血液透析对尿毒症患者中性粒细胞粘附分子表达的影响
作者：王德光 李希杰 余学清 孔庆瑜 纪玉莲
单位：中山医科大学第一附属医院肾内科，广州 510080
关键词：尿毒症；治疗；血液透析；透析膜；中性白细胞；细胞粘附
安徽医科大学学报000313 摘要 目的 探讨血液透析对尿毒症患者外周血中性粒细胞表面粘附分子CD11b、CD62L表达的影响。方法 采用单克隆技术及流式细胞分析技术检测血透过程中尿毒症患者中性粒细胞表面CD11b、CD62L的表达水平，观察不同透析膜对其的影响。结果 尿毒症患者单次透析前中性粒细胞CD11b的表达密度增高，CD62L的表达密度降低；血透开始后，中性粒细胞表达CD11b的表达迅速上升，CD62L的表达则明显下降，铜仿膜组(CU)与聚枫膜组(PS)相比无差异。结论 血液透析对中性粒细胞粘附分子的表达有规律性的影响，这可能损害了中性粒细胞的粘附能力，削弱了机体的免疫力。
, 百拇医药
中图分类号 R692.5
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0199-03
Effects on the expression of CD11b, CD62L by
granolocytes during hemodialysis
Wang Deguang, Li Xijie, Yu Xueqing et al
(Dept of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen
University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
, 百拇医药
Abstract Objective To investigate the changing role of granulocytes CD11b, CD62L expression in patients during hemodialysis. Methods The expressions of CD11b,CD62L on granulocytes were assessed by flow cytometry. Results A significant upregulation of the CD11b, and a downregulation of the CD62L were found in uremic patients before a single hemodialysis, as compared to normal group. Shortly after hemodialysis the expression of CD11b increased rapidly, while that of CD62L decreased significantly. There was no statistical difference between CU group and PS group in the magnitudes of these changes. Conclusion The turbulence of granulocytes CD11b, CD62L expression were found not only during hemodialysis but also before a single hemodialysis course. All of these changes are not associated with the dialyzer membranes.
, 百拇医药
MeSH uremia/therapy; hemodialysis; neutrophils; cell adhesion
目前的研究发现粘附分子的表达在炎症细胞的游走聚集、免疫细胞的激活过程中起重要作用。尿毒症毒素、代谢紊乱及血液透析可能通过影响白细胞表面粘附分子的正常表达而降低慢性血透患者免疫能力。因此，本研究探讨20例慢性透析患者透析过程中中性粒细胞CD11b、CD62L的表达规律及不同透析膜对其的影响。
1 对象和方法
1.1 研究对象的选择及分组 20例均为我院人工肾透析的稳定性慢性终末期肾功能衰竭患者，原发病为慢性肾小球肾炎，每周透析3次，每次4 h，透析器均为首次应用，采用碳酸氢盐透析，维持透析时间≤12月，随机分为两组：①铜仿膜组(CU)，10例，男9例，女1例，年龄18～62岁，平均(43.0±14.5)岁，平均透析时间(5.4±4.0)月。②聚枫膜组(PS)：10例，男7例，女3例，年龄27～60岁，年龄27～60岁，平均(43.7±9.1)岁，平均透析时间(5.8±4.0)月。并设健康对照组，10例，为体检者及健康自愿者，男8例，女2例，年龄20～70岁，平均(39.1±14.6)岁。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 在血透患者透析前、透析开始后30 min、结束时(240 min)从血管通路动脉端各留取血标本1 ml，健康对照组于早晨08：00抽取空腹血标本1 ml，EDTA抗凝后送流式细胞仪室检查。
