系统性红斑狼疮患者外周血淋巴细胞增殖反应与其产生甲硫氨酸脑啡肽的关系
作者：徐星铭 戴宏 魏伟
单位：徐星铭 戴宏(安徽医科大学第一附属医院肾内科，合肥 230022)；魏伟(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
关键词：红斑狼疮；系统性；血液；淋巴细胞；脑啡肽；甲硫氨酸
安徽医科大学学报000307 摘要 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞(PBL)增殖反应与其产生甲硫氨酸脑啡肽(Met-Enk)的关系。方法 淋巴细胞增殖法和Met-Enk放免测定。结果 SLE患者PBL增殖反应异常增高的同时，其产生的Met-Enk亦明显升高。结论 PBL产生的内源性Met-Enk可能参与了SLE患者PBL增殖反应的异常改变。
中图分类号 R593.24
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0184-02
, http://www.100md.com
Relation between proliferation
and methionine-enkephalin production of the peripheral blood
lymphocyte from patients with systemic lupus erythematosus
Xu Xingming,Dai Hong
(The First Affiliated Hospital)
Wei Wei
(Institute of Clinical
Pharmacology,Anhui Medical University,Hefei 230032)
, http://www.100md.com
Abstract Objective To observe the relationship between proliferation and methionine-enkephalin(Met-Enk) production of the peripheral blood lymphocyte(PBL) from patients with systemic lupus erythematosus(SLE). Methods Lymphocyte proliferation and Met-Enk radioimmunoassay were used. Results The abnormal increase of PBL proliferation in SLE patients was related to the increase of Met-Enk production. Conclusion Endogenous Met-Enk produced by PBL may participate in the abnormal proliferation with SLE PBL.
, http://www.100md.com
MeSH lupus erythematosus, systemic; blood, lymphocytes; enkephalin, methionine
内源性阿片肽(endogenous opioid,EOP)参与了免疫反应的调节，β-内啡肽(β-endophin,β-End)对淋巴细胞增殖反应的影响不能被纳络酮(naloxone,Nal)阻断，此可能是由β-End特异性的非阿片受体机制所介导〔1〕。而甲硫氨酸脑啡肽(methionine-enkephalin,Met-Enk)主要由刀豆蛋白A或植物血凝素诱导T淋巴细胞释放，通过自分泌、旁分泌途径对细胞增殖主要表现为调节作用〔2〕。然而，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)异常增殖反应与PBL产生Met-Enk的关系尚未见报道。
, 百拇医药 1 材料
1.1 SLE患者来源 安徽医科大学第一附属医院内科就诊患者。均符合1982年美国风湿病学会SLE诊断标准确诊为SLE。
1.2 人PBL的制备 无菌取静脉血3 ml放入肝素抗凝管中。取10 ml离心管，预先加入2.5 ml淋巴细胞分离液，用滴管吸取抗凝血2 ml，离分层液约1 cm处，沿管壁缓慢加入。离心400×g，20 min，吸弃血浆层至淋巴细胞层0.5 cm处，将淋巴细胞和少许分离液一起移入10 ml离心管中，加入5倍体积pH 7.2无钙、无镁的Hanks液中混匀，以760×g离心10 min，弃上清再反复洗2次，计数后用于实验。
