基因诊断与基因芯片
作者：沈继龙
单位：安徽医科大学病原生物学教研室,合肥 230032
关键词：基因；诊断；DNA；基因芯片
安徽医科大学学报000401 中图分类号 R394.2；R342.3；R446.8
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0247-04
历经科学家10年艰辛，人类基因组计划(Human genome project, HGP)终于完成了基因组基本框架图。至此，蕴含在人体细胞内23对染色体上的30亿个碱基对序列已被全部揭示，从而完成了生命本质意义上的第二张“人体解剖图谱”。伴随HGP实施和测序工作的完成,一种全新的基因诊断技术-基因芯片应运而生。二者相得益彰，极大地推进了生命科学的发展。本文就基因诊断和基因芯片及其对检验医学的影响作一总结。
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1 基因诊断
传统的疾病诊断方法都是以疾病或病原体的表型(phenotype)为依据。这种“表型诊断”有许多不足之处：①表型的改变在很多病理情况下不具特异性；②疾病的表型改变往往出现较晚，待组织、体液、分泌排泄物、病原微生物出现可检测的表型物质时，常已非疾病的早期，因此易延误诊断；③很多疾病本身并不呈现显著的表型改变，采用传统的检测方法常呈“假阴性”反应；④表型诊断常常是被动的，只能“可查而不可防”。基因的载体是DNA作为生命的物质基础，DNA结构与功能的改变会导致生物体表型的变化。直接探查基因的存在状态及功能，即基因型(genotype)的改变,可对疾病作出可靠诊断。这种在DNA水平上对疾病进行的诊断称为基因诊断(genetic diagnosis)，又称DNA 诊断。疾病相关基因的探查、检测和基因工程诊断试剂研究的科学称为诊断分子生物学(diagnostic molecular biology)。基因诊断属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法。
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1978年，美国科学家首次采用羊水细胞对胎儿进行血红蛋白病的产前基因诊断获得了成功，从此开创了疾病基因诊断的新纪元。此后，随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是HGP的实施和人类基因组测序的完成，基因诊断更是前景诱人，基因诊断相关产业有着巨大的社会效益和经济效益。基因诊断之所以发展迅速，主要是它具备了高亲和性、高度精确性、高度敏感性和高度集成性的优点。它能以“是”或“不是”的简洁结论来回答临床医学中遇见或预见的问题。基因诊断不仅可对某些疾病作出准确检测,还能对疾病的易感性、发病类型和阶段、预后、感染性疾病以及疾病抗药性作出判断。
基因诊断所用的检测技术为近年发展起来的核酸检测方法。常用方法有：PCR及其相关技术、DNA原位杂交(DNA in situ hybridization)、DNA测序、差异显示(differential display)。基因诊断技术，用于研究基因差异表达， 对那些具有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测，以研究某基因是否处于活化状态；还可用于病原生物的检测，不仅可检出急性感染，也可检出潜伏感染；既能诊断既往感染，也能诊断现症感染。尤其对那些不易体外培养(如艾滋病病毒、各种肝炎病毒等)和不能在实验室安全培养的病原体，采用基因诊断具有突出的优点。采用DNA长度片段多态性分析(RFLP)还可对病原体(病毒、细菌、寄生虫)进行基因分型。
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2 基因芯片技术及应用研究
HGP已基本完成基因组测序工作。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，因为只有知道其功能才能破译人类基因。功能基因组学(functional genomics)、蛋白质组学(proteomics)的提出就是为实现破译进而改造基因这一目标。基因组计划的研究成果必须在疾病诊断、基因治疗、药物筛选等领域发挥重要的作用，基因芯片技术就是为实现这一目标而建立。
基因芯片(gene chips) 又称DNA 芯片(DNA chips)或DNA微阵列(DNA microarray)。它是采用光刻合成或高速打印技术在硅片、玻璃或尼龙膜上制造的DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，同DNA微阵列杂交后通过荧光扫描仪扫描和计算机分析，从而获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术具有高通量、集成化和自动化的特点。它是继单克隆抗体技术和PCR技术之后生命科学中的又一重大技术创新，甚至是大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命〔1〕。
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基因芯片技术是高效、大规模地(同时检测上万个基因)获取相关生物信息的高科技产物。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析(如单碱基多态性SNPs)、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。最近正在试用于环境化学毒物的毒性筛选、细菌(如结核杆菌)耐药菌株鉴定和药敏检测、探查病原生物致病基因和抗生素基因等。从80年代初DNA的杂交测序(sequencing by hybridization，SBH) 概念的提出，到90年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，芯片技术得以迅速发展。许多公司及政府机构均对此表现出极大兴趣，并投以可观的财力。
