原发性胆囊癌中p16基因蛋白表达及临床意义
作者：夏飞 王贵和 赵铁军
单位：安徽省铜陵市人民医院普外二科，铜陵 244000
关键词：基因；抑制；肿瘤；基因表达；胆囊肿瘤；免疫组织化学
安徽医科大学学报990211
摘要 目的 探讨p16基因蛋白与胆囊癌发生、发展及临床预后的关系。方法 采用免疫组化方法对38例原发性胆囊癌和20例慢性胆囊炎p16的表达进行观察。结果 p16在胆囊良性病变中的阳性表达率明显高于胆囊癌(P<0.01)，p16基因蛋白表达与胆囊癌的浸润性及淋巴结转移密切相关(P<0.01)，但与肿瘤的病理类型及分化程度无相关性(P>0.05)。结论 检测p16对临床正确估计胆囊癌的浸润性、淋巴结转移潜能及判断预后有重要价值。
中图书资料分类法分类号 R735.8；R394.2
, http://www.100md.com
The expression of p16 gene in gallbladder carcinomas
and its clinical significance
Xia Fei, Wang Guihe, Zhao Tiejun
(The 2nd Dept of Surgery, Tongling Municipal Peoples Hospital, Anhui 244000)
Abstract Objective To study expression patterns and clinical significance of p16 gene in gallbladder carcinomas. Methods The expression of p16 was assayed in 38 cases of gallbladder carcinomas and 20 cases of chronic cholecystitis by S-P immunohistochemical method. Results The positive expression rate in benign lesion was higher than that in malignant tumor (P<0.01)，and the expression of p16 had close relationship with the invasiveness and lymphnode matastasis(P<0.01) except the pathological types and differentiation (P>0.05). Conclusion The investigation of p16 is of great importance in evaluating the invasiveness of tumor, metapo-tential of lymphnode and clinical prognosis.
, http://www.100md.com
MeSH genes, suppressor, tumor; gene expression; gallbladder neoplasms; immunohistochemistry
p16基因又称多肿瘤抑制基因1(MTS1)，是一个肿瘤抑制基因，其在许多肿瘤细胞系和肿瘤组织中存在缺失和点突变，p16基因失活与多种肿瘤的发生相关。但目前有关p16基因在原发性胆囊癌中表达的研究尚少。本研究采用免疫组化方法检测p16基因在原发性胆囊癌及慢性胆囊炎组织中的蛋白表达，以探讨p16基因与胆囊癌发生、发展及生物学行为之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 38例胆囊癌组织及20例慢性胆囊炎组织均取自手术标本，经10%(体积分数，下同)福尔马林固定，石蜡包埋后存档。标本均行5 μm连续切片取2张，一张做HE染色复查诊断，另一张行免疫组化染色。38例胆囊癌，其中乳头状癌17例，管状腺癌12例，未分化癌9例；病理分级按照高、中、低分型分G1、G2、G3；参照Nevin标准分S1、S2、S3、S4、S5期。
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1.2 免疫组织化学S-P法 一抗为兔抗人p16多克隆抗体，由美国Maxim生物技术公司生产，稀释浓度为1∶50；S-P复合物试剂盒为Dako公司产品。石蜡切片常规脱蜡至水，经过氧化酶阻断溶液浸泡15 min，10%正常山羊血清封闭非特异性背景15 min，依次加入一抗(37℃，90 min)、二抗(生物素化羊抗兔IgG,15 min)，复合物(链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液15 min)，上述各步间均以PBS(pH 7.4)缓冲液浸洗3次，每次5 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果评定 标本阳性细胞反应率≤50%，或背景同空白对照者为阴性(-)；标本阳性细胞呈淡棕黄色或阳性细胞反应率介于50%～75%之间为弱阳性(+)；标本阳性细胞呈棕褐色或阳性细胞反应率≥75%为强阳性(++)。
1.4 统计学处理 χ2检验及确切概率法。
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2 结果
2.1 p16基因蛋白的定位分布及阳性率 p16阳性物质呈棕黄色或棕褐色细颗粒状染色，主要位于肿瘤及正常腺上皮细胞的胞核或胞浆中。本组38例胆囊癌组织p16基因蛋白阳性表达为44.7%，20例慢性胆囊炎组织p16基因蛋白阳性表达为95%(见表1)。胆囊良性病变组织明显高于恶性肿瘤组织(P<0.01)。
表1 p16基因蛋白表达与胆囊良恶性病变的关系 类型
