木贼乙醇提取物中鉵皮素HPLC法含量测定的研究
作者：高汉成 何明三
单位：咸宁地区中心血站 437000 韩宁涛湖北中医学院
关键词：木贼乙醇提取物；树；解皮素；高效液相色谱法
湖北中医学院学报990314 摘要 本文用反相高效液相色谱法测定木贼乙醇提取物中树 解皮素的含量。采用Zorbax-C18柱，流动相为0.4%磷酸-甲醇(1∶1)，检测波长254nm。样品经甲醇超声波提取，10%硫酸-甲醇(1∶1)水解，定容后进样。用树 解皮素作对照外标两点法定量，线性范围0.2～5μg，相关系数r为0.9993，平均回收率为98.1%。
中国图书分类号 R285.5
Determination of Quercetin in Extraction of
, 百拇医药
Equisetum Hiemale L. by HPLC
Gao Hancheng,etal
(Xianning Blood Bank.Hubei Xianning,437000)
Abstract:A HPLC methold has been developed for the determination of Quercetin in Ethanol Extract of Equisetum hiemale L.Quercetin was separated completely on a zorbax-C18 column,4.6mm×250mm,using a mixture of methanol,water and phosphoric acid (100:99.6∶0.4) as mobile phase,with UV detection at 254 nm.A good linear relationship of standard (quercetin) was found in the range of 0.2～5mg,r=0.9993.The results have shown that the average recovery was 98.1%
, 百拇医药
Key words：High pressure liquid chromatography Quercetin Ethanol extract of Equisetum hiemale L.
木贼系木贼科植物Equisetum hiemale L.的干燥地上部分，属常用中药[1]。近20年来的临床、药理和化学研究表明，木贼除具有“散风热，退目翳”等传统功效外，其乙醇提取物还显示出较明显的降压作用，其降压作用的有效成分为鉵皮素和山萘酚的二糖黄酮甙类化合物[2～5]。为了对木贼所含黄酮类降压有效成分进行更深入的研究，我们采用高效液相色谱仪测定本省产木贼乙醇提取物中鉵皮素含量的方法，木贼乙醇提取物用10%硫酸-甲醇(1∶1)水解后，再用鉵皮素对照品对其酸水解液中鉵皮素进行外标两点法测定含量，由于本方法为样品酸水解定容直接进样测定，故较为简单、快速和准确，可作为木贼黄酮有效部位提取及质量标准方法学研究的重要参考依据。
, 百拇医药 1 仪器与试剂
LC-4A高效液相色谱仪，SPD-2AS紫外检测器，C-R2AX色谱数据处理机(以上均为日本岛津制作所产品)，超声波清洗仪(上海船舶设备研究所)。
鉵皮素对照品(中国药品生物制品检定所提供，081-9304)，木贼乙醇提取物(自制)。
甲醇，硫酸，磷酸(均为分析纯)，水为重蒸水。
2 色谱条件[6～7]
Zorbax-C18(10μ)不绣钢柱(4.6mm×250mm)；流动相为0.4%磷酸-甲醇(1∶1)；流速1.0ml/min；标温32°C；检测波长254nm；10μl进样，分离效果如图1、图2。
, http://www.100md.com
图1 鉵皮素对照品色谱图
图2 样品色谱图
3 供试液的制备
3.1 鉵皮素对照品溶液 取鉵皮素对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
3.2 供试品溶液 取木贼乙醇提取物约0.2g，精密称定，置50ml烧瓶中，加入10ml甲醇，超声处理20分钟，再加入10%硫酸10ml，摇匀，水浴回流2小时，冷却至室温，水解液转移至25ml容量瓶中，用甲醇洗涤烧瓶两次(2，2ml)，一并转移至25ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
