肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后的关系
作者：陆友金 汤一珍 刘丽华 孟 刚
单位：陆友金 汤一珍 安徽医科大学第一附属医院干部病房呼吸科；刘丽华 呼吸内科，合肥 230022；孟 刚 安徽医科大学病理解剖教研室，合肥 230032
关键词：肺肿瘤；遗传学；腺癌；基因；抑制；肿瘤；免疫组织化学
安徽医科大学学报990617 中国图书资料分类法分类号 R734.2
摘要 目的 探讨肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后关系。方法 采用免疫组织化学S-P方法观察42例肺腺癌组织p16蛋白的表达情况。结果 ①肺腺癌组织中p16蛋白表达的阳性率为76.2%，与分化程度和临床分期有关，并随着分化程度的降低而下降，高分化和低分化腺癌之间p16蛋白表达阳性率的差异有显著性(P<0.01)，并且临床分期越高，p16蛋白表达阳性率就越低，Ⅰ期、Ⅱ期肺腺癌p16蛋白表达与Ⅲa期、Ⅲb期比较差异有显著性(P<0.05)。②肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组术后3年生存率两组差异有显著性(P<0.05)。结论 p16蛋白表达缺失与肺癌发生发展有关，并与预后有相关(P<0.05)，检测肺癌组织有无p16蛋白表达可作为判断临床预后的指标。
, 百拇医药
Relationship between
expression of p16 protein and prognosis of lung adenocarcinoma
Lu Youjin, Tang Yizhen, Liu Lihua et al
(Respiratory Dept, The First Affilliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To examine the expression of p16 protein in lung adenocarcinoma and to approach the relationship of prognosis of lung adenocarcinoma between the p16 protein positive and the negative.Methods Using a rabbit polyclonal antihuman p16, the expression by p16 protein was studied immunohistochemically by formalin-fixed paraffin-embeded sections.Results The expressions of p16 protein in lung adnenocarcinoam tissues were 76.2% and correlated with tumor differentiation and different clinical stage and lower in poorly-differentiated adenocarcinomas compared with those in well-differentiated adenocarcinomas (P<0.05) and the expressions of p16 protein in stage Ⅰ and stage Ⅱ were higher than those in stage Ⅲa and stage Ⅲb(P<0.05);If compared the positive expression of p16 protein with the negative expression,three-year survival rates of postoperation was significantly different (P<0.05). Conclusion Loss of expression of p16 protein is correlated with the carcinoma genesis and prognosis(P<0.05). To examine the expression of p16 protein in lung adenocarcinoma may be considered as an index to predict prognosis
, 百拇医药
MeSH lung neoplasms/genet; adenocarcinoma; genes, tumor, suppressor; immunohistochemistry