1.2.2 白细胞的准备 每份标本编两个试管，一管加入20 μl对照试剂，另一管加入FITC-CD62L、PE-CD11b单克隆抗体20 μl。每管各加入全血100 μl，在室温(18～25℃)下避光孵育15 min后加入流式细胞仪工作液，放入Q-prep标本制备仪上自动溶解红细胞。把溶解红细胞后的标本以2 000 r*min-1离心5 min，去上清后加入0.3 ml磷酸盐缓冲液。
1.2.3 流式细胞仪分析 激光管预热30 min后用荧光微球调整仪器，使各放大器接受信号的HCV(half coefficient of variation)值<2%，根据细胞大小、所含颗粒性质，用前向散光(forward light scatter,FSC)和侧向散光(linear side scatter,SSC)把中性粒细胞与单核细胞、淋巴细胞区分开来。以对照管作为空白定标，计算5 000个中性粒细胞，记录标本的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。
, http://www.100md.com
1.3 统计学分析 所有数据均以
±s表示，采用单因素方差分析，所有统计均由SPSS 7.5完成。
2 结果
2.1 单次透析前中性粒细胞CD11b、CD62L表达与健康对照组比较 见表1。从表1可见，透析组中性粒细胞CD11b表达密度明显升高，CD62L表达明显降低，与健康对照组比较差异有显著性，铜仿膜组与聚枫膜组相比无显著性差异。说明血液透析前就已存在中性粒细胞高CD11b，低CD62L现象。
2.2 透析过程中性粒细胞CD11b、CD62L表达 由表2可见，透析开始30 min后CD11b表达迅速上升，在透析结束时仍保持较高水平；而CD62L表达迅速下降，在透析结束时恢复到透前值，但在透析过程中各时段，铜仿膜组与聚枫膜组中性粒细胞CD11b、CD62L表达差异均无显著性。
, 百拇医药
表1 单次透析前中性粒细胞CD11b、CD62L
表达与健康对照组比较(n=10) 组别
CD11b
CD62L
对照组
20.2±3.5
3.25±1.50
CU组
28.5±11.4*
1.56±0.56**
PS组
, 百拇医药
31.7±9.7**
1.54±0.42**
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 透析过程中性粒细胞CD11b、CD62L表达(n=10) 时间(min)
CD11b(MFI)
CD62L(MFI)
CU组
PS组
CU组
PS组
0
, 百拇医药
28.5±11.4
31.7±9.7
1.56±0.56
1.54±0.42
30
40.3±8.4**
37.2±10.7
0.95±0.38*
1.06±0.44*
240
39.1±11.3**
, http://www.100md.com
40.6±6.6*
1.57±0.64
1.64±0.56
与透析开始时比较：*P<0.05，**P<0.013 讨论
CD62L又称白细胞选择素，主要表达在中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞表面，它通过与唾液酸化路易斯寡糖结合介导白细胞沿血管内皮细胞滚动；CD11b属整合素家族的成员，主要表达在中性粒细胞和单核细胞表面，它和免疫球蛋白超家族类粘附分子的相互作用介导中性粒细胞与血管内皮细胞紧密粘附，这两个过程是白细胞尤其是中性粒细胞发挥抗炎作用不可缺少的，它们的缺乏可导致机体反复发生严重而致命的感染〔1,2〕。慢性血透患者感染的发生率与致死率高，可能是尿毒症毒素和血透通过影响粘附分子的正常表达而干扰了中性粒细胞向炎症部位游走、聚集和吞噬。
, 百拇医药
我们经研究发现，单次透析前患者外周血中性粒细胞已出现高CD11b、低CD62L表达，铜仿膜组与聚枫膜组透析前相比并无统计学意义，Zachee等〔3〕研究发现间隔2天与间隔3天的血透患者透析前中性粒细胞CD11b、CD62L表达与从未透析终末期尿毒症患者比较无差异。这说明尿毒症毒素、尤其是循环中浓度相对稳定的中、高分子毒素可能是引起中性粒细胞CD11b表达上升CD62L表达下降的因素。
本组用铜仿膜透析时发现：中性粒细胞表达CD11b在透析30 min时达高峰，透析结束时比峰值稍低；CD62L表达在透析30 min时降至最低，透析结束时恢复到透析前水平，与文献〔3〕报道相符；Himmelfarb等〔4〕研究发现具有补体激活作用的透析膜才引起中性粒细胞CD11b(MAC-1)表达升高，CD62L(LAM-1)表达降低，并在体外研究中发现外源性C5a可使中性粒细胞CD11b表达增加。因此认为激活的补体与白细胞上相应的受体结合，引起CD11b表达上调。但令人感兴趣的是：我们在通常认为生物学相容性好的合成膜(PS膜)透析时中性粒细胞也出现这种变化，而且在透析过程中各时段与铜仿膜透析组差异均无显著性，尽管聚枫膜并无明显的补体激活作用。国外也有文献观察到这种现象〔3〕。推测其可能原因为：①生物学相容性好的透析膜引起极少量的补体激活，尽管常规方法无法测出，但足以引起中性粒细胞CD11b表达的增加〔5〕；②循环的中性粒细胞与透析膜吸附的C3a反复作用〔6〕；③除补体外，其他因素亦可能会导致中性粒细胞CD11b表达的增加，如循环的中性粒细胞与透析膜的反复作用〔6〕、透析液来源的细菌碎片或代谢产物〔7〕等。
, 百拇医药