4 标准曲线的制备
, 百拇医药 分别吸取鉵皮素对照品溶液2μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，按二项下方法进样测定，测定结果及回归方程见表1，图3。
表1 线性测定 进样量
2μl
5μl
10μl
20μl
30μl
40μl
50μl
峰面积积分值
1736
, 百拇医药
4109
8621
18038
29168
40066
50082
回归方程
Y=-651.412+998.897x r=0.9993
图3 标准曲线
测定结果显示，鉵皮素在0.2～5μg范围内呈良好线性关系。宜用外标两点法测定含量。
, 百拇医药
5 重现性考查
按三项2所述方法，取同一批一定量的木贼乙醇提取物，精密称定，制成供试品溶液，按二项下的条件进样测定，进样量10μl，共测5份，测定结果见表2。
表2 重现性考查 样品重(mg)
210.4
211.0
210.0
209.6
209.0
含量(%)
0.183
0.188
, 百拇医药
0.191
0.197
0.184
RSD=2.7%
6 回收率测定
采用加样回收率实验，取同一批已知含量的木贼乙醇提取物，精密称定，分别添加一定量的鉵皮素对照品，按三项2下方法及二项下条件制备出供试品溶液并测定，共测5份，测定结果见表3。表3 回收率测定 编号
样品重量
(mg)
原样含量
(mg)
, http://www.100md.com 对照品加量
(mg)
实测量
(mg)
回收率%
均值(%)
RSD(%)
1
105.3
0.199
0.195
0.388
98.5
, http://www.100md.com
98.1
1.58
2
105.5
0.199
0.195
0.396
100.5
3
105.1
0.192
0.195
0.382
, 百拇医药
98.7
4
104.8
0.197
0.195
0.379
96.4
5
104.5
0.198
0.195
0.380
96.7
, http://www.100md.com
7 稳定性试验
取供试品溶液10μl，按三项2下方法及二项下条件，每隔一段时间测定1次，共测5次，测定结果如表4。表4 稳定性测定 时间(min)
0
30
60
90
120
崎面积积分值
3358
3489
3291
3376
, 百拇医药
3197
测定结果显示，本测定方法在120分钟内稳定。
8 样品测定
按三项2下方法及二项下条件，分别测定3批样品，每次进样10μl，按外标两点法计算含量，测定结果如表5。
表5 样品测定 批号
取样量
(mg)
鉵皮素量
(mg)
含量
(%)
, 百拇医药
平均含量
(%)
1
210.2
0.376
0.179
0.180
210.3
0.382
0.182
2
210.0
0.378
, 百拇医药
0.180
0.178
210.3
0.360
0.175
3
209.8
0.380
0.181
0.179
210.0
0.372
0.177
, 百拇医药
三批样品鉵皮素含量RSD为1.33%
9 讨论
样品的HPLC图谱中显示在21分钟左右还有一个单峰存在，经用银杏提取物的酸水解液进行对照测定，结果与银杏提取物中的异鼠李素的Rf值一致，提示本省产木贼中可能含有异鼠李素，最后确证有待进一步研究。
文献报道木贼含有山萘酚二糖甙[2]，但我们对湖北省产的三批木贼分别进行了酸水解产物与中国医学科学院北京药物研究所提供的山萘酚作对照测定，始终未检出山萘酚，分析其原因，可能与木贼生长的地理环境有关。
参考文献
1 卫生部药典委员会.中国药典.1995年版1部：47
2 周荣汉.木贼科植物化学成分研究概况.中药通报，1985，10(5)：3
, 百拇医药
3 中国人民解放军211医院.木贼治疗高血压病123例疗效观察.人民军医,1978,(1)：37
4 张世芳等.木贼的药理研究.湖北中医杂志，1980，(5)：52
5 张世芳.木贼降压机制的探讨.湖北中医杂志，1982，(2)：43
6 陶巧凤.高效液相色谱法测定银杏制剂中黄酮含量.中成药，1993，15(12)：14
7 张晓琦.高效液相色谱法测定银杏叶提取物中鉵皮素的含量.色谱.1994，12(4)：302
