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编号:10265957
体外大鼠肝细胞坏死性损伤模型的建立
http://www.100md.com 《安徽医科大学学报》 1999年第6期
     作者:杨 雁 陈敏珠

    单位:安徽医科大学临床药理研究所,合肥 230032

    关键词:肝;细胞;细胞培养的;疾病模型;动物;大鼠

    安徽医科大学学报990624

    摘要 目的 建立体外肝细胞坏死性损伤模型,为进一步研究药物对体外肝细胞损伤的保护作用奠定基础。方法 采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝实质细胞并进行体外培养,利用四氯化碳(CCl4)和过氧化氢(H2O2)体外诱导肝细胞坏死性损伤,检测ALT、AST、MDA、GSHpx等指标和采用MTT比色法。结果 CCl4体外诱导肝细胞损伤的最适损伤浓度和损伤时间为:8 mmol.L-1,6 h;H2O2体外诱导肝细胞坏死性损伤的最适损伤浓度和损伤时间为0.6 mmol.L-1,1 h。结论 利用最适损伤浓度的CCl4和H2O2分别与大鼠肝细胞共培养最适损伤时间,可建立两种理想的体外肝细胞坏死性损伤模型。
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    中国图书资料分类法分类号 R332;R575

    Establishment of necrotic injured models of

    primary hepatocytes from rats

    Yang Yan, Chen Minzhu

    (Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032)

    Abstract Objective To establish the nectotic injured models of hepatocytos in vitro for further studying protective effects of drugs on injured hepatocytes. Methods The hepatocytes were isolated by perfusion of liver with Ⅳ type collagenase in rats and incubated with CCl4 or H2O2. The necrotic hepatocytes induced by CCl4 or H2O2 were investigated by measuring the levels of AST and ALT, the amount of MDA and the activity of GSHpx, and MTT colormetry. Results The most optimal injured conditions of CCl4 or H2O2 were separately determined as CCl4: 8 mmol.L-1, 6 h; H2O2: 0.6 mmol.L-1, 1 h. Conclusion Two kinds of necrotic injured models of hepatocytes may be created separately by the most optimal injured conditions of CCl4 or H2O2.
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    MeSH liver/cytology; cells; culture, disease models, animal; rats

    在我国肝炎为常见病多发病,目前尚无令人满意的治疗方法。本实验采用Ⅳ型胶原酶灌流法分离大鼠肝实质细胞、进行体外培养,并建立四氯化碳(CCl4)和过氧化氢(H2O2)体外诱导肝细胞坏死性损伤的模型,选择CCl4和H2O2的最适损伤浓度和损伤时间,为进一步研究药物对体外肝细胞损伤的保护作用奠定基础。

    1 材料

    1.1 动物 SD大鼠,体重180~250 g,♀♂不拘,由安徽医科大学实验动物中心(皖医实动准字第01号)提供。

    1.2 主要试剂 Ⅳ型胶原酶(Sigma公司),RPMI1640培养基粉(Gibco公司),HEPES(Sigma公司),小牛血清(由本校微生物教研室提供),CCl4(安徽省蚌埠电化试剂厂,批号:940903),H2O2(上海桃浦化工厂,批号:950616),MTT(上海生化试剂公司进口分装),还原型谷胱甘肽(GSH,上海试剂三厂),二硫代2硝基苯甲酸(DTNB,Sigma公司),ALT、AST检测试剂盒(上海捷门生化试剂公司),硫代 比妥酸(TBA,上海试剂二厂,批号:9304),三氯醋酸(TCA,上海试剂三厂),1,1,3,3-四乙氧基丙烷(tetraethoxypropane, TEP)。
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    1.3 主要仪器 GLY-I型脏器灌流仪(北京真空仪表厂),Napco-6100型CO2培养箱(美杜帮公司),751分光光度计(上海分析仪器厂),GL20A型全自动高速冷冻离心机(湖南离心机厂),EL-301型酶联免疫检测仪(美国产)。