2.1 基因芯片的基本原理〔2，3〕 基因芯片的基本原理同SBH。即任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列(subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：
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(1) CTCATATG
(2) GCTCATAT
(3) AGCTCATA
(4) TAGCTCAT
(5) TTAGCTCA
这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型(pattern)数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。
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基因芯片的关键在于高密度、集成化的微阵列制作。基本方法有三类：一是光刻法(photolithography)，二是机械点样法(mechanical microspotting)，三是喷墨打印法(ink jetting)。
寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由美国Affymetrix公司开发的。先在载玻片上铺上一层连接物(linker)，其5'-羟基末端连上一个紫外光敏保护基，可用光照去除，用特制的光刻蔽光膜(photolithographic mask)保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光照作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学法加上第一个核苷酸。所加上的核苷酸种类和在芯片上的位置事先确定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点上加上另外3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成。因此，n个核苷酸长的芯片需要4n个步骤。例如：一个上述12核苷酸长的芯片通过4×12个化学步骤，8 h可能合成65 536个探针，探针阵列密度可达4×106/cm2。 这种原位光刻合成每步的反应所需的蔽光膜代价昂贵。最近，Wisconsin 大学开发了无蔽光膜光刻合成技术(maskless lithography)。该技术使用了数码光处理器(digital light processor),用48万个铝镜片聚焦在芯片上，从而使基因芯片的制作成本大大降低，为芯片走向实验室应用铺平了道路。 机械点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样装置直接点在芯片上。采用的自动化装置有一套计算机控制三维移动装置。点样针从多孔板取出样品直接点在芯片上〔4〕。
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喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。支持物经过包被后，计算机根据芯片上不同位点探针的序列需要,将特定的碱基喷印在芯片的预定位置上。
其它还有电子芯片、三维芯片等。电子芯片是由美国Nanogen公司创立的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。三维芯片是由美国的Packard、Motorola、Argonne国家实验室与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。此外，可以在芯片上同时进行扩增与检测。以三维构象形式存在的生物大分子以其天然状态存在凝胶条上，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。
2.2 DNA杂交和检测 待检基因与探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。在标记上，目前采用的传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 PCR过程中的DNA标记一是末端标记：在DNA扩增时，在引物上标记有荧光探针，使新形成的DNA链末端带有荧光探针；二是随机插入：选择四种碱基，使其中一种或几种挂有荧光探针，在PCR扩增过程中，带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上靶基因的荧光信号，通过计算机处理即可获得靶基因的结构或表达信息。目前的扫描仪，根据原理不同可分为两类：一是激光共聚焦荧光检测(laser con-focal fluorescence detection); 另一种是电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像。前者的特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用；后者的特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。
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2.3 基因芯片的应用
