免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库基因的亚克隆与鉴定
作者：沈际佳 蒋作君 汪 渊 周 青 余新炳 吴忠道
单位：沈际佳 蒋作君 安徽医科大学；汪 渊 周 青 寄生虫学教研室 分子生物学实验室，合肥 230032；余新炳 吴忠道 中山医科大学寄生虫学教研室，广州 510089
关键词：血吸虫；日本；遗传学；基因；文库；克隆；分子
安徽医科大学学报990302 摘要 目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫cDNA文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫cDNA文库基因的PCR产物和pGEM-T载体连接，转染大肠杆菌XL1-Blue，经抗生素及呈色底物X-gal粗筛，再用限制性内切酶及PCR方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中4个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中，获得4个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。
中国图书资料分类法分类号 R383.24
, 百拇医药
Subclone and characterization of clone genes immunoscreened
from adult Schistosoma japonicum cDNA library
Shen Jijia, Jiang Zuojun, Wang Yuan et al
(Dept of Parasitology, Anhui Medical University,Hefei 230032)
Abstract Objective To construct clone of genes encoding candidate vaccine antigens. Methods Adult S japonicum cDNA library was screened and some positive clones were amplified by PCR. PCR products were ligated into pGEM-T vector and then used to transform E coli XL1-blue. Following blue and white selection screening, restriction enzymes and PCR were used to characterize the recombinants. Results Four different pieces of S japonicum cDNA genes were cloned to pGEM-T vector. Conclusion Construction of those clones will facilitate further to subclone the genes encoding S japonicum protective antigens into eukaryotic expressive plasmid and to determine their sequence.
, 百拇医药
MeSH Schistosoma japonicum/genetics; gene； library; cloning,molecular
研制血吸虫疫苗是防治血吸虫病的重要手段之一。同种活疫苗可诱导动物产生较高的确实可靠的抗攻击感染免疫保护力〔1，2〕，但其故有的缺点限制了其在人体的应用。为寻找新的有效的血吸虫分子疫苗，我们用紫外线照射致弱日本血吸虫活尾蚴免疫鼠的脾细胞制备的单克隆抗体为探针，筛选日本血吸虫成虫cDNA定向文库〔3〕得到4株持续强阳性性反应克隆(待发表)，该几株阳性克隆的基因可能是编码具有保护性抗原的基因片段，为此，我们将获得的基因片段亚克隆入载体质粒pGEM-T并作一系列鉴定，为制备重组血吸虫疫苗打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 Wizard PCR DNA purification system Ⅰ试剂盒、T4 DNA连接酶和限制性内切酶Not Ⅰ购自Promega公司，EcoR-Ⅰ和Taq酶购自华美生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯。DNA扩增仪为珠海HEMA公司产品。
, 百拇医药
1.1.2 菌株和质粒 工程菌XL1-blue由本校分子生物学实验室保存，pGEM-T vector system Ⅰ购自Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的PCR扩增 以从日本血吸虫cDNA文库筛选出的阳性克隆噬菌体为模板，用PCR方法扩增目的基因(5′端引物序列为5′-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG,3′端引物序列为5′-TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG,加Taq酶之前模板先96℃变性6 min，再加Taq酶混匀后在DNA扩增仪上扩增，设置程序为93℃变性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸90 s，35次循环，最后一个循环延伸20 min终止反应。
1.2.2 PCR产物的纯化 按试剂盒说明书进行。