1.3 主要仪器与设备 Napco-6100 CO2培养箱，美国杜邦公司；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂；YJ-1450型医用净化工作台，苏州净化设备公司；TGL-16c台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；FJ-2011自动γ计数仪，西安262厂；EL301 Strip reader(酶标仪)，美国Bio-Tek公司。ODS-硅胶柱(Se08p-Pak)，美国Incstar公司。
, 百拇医药
1.4 试剂与药物 RPMI1640培养粉：美国Gibco公司产品。完全RPMI1640培养液加25 mmol*L-1 Hepes,1 mmol*L-1丙酮酸钠，2 mmol*L-1谷氨酰胺，50 μmol*L-1二巯基乙醇，1×105 IU*L-1青霉素G，100 mg*L-1链霉素，10%(体积分数)小牛血清，pH为7.4。植物血凝素(phytohemmaglutinin,PHA)：美国Serva公司产品)。四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司产品，用含5 g*L-1葡萄糖的磷酸缓冲液(0.02 mol*L-1 pH 7.2)配成5 g*L-1使用液，4℃冰箱避光保存。甲硫氨酸脑啡肽(125I-Met-Enk)药盒：美国Incstar公司产品。
2 方法
, 百拇医药
2.1 人PBL增殖反应[3] 常规制备人PBL悬液，用完全RPMI 1640培养液调成1×1010*L-1。于96孔培养板中每孔加入细胞悬液100 μl，4 mg*L-1 PHA 100 μl，置0.05 CO2、37℃培养48 h。于每孔加入5 g*L-1的MTT液100 μl，于振荡器上振荡1 min，再放入0.05 CO2、37℃培养箱中继续培养2 h。培养结束后以760×g离心10 min，吸弃上清后每孔加入酸化异丙醇120 μl，于振荡器上振荡30 s，在酶标仪上于570 nm波长处读每孔吸光度(absorbance,A)，结果以其A的均值表示。
2.2 PBL的Met-Enk放免测定 根据Incstar说明书进行。
2.3 统计分析 本研究数据以
±s表示，以组间t检验进行统计处理。
, 百拇医药
3 结果
图1结果表明，SLE患者PBL增殖反应异常增高时，其产生Met-Enk的水平也明显高于正常人PBL产生Met-Enk的水平。
图1 人外周血淋巴细胞增殖反应及其产生甲硫氨酸脑啡肽的关系
(±s,n=5)
与正常人比较：**P<0.01
4 讨论
淋巴细胞在致分裂原的作用下可产生EOP，这些EOP在体内同样具有生物活性，也起着类似神经内分泌信号分子的作用。Met-Enk可能是主要作用于免疫细胞的δ2受体，在免疫调节中具有特殊功能〔4〕。
, 百拇医药
SLE的病理机制较复杂，涉及的研究面广，目前仍十分不清〔5〕。本研究表明，PHA可诱导正常人PBL增殖及产生Met-Enk，而且发现，SLE患者PBL异常增殖的同时，其产生Met-Enk的水平亦明显升高，提示PBL产生的内源性Met-Enk可能参与了SLE患者淋巴细胞功能的异常调节，对于进一步研究SLE免疫病理机制尤其是深入探讨EOP与疾病的关系有一定帮助。
作者简介：徐星铭，女，37岁，硕士，副主任医师
魏伟，男，博士，教授，博士生导师，副所长，中国药理学会抗炎免疫药理专业委员会副主任委员
参考文献
1，Hazum E,Chang KJ,Guatracasas P. Specific nonopiate receptors for β-endorphins. Science,1979;205(6):1 033～1 035
, 百拇医药
2 Linner KM, Quist HE, Sharp BM. Met-enkephalin-containing peptides encoded by proenkephalin a mRNA expressed in actived murine thymocytes inhibit thymocyte proliferation. J Immunol,1995;154(6):5 049～5 060
3，陈敏珠，魏 伟，张 泓等.免疫抑制药和增强药实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学. 第2版，北京：人民卫生出版社，1991：1 208～1 245
4，吴 桐，李晓玉.免疫细胞上的阿片受体.见：金正均，王永铭，苏定冯主编.药理学进展(1997)，北京：人民卫生出版社，1997：140～147
5，Mosmann TR and Sad S. The expanding universe of T cell subsets:Th1、Th2 and more. Immunol Today,1996;17(1):138～143