收稿日期：1999-05-08, http://www.100md.com
单位：咸宁地区中心血站 437000 韩宁涛湖北中医学院
关键词：木贼乙醇提取物；树；解皮素；高效液相色谱法
湖北中医学院学报990314 摘要 本文用反相高效液相色谱法测定木贼乙醇提取物中树 解皮素的含量。采用Zorbax-C18柱，流动相为0.4%磷酸-甲醇(1∶1)，检测波长254nm。样品经甲醇超声波提取，10%硫酸-甲醇(1∶1)水解，定容后进样。用树 解皮素作对照外标两点法定量，线性范围0.2～5μg，相关系数r为0.9993，平均回收率为98.1%。
中国图书分类号 R285.5
Determination of Quercetin in Extraction of
, 百拇医药
Equisetum Hiemale L. by HPLC
Gao Hancheng,etal
(Xianning Blood Bank.Hubei Xianning,437000)
Abstract:A HPLC methold has been developed for the determination of Quercetin in Ethanol Extract of Equisetum hiemale L.Quercetin was separated completely on a zorbax-C18 column,4.6mm×250mm,using a mixture of methanol,water and phosphoric acid (100:99.6∶0.4) as mobile phase,with UV detection at 254 nm.A good linear relationship of standard (quercetin) was found in the range of 0.2～5mg,r=0.9993.The results have shown that the average recovery was 98.1%
, 百拇医药
Key words：High pressure liquid chromatography Quercetin Ethanol extract of Equisetum hiemale L.
木贼系木贼科植物Equisetum hiemale L.的干燥地上部分，属常用中药[1]。近20年来的临床、药理和化学研究表明，木贼除具有“散风热，退目翳”等传统功效外，其乙醇提取物还显示出较明显的降压作用，其降压作用的有效成分为鉵皮素和山萘酚的二糖黄酮甙类化合物[2～5]。为了对木贼所含黄酮类降压有效成分进行更深入的研究，我们采用高效液相色谱仪测定本省产木贼乙醇提取物中鉵皮素含量的方法，木贼乙醇提取物用10%硫酸-甲醇(1∶1)水解后，再用鉵皮素对照品对其酸水解液中鉵皮素进行外标两点法测定含量，由于本方法为样品酸水解定容直接进样测定，故较为简单、快速和准确，可作为木贼黄酮有效部位提取及质量标准方法学研究的重要参考依据。
, 百拇医药 1 仪器与试剂
LC-4A高效液相色谱仪，SPD-2AS紫外检测器，C-R2AX色谱数据处理机(以上均为日本岛津制作所产品)，超声波清洗仪(上海船舶设备研究所)。
鉵皮素对照品(中国药品生物制品检定所提供，081-9304)，木贼乙醇提取物(自制)。
甲醇，硫酸，磷酸(均为分析纯)，水为重蒸水。
2 色谱条件[6～7]
Zorbax-C18(10μ)不绣钢柱(4.6mm×250mm)；流动相为0.4%磷酸-甲醇(1∶1)；流速1.0ml/min；标温32°C；检测波长254nm；10μl进样，分离效果如图1、图2。
, http://www.100md.com
图1 鉵皮素对照品色谱图
图2 样品色谱图
3 供试液的制备
3.1 鉵皮素对照品溶液 取鉵皮素对照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。
3.2 供试品溶液 取木贼乙醇提取物约0.2g，精密称定，置50ml烧瓶中，加入10ml甲醇，超声处理20分钟，再加入10%硫酸10ml，摇匀，水浴回流2小时，冷却至室温，水解液转移至25ml容量瓶中，用甲醇洗涤烧瓶两次(2，2ml)，一并转移至25ml容量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