国外研究证实高CD11b、低CD62L表现型的中性粒细胞不能穿过血内皮细胞进入炎症部位〔8〕、对内外源性刺激物的反应性及吞噬活性降低〔9〕；Thylen等〔10〕还发现中性粒细胞CD11b/CD18的表达在透析结束8 h后仍不能恢复到透析前的水平，这说明高CD11b、低CD62L表现型的中性粒细在抗感染方面确实存在明显缺陷，这也可以解释慢性血透患者感染为什么多发生在透析过程中及透析后的短时间内〔11〕。
总之，血透过程可引起中性粒细胞粘附分子CD11b、CD62L表达的规律性变化，这可能削弱了机体的抵抗力，增加慢性血透患者的感染率及感染严重程度。
作者简介：王德光，男，31岁，硕士，现在安徽省立医院肾内科，合肥 230001
余学清，男，38岁，博士，教授，主任医师，博士生导师，肾内科主任，中华肾脏病学会常委
, 百拇医药
参考文献
1，Arnaout MA. Leukocyte adhesion molecules deficiency:Its structural basis, pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response. Immunol Rev,1990;114:145～180
2，Etzioni A, Frydman M, Pollack S et al. Recurrent severe infections caused by a novel leukocyte adhesion deficiency. N Engl J Med,1992;327(25):1 789～1 792
3，Zachee P, Daelemans R, Pollaris P et al. Neutrophil adhesion molecules in chronic hemodialysis patients. Nephron,1994;68(2):192～196
, 百拇医药
4，Himmelfarb J, Zaoui P, Holbrook D. Modulation of granulocyte LAM-1 and MAC-1 during dialysis-A prospective, randomized controlled trial. Kidney Int,1992;41(2):388～395
5，Chenoweth DE, Cheung AK, Henderson LW. Anyphalatoxin formation during hemodialysis. Effects of different dialyzer membranes. Kidney Int,1983;24(6):764～769
6，Cheung AK, Parker CJ, Wilcox LA et al. Activation of complement by dialysis membranes:polyacrylonitrile binds more C3a than cuprohan. Kidney Int,1990;37(4):1 055～1 059
, http://www.100md.com
7，Laude-Sharp M,Caroff M, Simard L et al. Induction of IL-1 during hemodialysis: Transmembrane passage of intact endotoxins (LPS). Kidney Int,1990;38(6):1 089～1 094
8，Jutila MA, Rott L, Berg EL et al. Function and regulation of the neutrophil MEL-14 antigen in vivo. Comparison with LFA-1 and MAC-1. J Immunol,1989;143(10):3 318～3 324
9，Saeki A, Kaito K, Kobayashi M. Imparired neutrophil function in chronic renal failure-dysregulation of surface adhesion molecule expression and phagocytosis. Nippon jinzo Gakkai Shi,1996;38(12):585～594
, 百拇医药
10，Thylen P,Fernvik E, Lundahl J et al. Monocyte and granulocyte CD11b/CD18,CD62L expression and sICAM-1 concentration in the interdialytic period. Nephron,1996;74(2):275～282
11，Quarles LD, Rutski EA, Rostand SG. Staphylococcus aureus bacteremia in pathents on chronic hemodialysis. Am J Kidney Dis,1985;6(6):412～419
2000-03-16收稿，2000-04-20修回, 百拇医药
单位：中山医科大学第一附属医院肾内科，广州 510080
关键词：尿毒症；治疗；血液透析；透析膜；中性白细胞；细胞粘附