1.2.3 目的基因片段的亚克隆 在T4DNA连接酶作用下pGEM-T质粒载体与纯化的目的基因片段连接，4℃过夜。感受态制备及转化见文献〔4〕。
, 百拇医药
1.2.4 重组克隆子的筛选与鉴定 在含氨苄青霉素琼脂平板上均匀涂布X-gal和IPTG后，再将转化的菌液也均匀涂布平板表面，倒置平板37℃培养15～18 h，根据生长蓝白色菌落进行初筛。挑取白色菌落置2 ml LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃摇床培养过夜，常规提取质粒，分别用限制性内切酶酶切法和以提取质粒为模板，按上述PCR法扩增目的基因，以进一步确定阳性重组菌落。
2 结果
2.1 cDNA文库免疫筛选阳性克隆的PCR扩增 从6个阳性克隆中，选择4个持续强阳性克隆进行PCR扩增。PCR的DNA产物分别约为1 100、1 000、800和500 bp。多次反复PCR反应，这些扩增产物稳定出现，说明这些DNA条带是血吸虫cDNA文库克隆的特异性扩增产物。这些PCR产物经纯化后，非特异性涂布状产物引物二聚体均消失，纯化效果良好。见图1。
, http://www.100md.com
图1 PCR产物纯化前后的结果比较
泳道1、2、3、4为PCR纯化后产物，泳道5、6、7、8为PCR粗产物，M为200 bp梯度分子量
2.2 PCR产物DNA基因片段的亚克隆 4个cDNA扩增DNA基因片段亚克隆入pGEMT质粒，转染入工程菌E.coli XL1-blue,经蓝白斑粗筛，分别获得数十到数百个白色菌落。每个克隆挑取数个白色菌落，提取其质粒DNA，并用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶做双酶切，可切下与原PCR产物大小相同的DNA片段。再以该质粒为模板作PCR，也可扩增出与原PCR产物大小一致的DNA片段。两者均证明重组成功。见图2。
图2 重组克隆质粒酶切及PCR反应结果
泳道1、4、7、10为原PCR产物，泳道2、5、8、11为重组质粒双酶切产物，泳道3、6、9、12为重组质粒PCR产物，M为200 bp梯度分子量
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3 讨论
近年来，随着分子生物学、基因工程技术的飞速发展及其在寄生虫学方面的应用，人们开始致力于血吸虫病分子疫苗的研究〔5，6〕。由于分子疫苗安全性高且可大规模生产，对它的研究越来越受到重视。为获得具有一定保护力的疫苗候选抗原分子，我们用抗日本血吸虫童虫单抗筛选日本血吸虫cDNA文库，获得一批阳性克隆。从cDNA文库中筛选挑取阳性克隆后，其目的基因经PCR方法扩增，扩增的DNA基因片段若要亚克隆入一质粒载体，有许多方法可供使用，一般用酶切反应来进行。由于PCR扩增的线性DNA片段难以被酶水解，虽在PCR产物两端有已知的酶切位点，但常常酶切不完全，造成亚克隆失败。本次实验将PCR产物亚克隆入Promega专利产品pGEM-T载体质粒，结果表明，只要PCR产物达到一定纯度，则基因重组的概率较高，效果较好，为下一步工作奠定了基础。
本次实验用于筛选cDNA文库的抗日本血吸虫童虫膜抗原单抗，业已证实具有被动保护作用，且与抗血吸虫药物吡喹酮有协同杀虫作用〔8，9〕。因此，这些基因编码的相应抗原有作为日本血吸虫病分子疫苗候选成分的潜能。同时也说明使用针对性强、目的明确的单克隆抗体是筛选cDNA文库中的目标基因的一种有效途径。对重组质粒插入片段的DNA序列分析及再将这些DNA片段亚克隆入真核表达质粒的工作正在进行。
, 百拇医药
(南京医科大学寄生虫学教研室提供日本血吸虫cDNA文库供使用，张兆松等教授给予指导和帮助，特此致谢。)
基金项目：国家自然科学基金(39570646)，安徽省自然科学基金(95-医-028)资助
作者简介：沈际佳，男，43岁，副教授
蒋作君，男，44岁，教授
参考文献
1 Yole DS, Reid GD, Wilson RA et al. Protection against schistosoma mansoni and associated immune responses induced in the vervet monkey Cercopithe-Cus aethiops by irradiated cercaria vaccine. Am J Trop Med Hyg,1996;54(3):265～270
, 百拇医药
2 Shi YE, Jiang CF, Han JJ et al. Immunization of Pigs against infection with Schistosoma japonicum using ultraviolet-attenuated cercariae. Parasitology,1993;106(Pt5):459～462
3 陈淑贞，吴海玮，张兆松等. 一个定向克隆的日本血吸虫基因表达库. 中国人兽共患病杂志，1997；13(6)：23～25
4 汪 渊，桂淑玉. 鸡肌球蛋白轻链激酶表达载体的构建. 生物化学学报，1997；13(10)：520～524
5 Liu SH, Song GC, Xu YX et al. Progress in the development of a vaccine against Schistosomiasis in China. Int J Infect Dis,1998;2(3):176～180
6 刘述先. 血吸虫疫苗研制的策略、现状及展望. 中国血吸虫病防治杂志，1994；6(增刊)：47～49
8 沈际佳，蒋作君，汪学龙等. 血吸虫童虫膜单克隆抗体小鼠被动转移试验抗血吸虫感染作用. 中国实验与临床免疫学杂志，1999；15(1)：25～27