    2 方法

    2.1 大鼠肝细胞的分离和培养 参照文献〔1〕并加以改良。大鼠4%戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5%小牛血清的清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,200目尼龙网过滤,低速离心(500 r.min-1,1 min,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次。然后用完全1640培养液(内含10%小牛血清,105 U.L-1青霉素,100 mg.L-1链霉素和10 mg.L-1胰岛素)制成1×109.L-1肝细胞悬液〔2〕。分离的肝细胞经0.6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于90%,高碘酸雪夫反应显示糖原法〔3〕鉴定99%为肝实质细胞。
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    将上述肝细胞悬液分别加入24孔(每孔1 ml)和96孔(每孔0.1 ml)培养板中,置37℃,5%CO2培养箱中培养。12~16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长。

    2.2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立〔4,5〕 肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔(1~16 mmol.L-1),以少量的二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0.1%(体积分数)〕,作用不同时间(1~12 h)后,收集24孔板中培养上清检测AST,以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性;同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线。选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设3个复孔。

    2.3 H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立〔6〕 同法更换培养液,加入不同浓度的H2O2(0.2~3.2 mmol.L-1),作用不同时间(0.5~4 h)后,收集24孔板中培养上清检测ALT,测定肝细胞的MDA含量;同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反应。根据检测结果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线,选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设3个复孔。
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    2.4 检测指标

    2.4.1 AST、ALT的测定 培养的肝细胞经离心(1 800 r.min-1,10 min)后收集上清,按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST和(或)ALT活性,结果以U.(106 cell)-1表示。

    2.4.2 肝细胞增殖试验 采用MTT比色法〔7〕

    2.4.3 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSHpx)活性的测定 参照文献〔8〕先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清,加入0.2% Triton-100水溶液0.5 ml,混匀,2 min后,离心(2 500 r.min-1,10 min),取上清液(肝细胞样品)0.4 ml,另设样品空白管,非酶反应管和试剂空白管,按参考文献〔8〕操作顺序加入各种试剂。混匀后立即计时,静置12 min后,以样品空白管调零点,于423 nm波长处读得吸光度(A)值。在GSH标准曲线上查出对应的GSH波度。GSHpx酶活力单位是在37℃,pH6.5条件下,每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位。计算公式为:GSHpx活力单位=([GSH]非酶管-[GSH]样品管-[GSH]试剂空白管)/3。结果以U.(106 cell)-1表示。
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    2.4.4 肝细胞丙二醛(MDA)含量的测定〔9〕 先制备MDA标准曲线。弃肝细胞培养上清,加入生理盐水1 ml,混匀,移入离心管中,离心(2 500 r.min-1,10 min),弃上清,加15% TCA 2 ml,破坏细胞并沉淀蛋白质,加入0.67% TBA 2 ml,于沸水浴中加热30 min。根据样本的吸光度值在标准曲线上查出对应的浓度,结果以 nmol.(106 cell)-1表示。

    2.5 数据处理 数据以±s表示,计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系,采用直线相关和回归分析。

    3 结果

    3.1 CCl4诱导大鼠肝细胞损伤的量效与时效曲线 不同浓度CCl4(1、2、4、8和16 mmol.L-1)与原代肝细胞作用6 h,检测各项指标(表1)。结果表示,随CCl4浓度的增大,反映肝细胞增殖的MTT反应明显抑制,肝细胞的MDA增多和GSHpx下降,但培养上清中AST逐渐升高。根据CCl4损伤大鼠肝细胞的量效曲线(表1、图1),我们选择8 mmol.L-1 CCl4为最适损伤浓度。将8 mmol.L-1 CCl4加入培养的原代肝细胞中,作用1和3 h,AST和GSHpx均无明显变化,作用6 h,AST释放明显增多,而细胞内GSHpx明显减少,作用12 h,培养上清中AST继续增高,但肝细胞的GSHpx已不再下降。根据CCl4损伤大鼠肝细胞的时效曲线(表2、图2),我们选择6 h为最适损伤时间。
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    图1 CCl4诱导大鼠肝细胞损伤的量效曲线