2.3.1 基因差异表达检测〔5〕 生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题。理解人类基因组中10万个不同的基因功能，监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达(differential gene expression ，DGE)十分重要。对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相互关系，细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。目前DGE研究方法主要有表达序列标签(ESTs)测序、差减克隆(subtractive cloning )、差异显示(differential display)、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微阵列杂交技术可监测大量mRNA的转录，直接快速地检测出极其微量的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Sgroi〔6〕报告DNA芯片结合激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection)用于乳癌浸润期和转移期及正常细胞的基因表达谱(gene expression profiles)差异研究，结果被定量PCR和免疫组化所证实。差异表达有助于早期发现瘤细胞3万个基因与正常细胞的区别，有助于了解瘤细胞的发生、浸润、转移和药敏。最近，美国毒物化学研究所(CIIT) 和国家环境健康科学研究所(NIEHS)正计划在一张玻片上建立8 700个小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我国也已成功研制出能检出41 000种基因表达谱的芯片。
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2.3.2 发现新基因 Moch等利用肿瘤微阵列芯片(5 184个cDNA片段)发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并于正常细胞进行比较。在532份标本中检测到胞浆纤维Vimentin的表达基因，阳性率为51%～61%〔7〕。追踪观察，有Vimentin表达的患者，预后极差。人类大量ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400 000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析〔8〕。
2.3.3 大规模DNA测序 人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法的发展。DNA芯片技术中SBH即是一种新的高效快速测序方法。用含65 536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200 bp长DNA序列，采用67 108 864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。
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2.3.4 基因突变与多态性的检测 SHB技术可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。将基因特异性寡核苷酸微阵列共价固定于载玻片上，可建立简单快速的基因多态性分析方法。采用PCR扩增基因组DNA，其一条引物用荧光素标记，另一条引物用生物素标记，分离两条互补的DNA链，将荧光素标记DNA链与微阵列杂交，通过荧光扫描检测杂交模式，即可测定PCR产物存在的多态性。该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析，结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。高密度探针可检测具有特征性的较长序列相关的多态性与变异。筛选1 000个核苷酸序列的变异与多态性需要4 000个探针。用大约16 000个探针能筛选4kb序列。
2.3.5 疾病的诊断
2.3.5.1 遗传病相关基因的定位 90年代以来,随着人类基因组计划的发展,各种方法被相继创立并应用到基因定位中。我国有4 000万育龄妇女，每年有2 000万新生儿，准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。DNA芯片充分结合并灵活运用了大规模集成电路制造技术、自动化技术、计算机及网络技术、激光共聚焦扫描、DNA合成、荧光标记探针、分子杂交及分子生物学的其它技术,在这一领域的研究中有着巨大的潜力。这一技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析将越来越重要。HGP使许多遗传疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次筛查多种遗传病,既经济快速又敏感可靠〔9，10〕。
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2.3.5.2 感染性疾病的诊断 HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异，这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性，因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。Hayward以3 648个插入片段建立猎枪微阵列(shotgun microarray)，通过差异杂交和DNA测序找到了疟原虫无性和有性生殖阶段基因差异表达，为抗疟药设计提供了线索。可以预测在不久的将来，人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因，实现真正意义上的“组合检测(profile tests)”。