p16基因是一种肿瘤抑制因子又称多肿瘤抑制因子1(MTS1，Multiple tumor suppressor)或CDKN2基因，定位于人染色体9p21区域，编码16 000D的蛋白产物，是在细胞周期中起重要作用的CDK4(cyclin-dependent kinase 4)抑制物，它的缺失可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白磷酸化，促进细胞从G1期向S期转变和细胞增殖，与非小细胞肺癌(NSCIC)及其它肿瘤发生、发展有密切相关。因此，该基因一经发现即引起人们的极大关注，并发现在人体多种肿瘤细胞系中存在该基因的缺失和突变〔1〕。我们应用免疫组织化学(简称免疫组化)方法观察肺腺癌组织p16蛋白表达情况，着重探讨与其预后的关系。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 标本 42例肺腺癌标本来自我科及胸外科1985～1995年间有完整随访资料的手术切除标本，取材后用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5 μm厚切片。每例肺癌组织切片均作HE染色。按国内肺腺癌组织学分级标准，将42例腺癌分为低分化腺癌12例，中分化腺癌14例，高分化腺癌16例，其中男性18例，女性24例，年龄46～73岁，平均(59±13)岁。按国际抗癌联盟1985年所订的分期法，Ⅰ期8例，Ⅱ期19例，Ⅲa期11例，Ⅲb期4例。42例均已死亡，并有完整随访资料。
1.2 免疫组化染色 采用S-P法。S-P试剂盒和兔抗p16多克隆抗体分别为福州迈新生物技术开发公司和Maxim Biotech,Inc产品，染色具体步骤如下：(1)石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS (pH 7.42)冲洗3次，每次3～5 min。(2)每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。(3)PBS(pH 7.4)冲洗(3×5 min，下同)。(4)每张切片加1滴或50 μl的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10 min，为减少非特异性背景，不必冲洗，只需吸去多余的液体。(5)每张切片加1滴或50 μl的第一抗体，室温下孵育60 min或4℃过夜。(6)PBS冲洗3×5 min。(7)每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。(8)PBS冲洗3×5 min。(9)每张切片加1滴或50 μl链亲和素—过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。(10)PBS冲洗3×5 min。(11)每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min。(12)自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。
, 百拇医药
1.3 结果判断 以细胞呈清晰棕色为阳性，按阳性细胞范围分为：+，细胞数<25%；┼┼，细胞数占25%～50%；┼┼┼，细胞数>50%。
1.4 结果统计 用卡方检验。
2 结果
2.1 肺腺癌组织p16蛋白的表达
2.1.1 p16蛋白在肺腺癌组织中表达的阳性率为76.2%。见表1。
表1 肺腺癌组织p16蛋白的表达 组织学类型
n
-
+
┼┼
, http://www.100md.com
┼┼┼
阳性率(%)
腺癌
42
10
7
16
8
76.2
2.1.2 肺腺癌p16蛋白表达的阳性率随着分化程度的降低而下降。见表2。
表2 p16蛋白表达与肺腺癌分化程度的关系 分化程度
n
, 百拇医药
阳性例数
阳性率(%)
高分化腺癌
16
15
93.7*
中分化腺癌
14
11
78.5
低分化腺癌
12
6
, 百拇医药
50.0
*与低分化腺癌比较：**P<0.01
2.1.3 在肺腺癌中p16蛋白表达因不同的病期而不同，肺腺癌分期越高，p16蛋白表达缺乏频率也越高。见表3。
表3 p16蛋白表达与肺腺癌临床分期的关系 分期
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅰ期
8
7
87.5
, 百拇医药
Ⅱ期
19
17
89.5△
Ⅲa期
11
6
54.5
Ⅲb期
4
2
50.0
与Ⅲb期肺癌比较：△P<0.05
, http://www.100md.com
2.2 肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后关系 肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组，术后3年生存率有显著差异(P<0.05)，术后1年和5年生存率无显著性差异(P>0.05)。见表4。
表4 肺腺癌组织p16蛋白表达与其术后生存率的关系 组 别
随访例数
≥1年
≥3年
≥5年
p16蛋白表达(+)
32
26(81.2%)
18(56.2%)*
, 百拇医药
6(18.7%)
p16蛋白表达(-)
10
8(80.0%)
2(20.0%)
0(0%)
两组比较：*P<0.05
3 讨论