安徽医科大学学报000313 摘要 目的 探讨血液透析对尿毒症患者外周血中性粒细胞表面粘附分子CD11b、CD62L表达的影响。方法 采用单克隆技术及流式细胞分析技术检测血透过程中尿毒症患者中性粒细胞表面CD11b、CD62L的表达水平，观察不同透析膜对其的影响。结果 尿毒症患者单次透析前中性粒细胞CD11b的表达密度增高，CD62L的表达密度降低；血透开始后，中性粒细胞表达CD11b的表达迅速上升，CD62L的表达则明显下降，铜仿膜组(CU)与聚枫膜组(PS)相比无差异。结论 血液透析对中性粒细胞粘附分子的表达有规律性的影响，这可能损害了中性粒细胞的粘附能力，削弱了机体的免疫力。
, 百拇医药
中图分类号 R692.5
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0199-03
Effects on the expression of CD11b, CD62L by
granolocytes during hemodialysis
Wang Deguang, Li Xijie, Yu Xueqing et al
(Dept of Nephrology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen
University of Medical Sciences, Guangzhou 510080)
, 百拇医药
Abstract Objective To investigate the changing role of granulocytes CD11b, CD62L expression in patients during hemodialysis. Methods The expressions of CD11b,CD62L on granulocytes were assessed by flow cytometry. Results A significant upregulation of the CD11b, and a downregulation of the CD62L were found in uremic patients before a single hemodialysis, as compared to normal group. Shortly after hemodialysis the expression of CD11b increased rapidly, while that of CD62L decreased significantly. There was no statistical difference between CU group and PS group in the magnitudes of these changes. Conclusion The turbulence of granulocytes CD11b, CD62L expression were found not only during hemodialysis but also before a single hemodialysis course. All of these changes are not associated with the dialyzer membranes.
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MeSH uremia/therapy; hemodialysis; neutrophils; cell adhesion
目前的研究发现粘附分子的表达在炎症细胞的游走聚集、免疫细胞的激活过程中起重要作用。尿毒症毒素、代谢紊乱及血液透析可能通过影响白细胞表面粘附分子的正常表达而降低慢性血透患者免疫能力。因此，本研究探讨20例慢性透析患者透析过程中中性粒细胞CD11b、CD62L的表达规律及不同透析膜对其的影响。
1 对象和方法
1.1 研究对象的选择及分组 20例均为我院人工肾透析的稳定性慢性终末期肾功能衰竭患者，原发病为慢性肾小球肾炎，每周透析3次，每次4 h，透析器均为首次应用，采用碳酸氢盐透析，维持透析时间≤12月，随机分为两组：①铜仿膜组(CU)，10例，男9例，女1例，年龄18～62岁，平均(43.0±14.5)岁，平均透析时间(5.4±4.0)月。②聚枫膜组(PS)：10例，男7例，女3例，年龄27～60岁，年龄27～60岁，平均(43.7±9.1)岁，平均透析时间(5.8±4.0)月。并设健康对照组，10例，为体检者及健康自愿者，男8例，女2例，年龄20～70岁，平均(39.1±14.6)岁。
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1.2 实验方法
1.2.1 标本采集 在血透患者透析前、透析开始后30 min、结束时(240 min)从血管通路动脉端各留取血标本1 ml，健康对照组于早晨08：00抽取空腹血标本1 ml，EDTA抗凝后送流式细胞仪室检查。
1.2.2 白细胞的准备 每份标本编两个试管，一管加入20 μl对照试剂，另一管加入FITC-CD62L、PE-CD11b单克隆抗体20 μl。每管各加入全血100 μl，在室温(18～25℃)下避光孵育15 min后加入流式细胞仪工作液，放入Q-prep标本制备仪上自动溶解红细胞。把溶解红细胞后的标本以2 000 r*min-1离心5 min，去上清后加入0.3 ml磷酸盐缓冲液。