2.3.5.3 肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现和定位。含96 600个20体寡核苷酸高密度阵列对遗传性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11个外显子进行杂合变异筛选，15个患者的已知变异的样品中，准确诊断出14个患者，20个对照样品中未发现假阳性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP调查42例有乳癌史的家系，p53基因13 964位的G变为C，突变率为7.1%；无乳癌家族史者为0。Favis等用多位PCR/连接酶检测反应(PCR/LDR)在一个试管内同时检测数百个基因突变，用于检测大肠癌组织k-ras 和p53突变及BRCA-1和BRCA-2低频率突变收到良好效果。
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2.3.6 其它应用
2.3.6.1 环境化学毒物的筛选 我们的生活环境中存在着数千种化学物质，每种物质在投入使用前必须进行人体毒性试验，传统的动物试验费用高昂，且存在着国际上关注的动物福利(animal welfare)问题。采用毒物检测芯片(Toxchips)可对环境中众多化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选，探查毒物“开启”或“关闭”哪些基因，研究“环境如何改变我们的基因”。NIEHS将对人类100 000个基因中的12 000个基因进行检测，弄清致癌物质对基因的改变，建立化学物质指纹库(fingerprints of chemicals)，然后即可通过测定特定基因的突变与否判断新的合成物质的生物毒性。
2.3.6.2 耐药菌株和药敏检测 据WHO报告，全球每年约有800万结核病患者，有300万人死亡，死亡人数超过了艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性(俄国80%TB对一种药物产生抗性；美国50%为多重耐药)。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。最近，俄美两国科学家开发了具此功能的基因芯片，可使医生及早使用敏感药物。该芯片(TB Biochips)将抗性菌株的单链DNA标记后固定在玻片上，与待检TB株杂交，临床使用未见假阳性，该芯片可清洗后重复使用50次。
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2.3.6.3 新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。噬菌体展示技术可创造大量蛋白质，目前多用于抗体库的建立和筛选，进而可用于受体-配体相互作用的研究。基因组学、蛋白质组学和生物信息学(bioinformatics)将大大促进制药工业的发展。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗，并获得美国FDA的批准。除肿瘤外，用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。
3 结语
人类基因组计划和计算机科学的结合诞生了生物信息学，DNA芯片是生物信息学的骄子。她和传统的液相色谱技术、毛细管电泳技术一起，构成新世纪生命科学、人口环境科学等领域研究的强有力的高新技术。目前国内已有自主知识产权的商品化基因芯片，用于检测乙肝、丙肝和艾滋病等。最近，上海投资启动了DNA芯片的开发。内容含TB变异与耐药检测，造血系统肿瘤的分型，肝炎及其它病毒的检测，致病菌耐药诊断，HLA分型，癌症早期诊断，三维DNA芯片研制等项目。我国的基因芯片事业将同信息产业一样成为新的经济增长点。虽然芯片技术要在实验室和临床普遍应用仍有一些关键问题需要解决，例如简化样品制备和标记操作、降低芯片和检测仪器成本等，但基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间，已在诸多领域呈现出广阔的应用前景〔1〕。随着功能基因组学研究的深入和芯片技术的完善，这一新的技术革命一定会在生命科学和相关领域发挥巨大的作用。
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作者简介:沈继龙,男,47岁,医学博士,教授,硕士生导师；安徽省检验医学会副主任委员，安徽省热带病与寄生虫学会副主任委员；主要研究方向：分子寄生虫学
参考文献
1，Kurian KM, Watson CJ, Wyllie AH et al. DNA chip technology. J Pathol, 1999; 187(3):267
2，范吴强,李红,陈 . DNA芯片的基本原理、方法及应用前景. 国外医学分子生物学分册, 1999；21(4)：209
3，王升启.基因芯片技术及应用研究进展. 生物工程进展, 1999；19(4):45
4，Ramsay R. DNA chips: State of the art. Nature Biotechnology, 1998;16:40
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5，Carulli JP, Artinger M, Swain PM et al. High throughput analysis of differential gene expression. J Cell Biochem, 1998;120(30-31):286
6，Sgroi DC, Teng S, Robinson G et al. In vivo gene expression profile analysis of human breast cancer progression. Cancer Res, 1999; 59(22):5 656
7，Moch H, Schraml P. Bubendorf L et al. High throughput tissue microarray analgsis to evaluate genes uncorered by cDNA microarray screening in renal cell carcinoma. Am J Phathol, 1999;154(4):981