n
p16基因蛋白表达
阳性率(%)
-
+
++
, 百拇医药
胆囊炎
20
1
8
11
95.0
胆囊癌
38
21
7
10
44.7
2.2 p16基因蛋白的表达与胆囊癌病理类型及组织学分级的关系 p16基因蛋白表达与胆囊癌的病理类型及组织学分级无明显相关性(P>0.05)，见表2。
, 百拇医药
表2 p16基因蛋白表达与胆囊癌病理分型、组织学分级的关系 类型
n
p16基因蛋白表达
阳性率
(%)
-
+
++
病理类型
乳头状癌
17
10
4
, 百拇医药
3
41.2
管状腺癌
12
6
2
4
50.0
未分化癌
9
5
2
2
44.4
, 百拇医药
病理分级
G1
15
8
3
4
46.7
G2
13
7
3
3
46.1
, 百拇医药
G3
10
6
1
3
40.0
2.3 p16基因蛋白的表达与胆囊癌临床分期的关系 S1～S5的p16基因蛋白阳性表达率分别为100%、100%、70%、21.4%、22.2%。可见胆囊癌愈近临床晚期的S4～S5，p16基因蛋白阳性表达率愈低。
2.4 p16基因蛋白的表达与胆囊癌淋巴结转移的关系 21例发生淋巴结转移的胆囊癌组织中p16基因蛋白阳性表达度为23.8%，17例未发生淋巴结转移的胆囊癌p16基因蛋白阳性表达率为70.6%，两者差异有显著性(P<0.01)。见表3。表3 p16基因蛋白表达与胆囊癌淋巴结转移的关系 淋巴转移
, 百拇医药
n
p16基因蛋白表达
阳性率
(%)
-
+
++
+
21
16
2
3
23.8
-
, http://www.100md.com
17
5
6
6
70.6
3 讨论
细胞周期的正常演进需要细胞周期依赖激酶的活化，并通过周期蛋白和抑制蛋白完成正负平衡调节。p16的基本生物学作用就是抑制CDK4和CDK6，从而可以调节Rb的磷酸化，通过E2F的不断分断，导致细胞的生长抑制〔1〕。实验证明：p16基因在人类多种瘤及细胞系中存在灭活现象，其灭活机制主要为缺失、突变和甲基化等〔2〕。其突变率为30%～80%。
我们通过S-P免疫组化方法检测了38例胆囊癌及20例慢性胆囊炎组织中p16基因蛋白的表达，结果表明：胆囊癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显低于慢性胆囊炎组织。提示胆囊癌中p16基因蛋白的改变导致其表达的丧失，使正常细胞增殖的程序性周期失控，从而变成无限制地分裂生长，这与胆囊癌的发生发展密切相关〔3，4〕。p16基因蛋白在各种病理类型的高、中、低分化型的胆囊癌组织中阳性表达率均无差异，说明p16与胆囊癌的病理类型及组织学分级无相关性，其失活在胆囊癌中更具有普遍性。
, 百拇医药
本研究结果还表明，早期未发生胆囊外浸润的S1、S2、S3期的p16基因蛋白阳性表达率高于发生胆囊外浸润的S4、S5期，且淋巴结转移者阳性表达明显低于无淋巴结转移者，说明p16基因蛋白表达与肿瘤浸润及淋巴结转移有关，其失活在胆囊癌发展过程中起作重要的作用。临床上有望通过检测p16基因蛋白的表达，来评估胆囊癌的浸润性、淋巴结转移潜能及预后。
作者简介：夏 飞，男，38岁，主治医师
1 Yeager T, Stadler W, Belair C et al. Increased p16 levels correiate with PRB alterations in human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55(3):493～497
2 Herman JG, Merlo A, Mao L et al. Inactiration of the CDKN2/ p16/MTS1 gene is trequently assoiated aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995;55(9):4?525～4?530
, http://www.100md.com
3 Reed JA, Loganzo F Jr, Shea CR et al. Loss of the p16/cyclin-dependent kinase inhibilor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesion correlales with invasive stage of tumor progession. Cancer Res, 1995;55(5):2?713～2?718
4 Walker DG, Duan W, Popovic EA et al. Homozygous deletions of the mulliple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomos. Cancer Res, 1995;55(1):20～23
1998-07-02收稿，1998-10-13修回, http://www.100md.com
单位：安徽省铜陵市人民医院普外二科，铜陵 244000
关键词：基因；抑制；肿瘤；基因表达；胆囊肿瘤；免疫组织化学
安徽医科大学学报990211
摘要 目的 探讨p16基因蛋白与胆囊癌发生、发展及临床预后的关系。方法 采用免疫组化方法对38例原发性胆囊癌和20例慢性胆囊炎p16的表达进行观察。结果 p16在胆囊良性病变中的阳性表达率明显高于胆囊癌(P<0.01)，p16基因蛋白表达与胆囊癌的浸润性及淋巴结转移密切相关(P<0.01)，但与肿瘤的病理类型及分化程度无相关性(P>0.05)。结论 检测p16对临床正确估计胆囊癌的浸润性、淋巴结转移潜能及判断预后有重要价值。
中图书资料分类法分类号 R735.8；R394.2
