5.60×105
7
未检出
2.2 绿原酸为有机酸，易产生电离而使色谱峰扩散，因此采用离子抑制技术，在流动相中加入少量酸抑制其色谱峰拖尾，采用30.1%、0.2%、0.5%冰醋酸溶液，色谱峰拖尾现象逐渐减小，因此采用0.5%冰醋酸溶液(pH2.8)作为水相。
, http://www.100md.com
2.3 取绿原酸对照品溶液，于岛津UV-260紫外可见分光光度计，在波长200～400nm波长范围内扫描，其一最大吸收波长为328nm,故选该波长为测定波长。
参考文献
[1] 卫生部药品标准(试行).WS-037(Z-010)-95.
[2] 王强，张晓平.中药复方感冒安中黄芩苷、绿原酸的高效液相色谱测定.中草药，1989，20(8)∶15.
[3] 孟品佳，孙毓庆.高效液相色谱法分离金银花成份及测定绿原酸含量.药物分析杂志，1990，10(1)∶58.
收稿日期：1997-12-29, http://www.100md.com