我们应用免疫组化S-P方法研究42例人原发性肺腺癌p16蛋白的表达，结果发现：肺腺癌组织有p16蛋白表达，p16蛋白主要位于细胞浆，亦见细胞核和细胞膜阳性呈弥漫性或局灶性分布(见图1、2)。在肺腺癌组织中p16蛋白表达的阳性率为76.2%，表明在肺腺癌组织中存在明显的p16蛋白表达缺失，这与国内姜彦多等〔2〕报道一致。
, 百拇医药
我们在研究中发现p16蛋白在肺腺癌中有较高的表达，阳性率为76.2%；p16蛋白的阳性率随着肺腺癌的分化程度的降低而下降，且差异有显著性(P<0.01)，表明p16基因失活不仅与肺癌的发生有关，也与肺癌的分化不良有关，国内姜彦多等〔2〕报道p16蛋白在肺腺癌中表达的阳性率为87%，高于鳞癌和小细胞肺癌(P<0.01)，且鳞癌和腺癌p16蛋白的阳性率随着分化程度的降低而下降，高分化与低分化癌之间p16蛋白阳性率的差别有显著性(P<0.05)，与我们的报道一致。
图1 肺腺癌p16局灶性胞浆强阳性(×400,免疫组化S-P法)
图2 肺腺癌p16核浆强阳性(×400，免疫组化S-P法)
, 百拇医药
Shapiro用免疫组化方法对p16蛋白在NSCIC中的表达进行检测，其表达缺失率为66%，国内冉瑞琼等〔3〕报道伴转移的NSCIC p16基因的缺失率(72.7%)，高于未转移者(16.6%)，P<0.05，与Okamoto〔4〕、Reed〔5〕的结果类似，由此可见，在NSCIC和其细胞系中，CDKN2基因表达缺乏的频率，因不同的病期而不同，肺癌分期越高，CDKN2表达缺乏频率也越高。我们用免疫组化S-P方法检测42例临床不同分期的肺腺癌手术切除标本p16蛋白表达阳性率，结果发现Ⅰ期p16蛋白表达阳性率为87.5%；Ⅱ期为89.5%、Ⅲa期为54.5%、Ⅲb期为50%。经统计学处理Ⅰ期和Ⅱ期与Ⅲa期、Ⅲb期差异有显著性(P<0.05)，这一研究与上述报道相符合。
肺癌的预后，主要与组织学类型、分化程度、临床分期、治疗手段和发现早晚等因素有关。本实验研究42例肺腺癌经手术治疗后肺腺癌组织p16蛋白表达与预后关系。国外Kratzke等进行了100例切除的NSCIC标本Rb和CDKN2基因表达研究观察到p16蛋白表达缺乏与NSCIC患者生存期缩短相关。国内冉瑞琼等〔3〕研究发现p16基因缺失的肺癌患者术后存活时间短。本研究发现肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组中术后1年生存率两组差异无显著性(P>0.05)，术后3年生存率两组差异有显著性(P<0.05)。术后p16表达阳性26例中，有6例生存期大于5年，而p16表达阴性10例中无1例大于5年。两组术后5年生存率差异无统计学意义，可能是病例数少的原故。由此可见，肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后有相关性，可作为判断肺腺癌预后的指标。
, 百拇医药
综上所述，本研究可以得出以下结论：①在肺腺癌组织中有较高的p16蛋白表达缺失。②p16蛋白表达缺失与肺癌分化不良有关，随着分化程度降低而上升。③p16蛋白表达缺失与临床分期有关，临床分期越高，p16蛋白表达缺失的频率就越高。④肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后有一定关系，可作为临床判断预后的指标。
作者简介：陆友金，男，37岁，硕士，副主任医师
参考文献
1 Kamb A, Grui NA,Wearer-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Scince,1994;264(15):435
2 姜彦多，夏书月，载晓淳等.肺癌CDKN2基因产物表达的研究.中华结核和呼吸杂志，1996；19(2)：81～83
, 百拇医药
3 冉瑞琼，曹晓运，田 昱等.控制正常细胞对肺癌细胞p16基因缺失的污染方法的建立及其应用.中华结核和呼吸杂志，1997；20(3)：136～139
4 Oramoto A， Hussain SP， Hagrwara K et al. Mutations in the p16ink4/MTS1/CDKN2，p15ink4/MTS2,and p18 genes in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res,1995;55(11):1448～1451
5 Reed JA, Loganzo F, Shea CR et al. Loss of expression of the p16 gene in melanocytic lesions correlates with in vasive stage of tumor progression. Cancer Res,1995;55(11):2713
1999-08-03收稿，1999-11-02修回, http://www.100md.com
单位：陆友金 汤一珍 安徽医科大学第一附属医院干部病房呼吸科；刘丽华 呼吸内科，合肥 230022；孟 刚 安徽医科大学病理解剖教研室，合肥 230032
关键词：肺肿瘤；遗传学；腺癌；基因；抑制；肿瘤；免疫组织化学
安徽医科大学学报990617 中国图书资料分类法分类号 R734.2