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The expression of p16 gene in gallbladder carcinomas
and its clinical significance
Xia Fei, Wang Guihe, Zhao Tiejun
(The 2nd Dept of Surgery, Tongling Municipal Peoples Hospital, Anhui 244000)
Abstract Objective To study expression patterns and clinical significance of p16 gene in gallbladder carcinomas. Methods The expression of p16 was assayed in 38 cases of gallbladder carcinomas and 20 cases of chronic cholecystitis by S-P immunohistochemical method. Results The positive expression rate in benign lesion was higher than that in malignant tumor (P<0.01)，and the expression of p16 had close relationship with the invasiveness and lymphnode matastasis(P<0.01) except the pathological types and differentiation (P>0.05). Conclusion The investigation of p16 is of great importance in evaluating the invasiveness of tumor, metapo-tential of lymphnode and clinical prognosis.
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MeSH genes, suppressor, tumor; gene expression; gallbladder neoplasms; immunohistochemistry
p16基因又称多肿瘤抑制基因1(MTS1)，是一个肿瘤抑制基因，其在许多肿瘤细胞系和肿瘤组织中存在缺失和点突变，p16基因失活与多种肿瘤的发生相关。但目前有关p16基因在原发性胆囊癌中表达的研究尚少。本研究采用免疫组化方法检测p16基因在原发性胆囊癌及慢性胆囊炎组织中的蛋白表达，以探讨p16基因与胆囊癌发生、发展及生物学行为之间的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 38例胆囊癌组织及20例慢性胆囊炎组织均取自手术标本，经10%(体积分数，下同)福尔马林固定，石蜡包埋后存档。标本均行5 μm连续切片取2张，一张做HE染色复查诊断，另一张行免疫组化染色。38例胆囊癌，其中乳头状癌17例，管状腺癌12例，未分化癌9例；病理分级按照高、中、低分型分G1、G2、G3；参照Nevin标准分S1、S2、S3、S4、S5期。
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1.2 免疫组织化学S-P法 一抗为兔抗人p16多克隆抗体，由美国Maxim生物技术公司生产，稀释浓度为1∶50；S-P复合物试剂盒为Dako公司产品。石蜡切片常规脱蜡至水，经过氧化酶阻断溶液浸泡15 min，10%正常山羊血清封闭非特异性背景15 min，依次加入一抗(37℃，90 min)、二抗(生物素化羊抗兔IgG,15 min)，复合物(链霉素抗生物素蛋白—过氧化物酶溶液15 min)，上述各步间均以PBS(pH 7.4)缓冲液浸洗3次，每次5 min，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果评定 标本阳性细胞反应率≤50%，或背景同空白对照者为阴性(-)；标本阳性细胞呈淡棕黄色或阳性细胞反应率介于50%～75%之间为弱阳性(+)；标本阳性细胞呈棕褐色或阳性细胞反应率≥75%为强阳性(++)。
1.4 统计学处理 χ2检验及确切概率法。
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2 结果
2.1 p16基因蛋白的定位分布及阳性率 p16阳性物质呈棕黄色或棕褐色细颗粒状染色，主要位于肿瘤及正常腺上皮细胞的胞核或胞浆中。本组38例胆囊癌组织p16基因蛋白阳性表达为44.7%，20例慢性胆囊炎组织p16基因蛋白阳性表达为95%(见表1)。胆囊良性病变组织明显高于恶性肿瘤组织(P<0.01)。
表1 p16基因蛋白表达与胆囊良恶性病变的关系 类型
n
p16基因蛋白表达
阳性率(%)
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胆囊炎
20
1
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95.0
胆囊癌
38
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44.7
2.2 p16基因蛋白的表达与胆囊癌病理类型及组织学分级的关系 p16基因蛋白表达与胆囊癌的病理类型及组织学分级无明显相关性(P>0.05)，见表2。
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表2 p16基因蛋白表达与胆囊癌病理分型、组织学分级的关系 类型