    表1 不同浓度CCl4对原代培养大鼠肝细胞的影响(±s) 组别

    浓度(mmol.L-1)

    ASTa(n=8)

    〔U.(106 cell)-1

    MDA(n=4)

    〔nmol.(106 cell)-1
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    GSHpx(n=4)

    〔U.(106 cell)-1

    MTT(n=5)

    A570 nm

    Control

    -

    71.37±21.92

    8.84±0.76

    25.00±1.80

    0.28±0.04

    CCl4
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    1

    87.63±28.35

    10.34±0.79*

    22.96±2.52

    ND

    2

    99.83±20.70*

    10.92±1.10*

    23.12±2.36

    0.21±0.04*

    4
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    97.29±17.78*

    11.62±1.89*

    21.56±1.84*

    0.25±0.05

    8

    107.45±24.82**

    11.69±1.31**

    21.44±0.72*

    0.22±0.02*

    16

    107.20±30.36*
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    10.59±1.16

    19.60±0.60**

    0.21±0.03*

    分离的大鼠肝细胞与不同浓度CCl4(1、2、4、8或16 mmol.L-1)共培养6 h。 与对照组比较:P<0.05,**P<0.01。ND:未测定,a为肝细胞培养上清中的AST。图1中数据与表1中相同

    图2 CCl4诱导大鼠肝细胞损伤的时效曲线

    表2 CCl4不同损伤时间对原代培养大鼠肝细胞的影响(±s) 组别
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    时间(h)

    n

    ASTa〔U.(106 cell)-1

    n

    GSHpx〔U.(106 cell)-1

    Control

    -

    8

    71.37±21.92

    6
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    25.34±2.47

    CCl4

    1

    6

    72.39±3.64

    4

    25.73±0.83

    (8 mmol.L-1)

    3

    6

    78.48±4.06

    4
, 百拇医药
    23.49±0.98

    6

    8

    107.45±24.82**

    4

    15.73±3.44**

    12

    4

    125.75±6.92**

    4

    19.85±1.45**

    大鼠肝细胞与CCl4(8 mmol.L-1) 共培养1, 3, 6或12 h。 与对照组比较:**P<0.01。a为肝细胞培养上清中的AST
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    3.2 H2O2诱导大鼠肝细胞损伤的最效与时效曲线 不同浓度的H2O2(0.2、0.4、0.6、0.8、1.6、3.2 mmol.L-1)与肝细胞共育1 h,至ALT和MDA含量呈浓度依赖性地增加,0.6 mmol.L-1以上浓度则递增缓慢(表3、图3),故选择0.6 mmol.L-1为最适损伤浓度。将H2O2(0.6 mmol.L-1)加入培养的肝细胞中,分别作用0.5、1、2、3和4 h,培养上清中ALT水平随H2O2作用时间的延长而逐渐增加,肝细胞增殖则呈时间依赖性地降低(表4、图4)。据此我们选择1 h作为最适损伤时间。

    表3 不同浓度H2O2对原代培养大鼠肝细胞的影响(±s, n=4) 组别
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    浓度(mmol.L-1)

    ALTa

    〔U.(106 cell)-1

    MDA

    〔nmol.(106 cell)-1

    Control

    -

    30.70±3.45

    4.98±0.73

, 百拇医药     H2O2

    0.2

    47.60±3.46

    6.47±0.61*

    0.4

    54.41±10.38*

    6.75±0.79*

    0.6

    60.43±4.49**

    8.16±0.70**

    0.8
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    62.92±9.78**

    8.77±0.44**

    1.6

    82.19±19.94**

    9.66±1.08**

    3.2

    83.34±12.75**

    9.66±1.05**

    分离的大鼠肝细胞与不浓度H2O2(0.2,0.4,0.6, 0.8,1.6或3.2 mmol.L-1)共培养1 h。 与对照组比较:*P<0.05,**P<0.01。
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    a为肝细胞培养上清中的ALT