1.2.3 流式细胞仪分析 激光管预热30 min后用荧光微球调整仪器，使各放大器接受信号的HCV(half coefficient of variation)值<2%，根据细胞大小、所含颗粒性质，用前向散光(forward light scatter,FSC)和侧向散光(linear side scatter,SSC)把中性粒细胞与单核细胞、淋巴细胞区分开来。以对照管作为空白定标，计算5 000个中性粒细胞，记录标本的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)。
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1.3 统计学分析 所有数据均以
±s表示，采用单因素方差分析，所有统计均由SPSS 7.5完成。2 结果
2.1 单次透析前中性粒细胞CD11b、CD62L表达与健康对照组比较 见表1。从表1可见，透析组中性粒细胞CD11b表达密度明显升高，CD62L表达明显降低，与健康对照组比较差异有显著性，铜仿膜组与聚枫膜组相比无显著性差异。说明血液透析前就已存在中性粒细胞高CD11b，低CD62L现象。
2.2 透析过程中性粒细胞CD11b、CD62L表达 由表2可见，透析开始30 min后CD11b表达迅速上升，在透析结束时仍保持较高水平；而CD62L表达迅速下降，在透析结束时恢复到透前值，但在透析过程中各时段，铜仿膜组与聚枫膜组中性粒细胞CD11b、CD62L表达差异均无显著性。
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表1 单次透析前中性粒细胞CD11b、CD62L
表达与健康对照组比较(n=10) 组别
CD11b
CD62L
对照组
20.2±3.5
3.25±1.50
CU组
28.5±11.4*
1.56±0.56**
PS组
, 百拇医药
31.7±9.7**
1.54±0.42**
与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01表2 透析过程中性粒细胞CD11b、CD62L表达(n=10) 时间(min)
CD11b(MFI)
CD62L(MFI)
CU组
PS组
CU组
PS组
0
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28.5±11.4
31.7±9.7
1.56±0.56
1.54±0.42
30
40.3±8.4**
37.2±10.7
0.95±0.38*
1.06±0.44*
240
39.1±11.3**
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40.6±6.6*
1.57±0.64
1.64±0.56
与透析开始时比较：*P<0.05，**P<0.013 讨论
CD62L又称白细胞选择素，主要表达在中性粒细胞、单核细胞及淋巴细胞表面，它通过与唾液酸化路易斯寡糖结合介导白细胞沿血管内皮细胞滚动；CD11b属整合素家族的成员，主要表达在中性粒细胞和单核细胞表面，它和免疫球蛋白超家族类粘附分子的相互作用介导中性粒细胞与血管内皮细胞紧密粘附，这两个过程是白细胞尤其是中性粒细胞发挥抗炎作用不可缺少的，它们的缺乏可导致机体反复发生严重而致命的感染〔1,2〕。慢性血透患者感染的发生率与致死率高，可能是尿毒症毒素和血透通过影响粘附分子的正常表达而干扰了中性粒细胞向炎症部位游走、聚集和吞噬。
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我们经研究发现，单次透析前患者外周血中性粒细胞已出现高CD11b、低CD62L表达，铜仿膜组与聚枫膜组透析前相比并无统计学意义，Zachee等〔3〕研究发现间隔2天与间隔3天的血透患者透析前中性粒细胞CD11b、CD62L表达与从未透析终末期尿毒症患者比较无差异。这说明尿毒症毒素、尤其是循环中浓度相对稳定的中、高分子毒素可能是引起中性粒细胞CD11b表达上升CD62L表达下降的因素。
本组用铜仿膜透析时发现：中性粒细胞表达CD11b在透析30 min时达高峰，透析结束时比峰值稍低；CD62L表达在透析30 min时降至最低，透析结束时恢复到透析前水平，与文献〔3〕报道相符；Himmelfarb等〔4〕研究发现具有补体激活作用的透析膜才引起中性粒细胞CD11b(MAC-1)表达升高，CD62L(LAM-1)表达降低，并在体外研究中发现外源性C5a可使中性粒细胞CD11b表达增加。因此认为激活的补体与白细胞上相应的受体结合，引起CD11b表达上调。但令人感兴趣的是：我们在通常认为生物学相容性好的合成膜(PS膜)透析时中性粒细胞也出现这种变化，而且在透析过程中各时段与铜仿膜透析组差异均无显著性，尽管聚枫膜并无明显的补体激活作用。国外也有文献观察到这种现象〔3〕。推测其可能原因为：①生物学相容性好的透析膜引起极少量的补体激活，尽管常规方法无法测出，但足以引起中性粒细胞CD11b表达的增加〔5〕；②循环的中性粒细胞与透析膜吸附的C3a反复作用〔6〕；③除补体外，其他因素亦可能会导致中性粒细胞CD11b表达的增加，如循环的中性粒细胞与透析膜的反复作用〔6〕、透析液来源的细菌碎片或代谢产物〔7〕等。