2000-03-03收稿，2000-04-28修回, 百拇医药
单位：徐星铭 戴宏(安徽医科大学第一附属医院肾内科，合肥 230022)；魏伟(安徽医科大学临床药理研究所，合肥 230032)
关键词：红斑狼疮；系统性；血液；淋巴细胞；脑啡肽；甲硫氨酸
安徽医科大学学报000307 摘要 目的 研究系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血淋巴细胞(PBL)增殖反应与其产生甲硫氨酸脑啡肽(Met-Enk)的关系。方法 淋巴细胞增殖法和Met-Enk放免测定。结果 SLE患者PBL增殖反应异常增高的同时，其产生的Met-Enk亦明显升高。结论 PBL产生的内源性Met-Enk可能参与了SLE患者PBL增殖反应的异常改变。
中图分类号 R593.24
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)03-0184-02
, http://www.100md.com
Relation between proliferation
and methionine-enkephalin production of the peripheral blood
lymphocyte from patients with systemic lupus erythematosus
Xu Xingming,Dai Hong
(The First Affiliated Hospital)
Wei Wei
(Institute of Clinical
Pharmacology,Anhui Medical University,Hefei 230032)
, http://www.100md.com
Abstract Objective To observe the relationship between proliferation and methionine-enkephalin(Met-Enk) production of the peripheral blood lymphocyte(PBL) from patients with systemic lupus erythematosus(SLE). Methods Lymphocyte proliferation and Met-Enk radioimmunoassay were used. Results The abnormal increase of PBL proliferation in SLE patients was related to the increase of Met-Enk production. Conclusion Endogenous Met-Enk produced by PBL may participate in the abnormal proliferation with SLE PBL.
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MeSH lupus erythematosus, systemic; blood, lymphocytes; enkephalin, methionine
内源性阿片肽(endogenous opioid,EOP)参与了免疫反应的调节，β-内啡肽(β-endophin,β-End)对淋巴细胞增殖反应的影响不能被纳络酮(naloxone,Nal)阻断，此可能是由β-End特异性的非阿片受体机制所介导〔1〕。而甲硫氨酸脑啡肽(methionine-enkephalin,Met-Enk)主要由刀豆蛋白A或植物血凝素诱导T淋巴细胞释放，通过自分泌、旁分泌途径对细胞增殖主要表现为调节作用〔2〕。然而，系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)异常增殖反应与PBL产生Met-Enk的关系尚未见报道。
, 百拇医药 1 材料
1.1 SLE患者来源 安徽医科大学第一附属医院内科就诊患者。均符合1982年美国风湿病学会SLE诊断标准确诊为SLE。
1.2 人PBL的制备 无菌取静脉血3 ml放入肝素抗凝管中。取10 ml离心管，预先加入2.5 ml淋巴细胞分离液，用滴管吸取抗凝血2 ml，离分层液约1 cm处，沿管壁缓慢加入。离心400×g，20 min，吸弃血浆层至淋巴细胞层0.5 cm处，将淋巴细胞和少许分离液一起移入10 ml离心管中，加入5倍体积pH 7.2无钙、无镁的Hanks液中混匀，以760×g离心10 min，弃上清再反复洗2次，计数后用于实验。