    图3 H2O2诱导大鼠肝细胞损伤的量效曲线

    表4 H2O2不同损伤时间对原代培养大鼠肝细胞的影响(±s, n=4) 组别

    时间(h)

    ALTa〔U.(106 cell)-1

    MTT A570 nm
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    Control

    -

    30.70±3.45

    0.30±0.03

    H2O2

    0.5

    47.66±7.95*

    0.25±0.01*

    (0.6 mmol.L-1)

    1

    60.43±4.49**
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    0.24±0.02*

    2

    70.68±13.45**

    0.22±0.03**

    3

    81.04±13.45**

    0.12±0.02**

    4

    86.79±16.94**

    0.1±0.02**

    大鼠肝细胞与H2O2(0.6 mmol.L-1)共培养0.5、1、2、3或4 h。与对照组比较:P<0.05,..P<0.01。a为肝细胞培养上清中的ALT
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    图4 H2O2诱导大鼠肝细胞损伤的时效曲线

    4 讨论

    在多种肝病(包括炎症/免疫介导肝细胞损伤、酒精性肝损伤和缺血再灌注性肝损伤等)的肝细胞损伤中氧化应激是它们的共同损伤机制。据此,我们采用原代培养大鼠肝细胞的方法,分别建立了CCl4和H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型。

    CCl4可经肝细胞的细胞色素P450Fe2+作用产生O2.,并通过自由基反应扩展程序产生CCl3·和CCl3OO.等自由基〔10〕。O2.可经SOD转化为H2O2,后者又经铁离子(Fe3+)促发Fenton反应生成羟自由基(OH.);H2O2可直接弥散入细胞内与各种细胞成分相互作用,且在富含铁的肝细胞内也转变为OH.。OH.等自由基可致DNA键断裂,并与细胞的重要成分起反应,亦可攻击膜磷脂中的多不饱和脂肪酸(PUFA),引发膜脂质过氧化链式反应〔11,12〕,双链脂肪酸过氧化(聚合)即使MDA形成增多,肝细胞膜通透性增加,使ALT与AST释放增加。同时CCl4和H2O2均可促进GSHpx和GSH等抗氧化物消耗增多而水平下降,清除自由基功能也下降,损伤进一步加重。据此,本模型选择培养上清中ALT或(和)AST,肝细胞的GSHpx活性以及MDA含量和GSH水平作为评价肝细胞损伤的指标。
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    因H2O2的作用更直接,故其与肝细胞作用1 h,已出现明显的肝细胞损伤。CCl4需作用6 h才发生明显的肝细胞坏死性损伤,但作用较持久,由于CCl3.和CCl3OO.的加入,细胞毒性也较明显。因ALT绝大部分位于细胞浆,而AST主要位于线粒体,少部分位于胞浆〔13〕。肝细胞受损较轻仅使细胞膜通透性增加时,胞浆内ALT和AST释放,而线粒体内AST则不释放,在肝细胞严重受损时,线粒体内AST才释出。我们预试中发现在CCl4作用3 h时,ALT出现明显升高,而6 h时,却下降,此时,AST升高明显,与细胞损伤较严重致线粒体内AST释出有关。而因H2O2是短时间急性损伤,致胞浆ALT和AST释出,且以ALT为主,因此,此模型中ALT较敏感。

    综上所述,通过对CCl4和H2O2诱导大鼠肝细胞坏死性损伤的最适损伤浓度和最适损伤时间的选择,并且经多项检测指标证明,上述两模型是较为理想的肝细胞氧化应激损伤模型,为进一步开展药物的保肝作用研究奠定了基础。
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    基金项目:安徽省教委课题基金资助(编号:95JL0069)

    作者简介:杨 雁,女,35岁,副教授,博士

    陈敏珠,女,66岁,教授,博士生导师

    参考文献

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    1999-09-22收稿,1999-10-14修回, http://www.100md.com