n
p16基因蛋白表达
阳性率
(%)
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病理类型
乳头状癌
17
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, 百拇医药
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41.2
管状腺癌
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未分化癌
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病理分级
G1
15
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46.1
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G3
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2.3 p16基因蛋白的表达与胆囊癌临床分期的关系 S1～S5的p16基因蛋白阳性表达率分别为100%、100%、70%、21.4%、22.2%。可见胆囊癌愈近临床晚期的S4～S5，p16基因蛋白阳性表达率愈低。
2.4 p16基因蛋白的表达与胆囊癌淋巴结转移的关系 21例发生淋巴结转移的胆囊癌组织中p16基因蛋白阳性表达度为23.8%，17例未发生淋巴结转移的胆囊癌p16基因蛋白阳性表达率为70.6%，两者差异有显著性(P<0.01)。见表3。表3 p16基因蛋白表达与胆囊癌淋巴结转移的关系 淋巴转移
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n
p16基因蛋白表达
阳性率
(%)
-
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++
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21
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3 讨论
细胞周期的正常演进需要细胞周期依赖激酶的活化，并通过周期蛋白和抑制蛋白完成正负平衡调节。p16的基本生物学作用就是抑制CDK4和CDK6，从而可以调节Rb的磷酸化，通过E2F的不断分断，导致细胞的生长抑制〔1〕。实验证明：p16基因在人类多种瘤及细胞系中存在灭活现象，其灭活机制主要为缺失、突变和甲基化等〔2〕。其突变率为30%～80%。
我们通过S-P免疫组化方法检测了38例胆囊癌及20例慢性胆囊炎组织中p16基因蛋白的表达，结果表明：胆囊癌组织中p16基因蛋白阳性表达率明显低于慢性胆囊炎组织。提示胆囊癌中p16基因蛋白的改变导致其表达的丧失，使正常细胞增殖的程序性周期失控，从而变成无限制地分裂生长，这与胆囊癌的发生发展密切相关〔3，4〕。p16基因蛋白在各种病理类型的高、中、低分化型的胆囊癌组织中阳性表达率均无差异，说明p16与胆囊癌的病理类型及组织学分级无相关性，其失活在胆囊癌中更具有普遍性。
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本研究结果还表明，早期未发生胆囊外浸润的S1、S2、S3期的p16基因蛋白阳性表达率高于发生胆囊外浸润的S4、S5期，且淋巴结转移者阳性表达明显低于无淋巴结转移者，说明p16基因蛋白表达与肿瘤浸润及淋巴结转移有关，其失活在胆囊癌发展过程中起作重要的作用。临床上有望通过检测p16基因蛋白的表达，来评估胆囊癌的浸润性、淋巴结转移潜能及预后。
作者简介：夏 飞，男，38岁，主治医师
1 Yeager T, Stadler W, Belair C et al. Increased p16 levels correiate with PRB alterations in human urothelial cells. Cancer Res, 1995;55(3):493～497
2 Herman JG, Merlo A, Mao L et al. Inactiration of the CDKN2/ p16/MTS1 gene is trequently assoiated aberrant DNA methylation in all common human cancers. Cancer Res, 1995;55(9):4?525～4?530
, http://www.100md.com
3 Reed JA, Loganzo F Jr, Shea CR et al. Loss of the p16/cyclin-dependent kinase inhibilor 2 tumor suppressor gene in melanocytic lesion correlales with invasive stage of tumor progession. Cancer Res, 1995;55(5):2?713～2?718
4 Walker DG, Duan W, Popovic EA et al. Homozygous deletions of the mulliple tumor suppressor gene 1 in the progression of human astrocytomos. Cancer Res, 1995;55(1):20～23
1998-07-02收稿，1998-10-13修回, http://www.100md.com