1.3 主要仪器与设备 Napco-6100 CO2培养箱，美国杜邦公司；XSZ倒置显微镜，重庆光学仪器厂；YJ-1450型医用净化工作台，苏州净化设备公司；TGL-16c台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂；GL20A全自动高速冷冻离心机，湖南仪器仪表总厂离心机厂；FJ-2011自动γ计数仪，西安262厂；EL301 Strip reader(酶标仪)，美国Bio-Tek公司。ODS-硅胶柱(Se08p-Pak)，美国Incstar公司。
, 百拇医药
1.4 试剂与药物 RPMI1640培养粉：美国Gibco公司产品。完全RPMI1640培养液加25 mmol*L-1 Hepes,1 mmol*L-1丙酮酸钠，2 mmol*L-1谷氨酰胺，50 μmol*L-1二巯基乙醇，1×105 IU*L-1青霉素G，100 mg*L-1链霉素，10%(体积分数)小牛血清，pH为7.4。植物血凝素(phytohemmaglutinin,PHA)：美国Serva公司产品)。四甲基偶氮唑盐(MTT)：美国Sigma公司产品，用含5 g*L-1葡萄糖的磷酸缓冲液(0.02 mol*L-1 pH 7.2)配成5 g*L-1使用液，4℃冰箱避光保存。甲硫氨酸脑啡肽(125I-Met-Enk)药盒：美国Incstar公司产品。
2 方法
, 百拇医药
2.1 人PBL增殖反应[3] 常规制备人PBL悬液，用完全RPMI 1640培养液调成1×1010*L-1。于96孔培养板中每孔加入细胞悬液100 μl，4 mg*L-1 PHA 100 μl，置0.05 CO2、37℃培养48 h。于每孔加入5 g*L-1的MTT液100 μl，于振荡器上振荡1 min，再放入0.05 CO2、37℃培养箱中继续培养2 h。培养结束后以760×g离心10 min，吸弃上清后每孔加入酸化异丙醇120 μl，于振荡器上振荡30 s，在酶标仪上于570 nm波长处读每孔吸光度(absorbance,A)，结果以其A的均值表示。
2.2 PBL的Met-Enk放免测定 根据Incstar说明书进行。
2.3 统计分析 本研究数据以
±s表示，以组间t检验进行统计处理。, 百拇医药
3 结果
图1结果表明，SLE患者PBL增殖反应异常增高时，其产生Met-Enk的水平也明显高于正常人PBL产生Met-Enk的水平。
图1 人外周血淋巴细胞增殖反应及其产生甲硫氨酸脑啡肽的关系
(
±s,n=5)与正常人比较：**P<0.01
4 讨论
淋巴细胞在致分裂原的作用下可产生EOP，这些EOP在体内同样具有生物活性，也起着类似神经内分泌信号分子的作用。Met-Enk可能是主要作用于免疫细胞的δ2受体，在免疫调节中具有特殊功能〔4〕。
, 百拇医药
SLE的病理机制较复杂，涉及的研究面广，目前仍十分不清〔5〕。本研究表明，PHA可诱导正常人PBL增殖及产生Met-Enk，而且发现，SLE患者PBL异常增殖的同时，其产生Met-Enk的水平亦明显升高，提示PBL产生的内源性Met-Enk可能参与了SLE患者淋巴细胞功能的异常调节，对于进一步研究SLE免疫病理机制尤其是深入探讨EOP与疾病的关系有一定帮助。
作者简介：徐星铭，女，37岁，硕士，副主任医师
魏伟，男，博士，教授，博士生导师，副所长，中国药理学会抗炎免疫药理专业委员会副主任委员
参考文献
1，Hazum E,Chang KJ,Guatracasas P. Specific nonopiate receptors for β-endorphins. Science,1979;205(6):1 033～1 035
, 百拇医药
2 Linner KM, Quist HE, Sharp BM. Met-enkephalin-containing peptides encoded by proenkephalin a mRNA expressed in actived murine thymocytes inhibit thymocyte proliferation. J Immunol,1995;154(6):5 049～5 060
3，陈敏珠，魏 伟，张 泓等.免疫抑制药和增强药实验法.见：徐叔云，卞如濂，陈 修主编.药理实验方法学. 第2版，北京：人民卫生出版社，1991：1 208～1 245
4，吴 桐，李晓玉.免疫细胞上的阿片受体.见：金正均，王永铭，苏定冯主编.药理学进展(1997)，北京：人民卫生出版社，1997：140～147
5，Mosmann TR and Sad S. The expanding universe of T cell subsets:Th1、Th2 and more. Immunol Today,1996;17(1):138～143
2000-03-03收稿，2000-04-28修回, 百拇医药