摘要 目的 探讨肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后关系。方法 采用免疫组织化学S-P方法观察42例肺腺癌组织p16蛋白的表达情况。结果 ①肺腺癌组织中p16蛋白表达的阳性率为76.2%，与分化程度和临床分期有关，并随着分化程度的降低而下降，高分化和低分化腺癌之间p16蛋白表达阳性率的差异有显著性(P<0.01)，并且临床分期越高，p16蛋白表达阳性率就越低，Ⅰ期、Ⅱ期肺腺癌p16蛋白表达与Ⅲa期、Ⅲb期比较差异有显著性(P<0.05)。②肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组术后3年生存率两组差异有显著性(P<0.05)。结论 p16蛋白表达缺失与肺癌发生发展有关，并与预后有相关(P<0.05)，检测肺癌组织有无p16蛋白表达可作为判断临床预后的指标。
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Relationship between
expression of p16 protein and prognosis of lung adenocarcinoma
Lu Youjin, Tang Yizhen, Liu Lihua et al
(Respiratory Dept, The First Affilliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022)
Abstract Objective To examine the expression of p16 protein in lung adenocarcinoma and to approach the relationship of prognosis of lung adenocarcinoma between the p16 protein positive and the negative.Methods Using a rabbit polyclonal antihuman p16, the expression by p16 protein was studied immunohistochemically by formalin-fixed paraffin-embeded sections.Results The expressions of p16 protein in lung adnenocarcinoam tissues were 76.2% and correlated with tumor differentiation and different clinical stage and lower in poorly-differentiated adenocarcinomas compared with those in well-differentiated adenocarcinomas (P<0.05) and the expressions of p16 protein in stage Ⅰ and stage Ⅱ were higher than those in stage Ⅲa and stage Ⅲb(P<0.05);If compared the positive expression of p16 protein with the negative expression,three-year survival rates of postoperation was significantly different (P<0.05). Conclusion Loss of expression of p16 protein is correlated with the carcinoma genesis and prognosis(P<0.05). To examine the expression of p16 protein in lung adenocarcinoma may be considered as an index to predict prognosis
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MeSH lung neoplasms/genet; adenocarcinoma; genes, tumor, suppressor; immunohistochemistry
p16基因是一种肿瘤抑制因子又称多肿瘤抑制因子1(MTS1，Multiple tumor suppressor)或CDKN2基因，定位于人染色体9p21区域，编码16 000D的蛋白产物，是在细胞周期中起重要作用的CDK4(cyclin-dependent kinase 4)抑制物，它的缺失可增加CDK4的活性，导致Rb蛋白磷酸化，促进细胞从G1期向S期转变和细胞增殖，与非小细胞肺癌(NSCIC)及其它肿瘤发生、发展有密切相关。因此，该基因一经发现即引起人们的极大关注，并发现在人体多种肿瘤细胞系中存在该基因的缺失和突变〔1〕。我们应用免疫组织化学(简称免疫组化)方法观察肺腺癌组织p16蛋白表达情况，着重探讨与其预后的关系。