9 沈际佳，蒋作君，汪学龙等. 抗童虫膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀血吸虫作用. 中国药理学通报，1998；14(5)：440～442
1999-04-01收稿，1999-06-01修回, http://www.100md.com
单位：沈际佳 蒋作君 安徽医科大学；汪 渊 周 青 寄生虫学教研室 分子生物学实验室，合肥 230032；余新炳 吴忠道 中山医科大学寄生虫学教研室，广州 510089
关键词：血吸虫；日本；遗传学；基因；文库；克隆；分子
安徽医科大学学报990302 摘要 目的 亚克隆免疫筛选日本血吸虫cDNA文库得到的基因。方法 在体外将血吸虫cDNA文库基因的PCR产物和pGEM-T载体连接，转染大肠杆菌XL1-Blue，经抗生素及呈色底物X-gal粗筛，再用限制性内切酶及PCR方法进一步鉴定。结果 成功地将文库中4个大小不同的日本血吸虫基因片段连接到载体中，获得4个重组子。结论 为可能编码保护性抗原的血吸虫基因测序和将其亚克隆入真核表达质粒奠定基础。
中国图书资料分类法分类号 R383.24
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Subclone and characterization of clone genes immunoscreened
from adult Schistosoma japonicum cDNA library
Shen Jijia, Jiang Zuojun, Wang Yuan et al
(Dept of Parasitology, Anhui Medical University,Hefei 230032)
Abstract Objective To construct clone of genes encoding candidate vaccine antigens. Methods Adult S japonicum cDNA library was screened and some positive clones were amplified by PCR. PCR products were ligated into pGEM-T vector and then used to transform E coli XL1-blue. Following blue and white selection screening, restriction enzymes and PCR were used to characterize the recombinants. Results Four different pieces of S japonicum cDNA genes were cloned to pGEM-T vector. Conclusion Construction of those clones will facilitate further to subclone the genes encoding S japonicum protective antigens into eukaryotic expressive plasmid and to determine their sequence.
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MeSH Schistosoma japonicum/genetics; gene； library; cloning,molecular
研制血吸虫疫苗是防治血吸虫病的重要手段之一。同种活疫苗可诱导动物产生较高的确实可靠的抗攻击感染免疫保护力〔1，2〕，但其故有的缺点限制了其在人体的应用。为寻找新的有效的血吸虫分子疫苗，我们用紫外线照射致弱日本血吸虫活尾蚴免疫鼠的脾细胞制备的单克隆抗体为探针，筛选日本血吸虫成虫cDNA定向文库〔3〕得到4株持续强阳性性反应克隆(待发表)，该几株阳性克隆的基因可能是编码具有保护性抗原的基因片段，为此，我们将获得的基因片段亚克隆入载体质粒pGEM-T并作一系列鉴定，为制备重组血吸虫疫苗打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂与仪器 Wizard PCR DNA purification system Ⅰ试剂盒、T4 DNA连接酶和限制性内切酶Not Ⅰ购自Promega公司，EcoR-Ⅰ和Taq酶购自华美生物工程公司，其他化学试剂为国产分析纯。DNA扩增仪为珠海HEMA公司产品。
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1.1.2 菌株和质粒 工程菌XL1-blue由本校分子生物学实验室保存，pGEM-T vector system Ⅰ购自Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因的PCR扩增 以从日本血吸虫cDNA文库筛选出的阳性克隆噬菌体为模板，用PCR方法扩增目的基因(5′端引物序列为5′-GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG,3′端引物序列为5′-TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG,加Taq酶之前模板先96℃变性6 min，再加Taq酶混匀后在DNA扩增仪上扩增，设置程序为93℃变性50 s，53℃退火50 s，72℃延伸90 s，35次循环，最后一个循环延伸20 min终止反应。
1.2.2 PCR产物的纯化 按试剂盒说明书进行。
1.2.3 目的基因片段的亚克隆 在T4DNA连接酶作用下pGEM-T质粒载体与纯化的目的基因片段连接，4℃过夜。感受态制备及转化见文献〔4〕。