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8，Loftus SK,Chen Y, Gooden G et al. Informatic selection of a neural crest-melanocyte cDNA set for microarray analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999; 96(16):9 277
9，Ryu DD， Nam DH. Recent progress in biomolecular engineering. Biotechnol Prog,2000;16(1):2
10，Dobrowolski SF, Banas RA, Naylor EW et al. DNA microarray technology for neonatal screening. Acta Paediatr Suppl, 1999; 88(432):61
2000-08-10收稿(特约稿), 百拇医药
单位：安徽医科大学病原生物学教研室,合肥 230032
关键词：基因；诊断；DNA；基因芯片
安徽医科大学学报000401 中图分类号 R394.2；R342.3；R446.8
文献标识码 A 文章编号 1000-1492(2000)04-0247-04
历经科学家10年艰辛，人类基因组计划(Human genome project, HGP)终于完成了基因组基本框架图。至此，蕴含在人体细胞内23对染色体上的30亿个碱基对序列已被全部揭示，从而完成了生命本质意义上的第二张“人体解剖图谱”。伴随HGP实施和测序工作的完成,一种全新的基因诊断技术-基因芯片应运而生。二者相得益彰，极大地推进了生命科学的发展。本文就基因诊断和基因芯片及其对检验医学的影响作一总结。
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1 基因诊断
传统的疾病诊断方法都是以疾病或病原体的表型(phenotype)为依据。这种“表型诊断”有许多不足之处：①表型的改变在很多病理情况下不具特异性；②疾病的表型改变往往出现较晚，待组织、体液、分泌排泄物、病原微生物出现可检测的表型物质时，常已非疾病的早期，因此易延误诊断；③很多疾病本身并不呈现显著的表型改变，采用传统的检测方法常呈“假阴性”反应；④表型诊断常常是被动的，只能“可查而不可防”。基因的载体是DNA作为生命的物质基础，DNA结构与功能的改变会导致生物体表型的变化。直接探查基因的存在状态及功能，即基因型(genotype)的改变,可对疾病作出可靠诊断。这种在DNA水平上对疾病进行的诊断称为基因诊断(genetic diagnosis)，又称DNA 诊断。疾病相关基因的探查、检测和基因工程诊断试剂研究的科学称为诊断分子生物学(diagnostic molecular biology)。基因诊断属于全新内容、全新技术和全新概念的实验室诊断方法。
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1978年，美国科学家首次采用羊水细胞对胎儿进行血红蛋白病的产前基因诊断获得了成功，从此开创了疾病基因诊断的新纪元。此后，随着分子生物学技术的迅速发展，尤其是HGP的实施和人类基因组测序的完成，基因诊断更是前景诱人，基因诊断相关产业有着巨大的社会效益和经济效益。基因诊断之所以发展迅速，主要是它具备了高亲和性、高度精确性、高度敏感性和高度集成性的优点。它能以“是”或“不是”的简洁结论来回答临床医学中遇见或预见的问题。基因诊断不仅可对某些疾病作出准确检测,还能对疾病的易感性、发病类型和阶段、预后、感染性疾病以及疾病抗药性作出判断。
基因诊断所用的检测技术为近年发展起来的核酸检测方法。常用方法有：PCR及其相关技术、DNA原位杂交(DNA in situ hybridization)、DNA测序、差异显示(differential display)。基因诊断技术，用于研究基因差异表达， 对那些具有组织和分化阶段特异性表达的基因进行检测，以研究某基因是否处于活化状态；还可用于病原生物的检测，不仅可检出急性感染，也可检出潜伏感染；既能诊断既往感染，也能诊断现症感染。尤其对那些不易体外培养(如艾滋病病毒、各种肝炎病毒等)和不能在实验室安全培养的病原体，采用基因诊断具有突出的优点。采用DNA长度片段多态性分析(RFLP)还可对病原体(病毒、细菌、寄生虫)进行基因分型。
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2 基因芯片技术及应用研究
HGP已基本完成基因组测序工作。目前的问题是面对大量的基因或基因片断序列如何研究其功能，因为只有知道其功能才能破译人类基因。功能基因组学(functional genomics)、蛋白质组学(proteomics)的提出就是为实现破译进而改造基因这一目标。基因组计划的研究成果必须在疾病诊断、基因治疗、药物筛选等领域发挥重要的作用，基因芯片技术就是为实现这一目标而建立。
基因芯片(gene chips) 又称DNA 芯片(DNA chips)或DNA微阵列(DNA microarray)。它是采用光刻合成或高速打印技术在硅片、玻璃或尼龙膜上制造的DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子，同DNA微阵列杂交后通过荧光扫描仪扫描和计算机分析，从而获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术具有高通量、集成化和自动化的特点。它是继单克隆抗体技术和PCR技术之后生命科学中的又一重大技术创新，甚至是大规模集成电路之后的又一次具有深远意义的科学技术革命〔1〕。