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1 材料与方法
1.1 标本 42例肺腺癌标本来自我科及胸外科1985～1995年间有完整随访资料的手术切除标本，取材后用10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，制成5 μm厚切片。每例肺癌组织切片均作HE染色。按国内肺腺癌组织学分级标准，将42例腺癌分为低分化腺癌12例，中分化腺癌14例，高分化腺癌16例，其中男性18例，女性24例，年龄46～73岁，平均(59±13)岁。按国际抗癌联盟1985年所订的分期法，Ⅰ期8例，Ⅱ期19例，Ⅲa期11例，Ⅲb期4例。42例均已死亡，并有完整随访资料。
1.2 免疫组化染色 采用S-P法。S-P试剂盒和兔抗p16多克隆抗体分别为福州迈新生物技术开发公司和Maxim Biotech,Inc产品，染色具体步骤如下：(1)石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS (pH 7.42)冲洗3次，每次3～5 min。(2)每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，以阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10 min。(3)PBS(pH 7.4)冲洗(3×5 min，下同)。(4)每张切片加1滴或50 μl的非免疫性动物血清(试剂B)，室温下孵育10 min，为减少非特异性背景，不必冲洗，只需吸去多余的液体。(5)每张切片加1滴或50 μl的第一抗体，室温下孵育60 min或4℃过夜。(6)PBS冲洗3×5 min。(7)每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。(8)PBS冲洗3×5 min。(9)每张切片加1滴或50 μl链亲和素—过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。(10)PBS冲洗3×5 min。(11)每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10 min。(12)自来水冲洗，苏木精复染，中性树胶封固。
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1.3 结果判断 以细胞呈清晰棕色为阳性，按阳性细胞范围分为：+，细胞数<25%；┼┼，细胞数占25%～50%；┼┼┼，细胞数>50%。
1.4 结果统计 用卡方检验。
2 结果
2.1 肺腺癌组织p16蛋白的表达
2.1.1 p16蛋白在肺腺癌组织中表达的阳性率为76.2%。见表1。
表1 肺腺癌组织p16蛋白的表达 组织学类型
n
-
+
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阳性率(%)
腺癌
42
10
7
16
8
76.2
2.1.2 肺腺癌p16蛋白表达的阳性率随着分化程度的降低而下降。见表2。
表2 p16蛋白表达与肺腺癌分化程度的关系 分化程度
n
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阳性例数
阳性率(%)
高分化腺癌
16
15
93.7*
中分化腺癌
14
11
78.5
低分化腺癌
12
6
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50.0
*与低分化腺癌比较：**P<0.01
2.1.3 在肺腺癌中p16蛋白表达因不同的病期而不同，肺腺癌分期越高，p16蛋白表达缺乏频率也越高。见表3。
表3 p16蛋白表达与肺腺癌临床分期的关系 分期
n
阳性例数
阳性率(%)
Ⅰ期
8
7
87.5
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Ⅱ期
19
17
89.5△
Ⅲa期
11
6
54.5
Ⅲb期
4
2
50.0
与Ⅲb期肺癌比较：△P<0.05
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2.2 肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后关系 肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组，术后3年生存率有显著差异(P<0.05)，术后1年和5年生存率无显著性差异(P>0.05)。见表4。
表4 肺腺癌组织p16蛋白表达与其术后生存率的关系 组 别
随访例数
≥1年
≥3年
≥5年
p16蛋白表达(+)
32
26(81.2%)
18(56.2%)*
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6(18.7%)
p16蛋白表达(-)
10
8(80.0%)
2(20.0%)