4 标准曲线的制备
, 百拇医药 分别吸取鉵皮素对照品溶液2μl、5μl、10μl、20μl、30μl、40μl、50μl，按二项下方法进样测定，测定结果及回归方程见表1，图3。
表1 线性测定 进样量
2μl
5μl
10μl
20μl
30μl
40μl
50μl
峰面积积分值
1736
, 百拇医药
4109
8621
18038
29168
40066
50082
回归方程
Y=-651.412+998.897x r=0.9993
图3 标准曲线
测定结果显示，鉵皮素在0.2～5μg范围内呈良好线性关系。宜用外标两点法测定含量。
, 百拇医药
5 重现性考查
按三项2所述方法，取同一批一定量的木贼乙醇提取物，精密称定，制成供试品溶液，按二项下的条件进样测定，进样量10μl，共测5份，测定结果见表2。
表2 重现性考查 样品重(mg)
210.4
211.0
210.0
209.6
209.0
含量(%)
0.183
0.188
, 百拇医药
0.191
0.197
0.184
RSD=2.7%
6 回收率测定
采用加样回收率实验，取同一批已知含量的木贼乙醇提取物，精密称定，分别添加一定量的鉵皮素对照品，按三项2下方法及二项下条件制备出供试品溶液并测定，共测5份，测定结果见表3。表3 回收率测定 编号
样品重量
(mg)
原样含量
(mg)
, http://www.100md.com 对照品加量
(mg)
实测量
(mg)
回收率%
均值(%)
RSD(%)
1
105.3
0.199
0.195
0.388
98.5
, http://www.100md.com
98.1
1.58
2
105.5
0.199
0.195
0.396
100.5
3
105.1
0.192
0.195
0.382
, 百拇医药
98.7
4
104.8
0.197
0.195
0.379
96.4
5
104.5
0.198
0.195
0.380
96.7
, http://www.100md.com
7 稳定性试验
取供试品溶液10μl，按三项2下方法及二项下条件，每隔一段时间测定1次，共测5次，测定结果如表4。表4 稳定性测定 时间(min)
0
30
60
90
120
崎面积积分值
3358
3489
3291
3376
, 百拇医药
3197
测定结果显示，本测定方法在120分钟内稳定。
8 样品测定
按三项2下方法及二项下条件，分别测定3批样品，每次进样10μl，按外标两点法计算含量，测定结果如表5。
表5 样品测定 批号
取样量
(mg)
鉵皮素量
(mg)
含量
(%)
, 百拇医药
平均含量
(%)
1
210.2
0.376
0.179
0.180
210.3
0.382
0.182
2
210.0
0.378
, 百拇医药
0.180
0.178
210.3
0.360
0.175
3
209.8
0.380
0.181
0.179
210.0
0.372
0.177
, 百拇医药
三批样品鉵皮素含量RSD为1.33%
9 讨论
样品的HPLC图谱中显示在21分钟左右还有一个单峰存在，经用银杏提取物的酸水解液进行对照测定，结果与银杏提取物中的异鼠李素的Rf值一致，提示本省产木贼中可能含有异鼠李素，最后确证有待进一步研究。
文献报道木贼含有山萘酚二糖甙[2]，但我们对湖北省产的三批木贼分别进行了酸水解产物与中国医学科学院北京药物研究所提供的山萘酚作对照测定，始终未检出山萘酚，分析其原因，可能与木贼生长的地理环境有关。
参考文献
1 卫生部药典委员会.中国药典.1995年版1部：47
2 周荣汉.木贼科植物化学成分研究概况.中药通报，1985，10(5)：3
, 百拇医药
3 中国人民解放军211医院.木贼治疗高血压病123例疗效观察.人民军医,1978,(1)：37
4 张世芳等.木贼的药理研究.湖北中医杂志，1980，(5)：52
5 张世芳.木贼降压机制的探讨.湖北中医杂志，1982，(2)：43
6 陶巧凤.高效液相色谱法测定银杏制剂中黄酮含量.中成药，1993，15(12)：14
7 张晓琦.高效液相色谱法测定银杏叶提取物中鉵皮素的含量.色谱.1994，12(4)：302
收稿日期：1999-05-08, http://www.100md.com