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国外研究证实高CD11b、低CD62L表现型的中性粒细胞不能穿过血内皮细胞进入炎症部位〔8〕、对内外源性刺激物的反应性及吞噬活性降低〔9〕；Thylen等〔10〕还发现中性粒细胞CD11b/CD18的表达在透析结束8 h后仍不能恢复到透析前的水平，这说明高CD11b、低CD62L表现型的中性粒细在抗感染方面确实存在明显缺陷，这也可以解释慢性血透患者感染为什么多发生在透析过程中及透析后的短时间内〔11〕。
总之，血透过程可引起中性粒细胞粘附分子CD11b、CD62L表达的规律性变化，这可能削弱了机体的抵抗力，增加慢性血透患者的感染率及感染严重程度。
作者简介：王德光，男，31岁，硕士，现在安徽省立医院肾内科，合肥 230001
余学清，男，38岁，博士，教授，主任医师，博士生导师，肾内科主任，中华肾脏病学会常委
, 百拇医药
参考文献
1，Arnaout MA. Leukocyte adhesion molecules deficiency:Its structural basis, pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response. Immunol Rev,1990;114:145～180
2，Etzioni A, Frydman M, Pollack S et al. Recurrent severe infections caused by a novel leukocyte adhesion deficiency. N Engl J Med,1992;327(25):1 789～1 792
3，Zachee P, Daelemans R, Pollaris P et al. Neutrophil adhesion molecules in chronic hemodialysis patients. Nephron,1994;68(2):192～196
, 百拇医药
4，Himmelfarb J, Zaoui P, Holbrook D. Modulation of granulocyte LAM-1 and MAC-1 during dialysis-A prospective, randomized controlled trial. Kidney Int,1992;41(2):388～395
5，Chenoweth DE, Cheung AK, Henderson LW. Anyphalatoxin formation during hemodialysis. Effects of different dialyzer membranes. Kidney Int,1983;24(6):764～769
6，Cheung AK, Parker CJ, Wilcox LA et al. Activation of complement by dialysis membranes:polyacrylonitrile binds more C3a than cuprohan. Kidney Int,1990;37(4):1 055～1 059
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7，Laude-Sharp M,Caroff M, Simard L et al. Induction of IL-1 during hemodialysis: Transmembrane passage of intact endotoxins (LPS). Kidney Int,1990;38(6):1 089～1 094
8，Jutila MA, Rott L, Berg EL et al. Function and regulation of the neutrophil MEL-14 antigen in vivo. Comparison with LFA-1 and MAC-1. J Immunol,1989;143(10):3 318～3 324
9，Saeki A, Kaito K, Kobayashi M. Imparired neutrophil function in chronic renal failure-dysregulation of surface adhesion molecule expression and phagocytosis. Nippon jinzo Gakkai Shi,1996;38(12):585～594
, 百拇医药
10，Thylen P,Fernvik E, Lundahl J et al. Monocyte and granulocyte CD11b/CD18,CD62L expression and sICAM-1 concentration in the interdialytic period. Nephron,1996;74(2):275～282
11，Quarles LD, Rutski EA, Rostand SG. Staphylococcus aureus bacteremia in pathents on chronic hemodialysis. Am J Kidney Dis,1985;6(6):412～419
2000-03-16收稿，2000-04-20修回, 百拇医药