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基因芯片技术是高效、大规模地(同时检测上万个基因)获取相关生物信息的高科技产物。目前，该技术应用领域主要有基因表达谱分析、新基因发现、基因突变及多态性分析(如单碱基多态性SNPs)、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序等。最近正在试用于环境化学毒物的毒性筛选、细菌(如结核杆菌)耐药菌株鉴定和药敏检测、探查病原生物致病基因和抗生素基因等。从80年代初DNA的杂交测序(sequencing by hybridization，SBH) 概念的提出，到90年代初以美国为主开始进行的各种生物芯片的研制，芯片技术得以迅速发展。许多公司及政府机构均对此表现出极大兴趣，并投以可观的财力。
2.1 基因芯片的基本原理〔2，3〕 基因芯片的基本原理同SBH。即任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列(subsequence)。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：
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(1) CTCATATG
(2) GCTCATAT
(3) AGCTCATA
(4) TAGCTCAT
(5) TTAGCTCA
这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型(pattern)数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。
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基因芯片的关键在于高密度、集成化的微阵列制作。基本方法有三类：一是光刻法(photolithography)，二是机械点样法(mechanical microspotting)，三是喷墨打印法(ink jetting)。
寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由美国Affymetrix公司开发的。先在载玻片上铺上一层连接物(linker)，其5'-羟基末端连上一个紫外光敏保护基，可用光照去除，用特制的光刻蔽光膜(photolithographic mask)保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光照作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学法加上第一个核苷酸。所加上的核苷酸种类和在芯片上的位置事先确定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点上加上另外3种核苷酸完成第一位核苷酸的合成。因此，n个核苷酸长的芯片需要4n个步骤。例如：一个上述12核苷酸长的芯片通过4×12个化学步骤，8 h可能合成65 536个探针，探针阵列密度可达4×106/cm2。 这种原位光刻合成每步的反应所需的蔽光膜代价昂贵。最近，Wisconsin 大学开发了无蔽光膜光刻合成技术(maskless lithography)。该技术使用了数码光处理器(digital light processor),用48万个铝镜片聚焦在芯片上，从而使基因芯片的制作成本大大降低，为芯片走向实验室应用铺平了道路。 机械点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样装置直接点在芯片上。采用的自动化装置有一套计算机控制三维移动装置。点样针从多孔板取出样品直接点在芯片上〔4〕。
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喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。支持物经过包被后，计算机根据芯片上不同位点探针的序列需要,将特定的碱基喷印在芯片的预定位置上。
其它还有电子芯片、三维芯片等。电子芯片是由美国Nanogen公司创立的，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。三维芯片是由美国的Packard、Motorola、Argonne国家实验室与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发的一种芯片技术。凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。此外，可以在芯片上同时进行扩增与检测。以三维构象形式存在的生物大分子以其天然状态存在凝胶条上，可以进行免疫测定，受体-配体研究和蛋白组分析。
2.2 DNA杂交和检测 待检基因与探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。在标记上，目前采用的传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 PCR过程中的DNA标记一是末端标记：在DNA扩增时，在引物上标记有荧光探针，使新形成的DNA链末端带有荧光探针；二是随机插入：选择四种碱基，使其中一种或几种挂有荧光探针，在PCR扩增过程中，带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基，同时参与DNA链的形成。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上靶基因的荧光信号，通过计算机处理即可获得靶基因的结构或表达信息。目前的扫描仪，根据原理不同可分为两类：一是激光共聚焦荧光检测(laser con-focal fluorescence detection); 另一种是电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像。前者的特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用；后者的特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用。