0(0%)
两组比较：*P<0.05
3 讨论
我们应用免疫组化S-P方法研究42例人原发性肺腺癌p16蛋白的表达，结果发现：肺腺癌组织有p16蛋白表达，p16蛋白主要位于细胞浆，亦见细胞核和细胞膜阳性呈弥漫性或局灶性分布(见图1、2)。在肺腺癌组织中p16蛋白表达的阳性率为76.2%，表明在肺腺癌组织中存在明显的p16蛋白表达缺失，这与国内姜彦多等〔2〕报道一致。
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我们在研究中发现p16蛋白在肺腺癌中有较高的表达，阳性率为76.2%；p16蛋白的阳性率随着肺腺癌的分化程度的降低而下降，且差异有显著性(P<0.01)，表明p16基因失活不仅与肺癌的发生有关，也与肺癌的分化不良有关，国内姜彦多等〔2〕报道p16蛋白在肺腺癌中表达的阳性率为87%，高于鳞癌和小细胞肺癌(P<0.01)，且鳞癌和腺癌p16蛋白的阳性率随着分化程度的降低而下降，高分化与低分化癌之间p16蛋白阳性率的差别有显著性(P<0.05)，与我们的报道一致。
图1 肺腺癌p16局灶性胞浆强阳性(×400,免疫组化S-P法)
图2 肺腺癌p16核浆强阳性(×400，免疫组化S-P法)
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Shapiro用免疫组化方法对p16蛋白在NSCIC中的表达进行检测，其表达缺失率为66%，国内冉瑞琼等〔3〕报道伴转移的NSCIC p16基因的缺失率(72.7%)，高于未转移者(16.6%)，P<0.05，与Okamoto〔4〕、Reed〔5〕的结果类似，由此可见，在NSCIC和其细胞系中，CDKN2基因表达缺乏的频率，因不同的病期而不同，肺癌分期越高，CDKN2表达缺乏频率也越高。我们用免疫组化S-P方法检测42例临床不同分期的肺腺癌手术切除标本p16蛋白表达阳性率，结果发现Ⅰ期p16蛋白表达阳性率为87.5%；Ⅱ期为89.5%、Ⅲa期为54.5%、Ⅲb期为50%。经统计学处理Ⅰ期和Ⅱ期与Ⅲa期、Ⅲb期差异有显著性(P<0.05)，这一研究与上述报道相符合。
肺癌的预后，主要与组织学类型、分化程度、临床分期、治疗手段和发现早晚等因素有关。本实验研究42例肺腺癌经手术治疗后肺腺癌组织p16蛋白表达与预后关系。国外Kratzke等进行了100例切除的NSCIC标本Rb和CDKN2基因表达研究观察到p16蛋白表达缺乏与NSCIC患者生存期缩短相关。国内冉瑞琼等〔3〕研究发现p16基因缺失的肺癌患者术后存活时间短。本研究发现肺腺癌组织p16蛋白表达阳性和阴性两组中术后1年生存率两组差异无显著性(P>0.05)，术后3年生存率两组差异有显著性(P<0.05)。术后p16表达阳性26例中，有6例生存期大于5年，而p16表达阴性10例中无1例大于5年。两组术后5年生存率差异无统计学意义，可能是病例数少的原故。由此可见，肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后有相关性，可作为判断肺腺癌预后的指标。
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综上所述，本研究可以得出以下结论：①在肺腺癌组织中有较高的p16蛋白表达缺失。②p16蛋白表达缺失与肺癌分化不良有关，随着分化程度降低而上升。③p16蛋白表达缺失与临床分期有关，临床分期越高，p16蛋白表达缺失的频率就越高。④肺腺癌组织p16蛋白表达与其预后有一定关系，可作为临床判断预后的指标。
作者简介：陆友金，男，37岁，硕士，副主任医师
参考文献
1 Kamb A, Grui NA,Wearer-Feldhaus J et al. A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types. Scince,1994;264(15):435
2 姜彦多，夏书月，载晓淳等.肺癌CDKN2基因产物表达的研究.中华结核和呼吸杂志，1996；19(2)：81～83
, 百拇医药
3 冉瑞琼，曹晓运，田 昱等.控制正常细胞对肺癌细胞p16基因缺失的污染方法的建立及其应用.中华结核和呼吸杂志，1997；20(3)：136～139
4 Oramoto A， Hussain SP， Hagrwara K et al. Mutations in the p16ink4/MTS1/CDKN2，p15ink4/MTS2,and p18 genes in primary and metastatic lung cancer. Cancer Res,1995;55(11):1448～1451
5 Reed JA, Loganzo F, Shea CR et al. Loss of expression of the p16 gene in melanocytic lesions correlates with in vasive stage of tumor progression. Cancer Res,1995;55(11):2713
1999-08-03收稿，1999-11-02修回, http://www.100md.com