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1.2.4 重组克隆子的筛选与鉴定 在含氨苄青霉素琼脂平板上均匀涂布X-gal和IPTG后，再将转化的菌液也均匀涂布平板表面，倒置平板37℃培养15～18 h，根据生长蓝白色菌落进行初筛。挑取白色菌落置2 ml LB(含氨苄青霉素)液体培养基中，37℃摇床培养过夜，常规提取质粒，分别用限制性内切酶酶切法和以提取质粒为模板，按上述PCR法扩增目的基因，以进一步确定阳性重组菌落。
2 结果
2.1 cDNA文库免疫筛选阳性克隆的PCR扩增 从6个阳性克隆中，选择4个持续强阳性克隆进行PCR扩增。PCR的DNA产物分别约为1 100、1 000、800和500 bp。多次反复PCR反应，这些扩增产物稳定出现，说明这些DNA条带是血吸虫cDNA文库克隆的特异性扩增产物。这些PCR产物经纯化后，非特异性涂布状产物引物二聚体均消失，纯化效果良好。见图1。
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图1 PCR产物纯化前后的结果比较
泳道1、2、3、4为PCR纯化后产物，泳道5、6、7、8为PCR粗产物，M为200 bp梯度分子量
2.2 PCR产物DNA基因片段的亚克隆 4个cDNA扩增DNA基因片段亚克隆入pGEMT质粒，转染入工程菌E.coli XL1-blue,经蓝白斑粗筛，分别获得数十到数百个白色菌落。每个克隆挑取数个白色菌落，提取其质粒DNA，并用EcoRⅠ和NotⅠ限制性内切酶做双酶切，可切下与原PCR产物大小相同的DNA片段。再以该质粒为模板作PCR，也可扩增出与原PCR产物大小一致的DNA片段。两者均证明重组成功。见图2。
图2 重组克隆质粒酶切及PCR反应结果
泳道1、4、7、10为原PCR产物，泳道2、5、8、11为重组质粒双酶切产物，泳道3、6、9、12为重组质粒PCR产物，M为200 bp梯度分子量
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3 讨论
近年来，随着分子生物学、基因工程技术的飞速发展及其在寄生虫学方面的应用，人们开始致力于血吸虫病分子疫苗的研究〔5，6〕。由于分子疫苗安全性高且可大规模生产，对它的研究越来越受到重视。为获得具有一定保护力的疫苗候选抗原分子，我们用抗日本血吸虫童虫单抗筛选日本血吸虫cDNA文库，获得一批阳性克隆。从cDNA文库中筛选挑取阳性克隆后，其目的基因经PCR方法扩增，扩增的DNA基因片段若要亚克隆入一质粒载体，有许多方法可供使用，一般用酶切反应来进行。由于PCR扩增的线性DNA片段难以被酶水解，虽在PCR产物两端有已知的酶切位点，但常常酶切不完全，造成亚克隆失败。本次实验将PCR产物亚克隆入Promega专利产品pGEM-T载体质粒，结果表明，只要PCR产物达到一定纯度，则基因重组的概率较高，效果较好，为下一步工作奠定了基础。
本次实验用于筛选cDNA文库的抗日本血吸虫童虫膜抗原单抗，业已证实具有被动保护作用，且与抗血吸虫药物吡喹酮有协同杀虫作用〔8，9〕。因此，这些基因编码的相应抗原有作为日本血吸虫病分子疫苗候选成分的潜能。同时也说明使用针对性强、目的明确的单克隆抗体是筛选cDNA文库中的目标基因的一种有效途径。对重组质粒插入片段的DNA序列分析及再将这些DNA片段亚克隆入真核表达质粒的工作正在进行。
, 百拇医药
(南京医科大学寄生虫学教研室提供日本血吸虫cDNA文库供使用，张兆松等教授给予指导和帮助，特此致谢。)
基金项目：国家自然科学基金(39570646)，安徽省自然科学基金(95-医-028)资助
作者简介：沈际佳，男，43岁，副教授
蒋作君，男，44岁，教授
参考文献
1 Yole DS, Reid GD, Wilson RA et al. Protection against schistosoma mansoni and associated immune responses induced in the vervet monkey Cercopithe-Cus aethiops by irradiated cercaria vaccine. Am J Trop Med Hyg,1996;54(3):265～270
, 百拇医药
2 Shi YE, Jiang CF, Han JJ et al. Immunization of Pigs against infection with Schistosoma japonicum using ultraviolet-attenuated cercariae. Parasitology,1993;106(Pt5):459～462
3 陈淑贞，吴海玮，张兆松等. 一个定向克隆的日本血吸虫基因表达库. 中国人兽共患病杂志，1997；13(6)：23～25
4 汪 渊，桂淑玉. 鸡肌球蛋白轻链激酶表达载体的构建. 生物化学学报，1997；13(10)：520～524
5 Liu SH, Song GC, Xu YX et al. Progress in the development of a vaccine against Schistosomiasis in China. Int J Infect Dis,1998;2(3):176～180
6 刘述先. 血吸虫疫苗研制的策略、现状及展望. 中国血吸虫病防治杂志，1994；6(增刊)：47～49
8 沈际佳，蒋作君，汪学龙等. 血吸虫童虫膜单克隆抗体小鼠被动转移试验抗血吸虫感染作用. 中国实验与临床免疫学杂志，1999；15(1)：25～27
9 沈际佳，蒋作君，汪学龙等. 抗童虫膜单克隆抗体与吡喹酮协同杀血吸虫作用. 中国药理学通报，1998；14(5)：440～442
1999-04-01收稿，1999-06-01修回, http://www.100md.com