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2.3 基因芯片的应用
2.3.1 基因差异表达检测〔5〕 生命活动中基因表达的改变是生物学研究的核心问题。理解人类基因组中10万个不同的基因功能，监测某些组织、细胞不同分化阶段的差异基因表达(differential gene expression ，DGE)十分重要。对差异表达的研究，可以推断基因与基因的相互关系，细胞分化中基因“开启”或“关闭”的机制；揭示基因与疾病的发生、发展、转归的内在联系。目前DGE研究方法主要有表达序列标签(ESTs)测序、差减克隆(subtractive cloning )、差异显示(differential display)、基因表达系列分析 (serial analysis of gene expression, SAGE)。而cDNA微阵列杂交技术可监测大量mRNA的转录，直接快速地检测出极其微量的mRNA，且易于同时监测成千上万的基因，是研究基因功能的重要手段之一。Sgroi〔6〕报告DNA芯片结合激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection)用于乳癌浸润期和转移期及正常细胞的基因表达谱(gene expression profiles)差异研究，结果被定量PCR和免疫组化所证实。差异表达有助于早期发现瘤细胞3万个基因与正常细胞的区别，有助于了解瘤细胞的发生、浸润、转移和药敏。最近，美国毒物化学研究所(CIIT) 和国家环境健康科学研究所(NIEHS)正计划在一张玻片上建立8 700个小白鼠cDNA芯片，用于肝癌的研究。我国也已成功研制出能检出41 000种基因表达谱的芯片。
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2.3.2 发现新基因 Moch等利用肿瘤微阵列芯片(5 184个cDNA片段)发现了肾细胞癌的肿瘤标志物基因，并于正常细胞进行比较。在532份标本中检测到胞浆纤维Vimentin的表达基因，阳性率为51%～61%〔7〕。追踪观察，有Vimentin表达的患者，预后极差。人类大量ESTs给cDNA微阵列提供了丰富的资源，数据库中400 000个ESTs代表了所有人类基因，成千上万的ESTs微阵列将为人类基因表达研究提供强有力的分析工具。这将大大地加速人类基因组的功能分析〔8〕。
2.3.3 大规模DNA测序 人类基因组计划的实施促进了高效的、自动化操作的测序方法的发展。DNA芯片技术中SBH即是一种新的高效快速测序方法。用含65 536个8聚寡核苷酸的微阵列，采用SBH技术，可测定200 bp长DNA序列，采用67 108 864个13聚寡核苷酸的微阵列，可对数千个碱基长的DNA测序。SBH技术的效率随着微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加而提高，但微阵列中寡核苷酸数量与长度的增加则提高了微阵列的复杂性，降低了杂交准确性。
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2.3.4 基因突变与多态性的检测 SHB技术可大规模地检测和分析DNA的变异及多态性。将基因特异性寡核苷酸微阵列共价固定于载玻片上，可建立简单快速的基因多态性分析方法。采用PCR扩增基因组DNA，其一条引物用荧光素标记，另一条引物用生物素标记，分离两条互补的DNA链，将荧光素标记DNA链与微阵列杂交，通过荧光扫描检测杂交模式，即可测定PCR产物存在的多态性。该方法对人的酪氨酸酶基因第4个外显子内含有的5个单碱基突变进行分析，结果显示单碱基错配与完全匹配的杂交模式非常易于区别。高密度探针可检测具有特征性的较长序列相关的多态性与变异。筛选1 000个核苷酸序列的变异与多态性需要4 000个探针。用大约16 000个探针能筛选4kb序列。
2.3.5 疾病的诊断
2.3.5.1 遗传病相关基因的定位 90年代以来,随着人类基因组计划的发展,各种方法被相继创立并应用到基因定位中。我国有4 000万育龄妇女，每年有2 000万新生儿，准确检测遗传病基因是优生优育的技术保障。DNA芯片充分结合并灵活运用了大规模集成电路制造技术、自动化技术、计算机及网络技术、激光共聚焦扫描、DNA合成、荧光标记探针、分子杂交及分子生物学的其它技术,在这一领域的研究中有着巨大的潜力。这一技术已成为基因定位研究的高效工具。随着遗传病与癌症相关基因发现数量的增加，变异与多态性分析将越来越重要。HGP使许多遗传疾病基因得以定位,配合使用多位PCR (multiplex-PCR) /DNA芯片可一次筛查多种遗传病,既经济快速又敏感可靠〔9，10〕。
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2.3.5.2 感染性疾病的诊断 HIV-1基因组中rt与pro在疾病过程中易于发生多种变异，这些变异将导致病毒对多种抗病毒药物包括AZT、ddI、ddC等出现明显抗性，因此检测和分析rt与pro的变异与多态性具有重要的临床意义。Hayward以3 648个插入片段建立猎枪微阵列(shotgun microarray)，通过差异杂交和DNA测序找到了疟原虫无性和有性生殖阶段基因差异表达，为抗疟药设计提供了线索。可以预测在不久的将来，人们可望在一张DNA芯片上检测几乎所有的病原微生物基因，实现真正意义上的“组合检测(profile tests)”。
2.3.5.3 肿瘤诊断 已用基因芯片检测人鼻咽癌、肺癌基因表达谱、肿瘤原癌基因和抑癌基因的发现和定位。含96 600个20体寡核苷酸高密度阵列对遗传性乳腺和卵巢癌BRCA1基因3.45 kb的第11个外显子进行杂合变异筛选，15个患者的已知变异的样品中，准确诊断出14个患者，20个对照样品中未发现假阳性。用Affimetrix p53芯片和PCR-SSCP调查42例有乳癌史的家系，p53基因13 964位的G变为C，突变率为7.1%；无乳癌家族史者为0。Favis等用多位PCR/连接酶检测反应(PCR/LDR)在一个试管内同时检测数百个基因突变，用于检测大肠癌组织k-ras 和p53突变及BRCA-1和BRCA-2低频率突变收到良好效果。
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2.3.6 其它应用
2.3.6.1 环境化学毒物的筛选 我们的生活环境中存在着数千种化学物质，每种物质在投入使用前必须进行人体毒性试验，传统的动物试验费用高昂，且存在着国际上关注的动物福利(animal welfare)问题。采用毒物检测芯片(Toxchips)可对环境中众多化学物质对人类基因的潜在毒性进行筛选，探查毒物“开启”或“关闭”哪些基因，研究“环境如何改变我们的基因”。NIEHS将对人类100 000个基因中的12 000个基因进行检测，弄清致癌物质对基因的改变，建立化学物质指纹库(fingerprints of chemicals)，然后即可通过测定特定基因的突变与否判断新的合成物质的生物毒性。
2.3.6.2 耐药菌株和药敏检测 据WHO报告，全球每年约有800万结核病患者，有300万人死亡，死亡人数超过了艾滋病和疟疾的总和。主要原因是菌株对不同的药物产生了抗药性(俄国80%TB对一种药物产生抗性；美国50%为多重耐药)。对每例患者进行菌株和药敏鉴定是控制TB的关键。最近，俄美两国科学家开发了具此功能的基因芯片，可使医生及早使用敏感药物。该芯片(TB Biochips)将抗性菌株的单链DNA标记后固定在玻片上，与待检TB株杂交，临床使用未见假阳性，该芯片可清洗后重复使用50次。
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2.3.6.3 新药开发 高通量的DNA芯片可发现众多的新基因和新的靶分子用于新药的设计。噬菌体展示技术可创造大量蛋白质，目前多用于抗体库的建立和筛选，进而可用于受体-配体相互作用的研究。基因组学、蛋白质组学和生物信息学(bioinformatics)将大大促进制药工业的发展。目前第一个生物分子工程药物Herceptin已用于乳癌的治疗，并获得美国FDA的批准。除肿瘤外，用分子生物工程设计的药物可用于治疗遗传病及代谢疾病、抗衰老、设计新的抗生素和工业用酶等。
3 结语
人类基因组计划和计算机科学的结合诞生了生物信息学，DNA芯片是生物信息学的骄子。她和传统的液相色谱技术、毛细管电泳技术一起，构成新世纪生命科学、人口环境科学等领域研究的强有力的高新技术。目前国内已有自主知识产权的商品化基因芯片，用于检测乙肝、丙肝和艾滋病等。最近，上海投资启动了DNA芯片的开发。内容含TB变异与耐药检测，造血系统肿瘤的分型，肝炎及其它病毒的检测，致病菌耐药诊断，HLA分型，癌症早期诊断，三维DNA芯片研制等项目。我国的基因芯片事业将同信息产业一样成为新的经济增长点。虽然芯片技术要在实验室和临床普遍应用仍有一些关键问题需要解决，例如简化样品制备和标记操作、降低芯片和检测仪器成本等，但基因芯片技术发展到今天不过短短几年时间，已在诸多领域呈现出广阔的应用前景〔1〕。随着功能基因组学研究的深入和芯片技术的完善，这一新的技术革命一定会在生命科学和相关领域发挥巨大的作用。
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作者简介:沈继龙,男,47岁,医学博士,教授,硕士生导师；安徽省检验医学会副主任委员，安徽省热带病与寄生虫学会副主任委员；主要研究方向：分子寄生虫学
参考文献
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3，王升启.基因芯片技术及应用研究进展. 生物工程进展, 1999；19(4):45
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5，Carulli JP, Artinger M, Swain PM et al. High throughput analysis of differential gene expression. J Cell Biochem, 1998;120(30-31):286
6，Sgroi DC, Teng S, Robinson G et al. In vivo gene expression profile analysis of human breast cancer progression. Cancer Res, 1999; 59(22):5 656
7，Moch H, Schraml P. Bubendorf L et al. High throughput tissue microarray analgsis to evaluate genes uncorered by cDNA microarray screening in renal cell carcinoma. Am J Phathol, 1999;154(4):981
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8，Loftus SK,Chen Y, Gooden G et al. Informatic selection of a neural crest-melanocyte cDNA set for microarray analysis. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999; 96(16):9 277
9，Ryu DD， Nam DH. Recent progress in biomolecular engineering. Biotechnol Prog,2000;16(1):2
10，Dobrowolski SF, Banas RA, Naylor EW et al. DNA microarray technology for neonatal screening. Acta Paediatr Suppl, 1999; 88(432):61
2000-08-10收稿(特约稿), 百拇医药