微波ELISA诊断日本血吸虫病实验条件的初步研究
作者：何海根 顾启章 张宏莹
单位：杭州医学高等专科学校(310000)
关键词：
温州医学院学报990121 微波辐射能使溶液中的极性分子(如抗原、抗体等)发生高频振荡而快速运动，从而加速抗原抗体的结合反应，大大缩短其反应时间，并减少非特异性结合[1]。目前，微波已经广泛应用于免疫组化、血清学反应和病理技术中。笔者将微波就用于诊断日本血吸虫病的间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)中，发现明显缩短了ELISA反应时间，并获得良好效果(另文)。本文就微波ELISA诊断血吸虫病的实验条件进步初步研究。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂：2D-Ⅱ型医用微波炉系上海中达医学应用研究所产品；血吸虫病抗体快速测定试验盒(ELISA法)由中国医学科学院寄生虫研究所提供。
, http://www.100md.com
1.2 血清标本：江西波阳县粪孵阳性急性血吸虫病(以下简称急血)患者血清43份，嘉兴晚期血吸虫病(以下简称晚血)患者血清31份，杭州市区正常人血清61份。
1.3 微波ELISA(Microwave irradiation ELISA)：将1∶50被检血清100ul加入血吸虫病抗体快速测定盒的抗原孔，置微波辐射后，取出，经水洗、拍干，滴加1∶1000酶标羊抗人IgG100ul。再次置微波炉进行微波辐射(辐射功率和时间均与第一次相同)，取出后经水洗、拍干，滴加底物显色。每块抗原板设阳性和阴性参考血清对照。在阳性参考血清孔显色的情况下，试验孔显色颜色并深于阴性参考对照者判为阳性。
2 结果与讨论
2.1 不同微波辐射时间对微波ELISA检测血吸虫病抗体敏感性的比较见表1。
表1 急血标本检测结果 微波辐射时间
, 百拇医药
(s/min)
急血患者血清
χ2
标本总数(份)
阳性数
阳性率(%)
15/0.5
41
15*
36.6
30/1
41
40
, 百拇医药
97.6
60/2
41
40
97.6
97.62
90/3
41
40
97.6
120/4
41
40
, 百拇医药
97.6
*与其它各组比较均为P<0.01。
在41份急血标本中随机抽取20份以快速ELISA法(按快速ELISA方法进行)测其抗体滴度后，按效价稀释标本再以不同的微波辐射时间进行微波ELISA检测，并对31份慢血标本进行检测，其结果见表2。
表2 不同微波辐射时间的微波ELISA对急血患者稀释血清及晚血患者血清的检测结果 微波辐射
时间(s/min)
急血患者稀释血清
晚血患者血清
标本总数
(份)
, 百拇医药
阳性数
阳性率
(%)
标本总数
(份)
阳性数
阳性率
(%)
15/0.5
20
6
30*
31
, 百拇医药
7
22.6
30/1
20
15
75
31
14
45.2
60/2
20
20
100
, http://www.100md.com 31
20
64.5
90/3
20
15
75
31
16
51.6
120/4
20
9
45
, http://www.100md.com
31
8
25.5
χ2
26.81
15.90
与60s/2min组和120s/4min组比：*P<0.05
上述结果表明，在微波ELISA检测血吸虫病抗体的实验中，当功率为330W时，辐射时间以30s/1min～90s/3min为宜，笔者建议选用60s/2min。进一步延长或缩短时间，使实验敏感性降低。微波辐射时间过短，则抗原抗体不能充分作用；微波辐射时间太长，可能由于微波作用导致反应体系中温度升高而使抗原抗体变性而失去活性(或活性降低)。
, 百拇医药
41份急血标本与31份晚血标本的检测结果不一致，是由于急血患者血清中抗体滴度明显高于晚血患者所致。笔者用快速ELISA[3]对于30份急血标本和20份晚血标本和抗体滴度进行检测，结果有70%(21/30)急血患者血清抗体效价均在1∶400以上，而晚血患者血清抗体效价均≤1∶200。因此，将20份急血标本作适度稀释后，再以不同时间微波辐射进行微波ELISA检测，其结果与晚血标本的检测结果基本一致。经统计学处理后，结果显示相同。
2.2 不同酶结合物在微波ELISA测试中的比较
以功率330W，微波辐射时间性60s/2min对急血标本43份，晚血标本31份，以及健康人血清标本61份，分别用酶标羊抗人IgG和酶标金葡蛋白A作为酶蛋的结合物进行测试，其结果见表3。
表3 不同酶结合物在微波ELISA测试中的比较 血清标本来源
, http://www.100md.com
检测例数
酶结合蛋白(阳性率%)
羊抗人IgG
金葡菌蛋白A
急血
43
40(93.9)
41(95.3)
晚血
31
20(64.5)
22(68.2)
健康人
, 百拇医药
61
2(3.3)
1(1.6)
结果表明这两种酶结合蛋白对实验结果的影响差异均无显著性(P>0.05)，说明这两种酶结合蛋白均能用于微波ELISA中。
2.3 底物显色时间与结果观察时间的控制
在功率330W，微波辐射时间60s/2min的微波ELISA检测中，加入底物后，5min内阳性参考血清对照及阳性孔全部显色，而阴性参考不显色；在加入底物8min时，阴性参考血清开始显色，颜色并逐渐加深。根据这一结果，笔者认为在本实验系统中观察时间宜定在5min左右，不宜超过6min，以免误判结果。
抗体检测是血吸虫病诊断、流行病学调查和疫情监测的重要手段。环卵沉淀试验、间接血凝试验、间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)已被广泛应用，特别是酶联免疫试验的敏感性、特异性已被国内外公认。严自助等[2]用快速ELISA检测血吸虫病抗体获得很好的结果，不但大大地缩短了试验的时间，而且试验的敏感性也达到94%、Youden指数达到0.9。我们将微波应用于诊断血吸虫病的快速ELISA中，并将微波ELISA与快速ELISA试验对血吸虫病检测进行比较，结果显示两法均有较好的敏感性和特异性，差异无显著性，微波ELISA的试验时间亦缩短(另文)。
3 参考文献
[1] Leong AS,Milios J,et al.Immunochmical staining by microwaveso J Pathol,1990,161(4)∶327
[2] 严自助，王文，吕再婴等.血吸虫病抗体的快速测定.中国寄生虫与寄生虫病杂志，1996，14(4)∶302
(收稿：1998-07-29，修回：1998-12-10), 百拇医药
单位：杭州医学高等专科学校(310000)
关键词：
温州医学院学报990121 微波辐射能使溶液中的极性分子(如抗原、抗体等)发生高频振荡而快速运动，从而加速抗原抗体的结合反应，大大缩短其反应时间，并减少非特异性结合[1]。目前，微波已经广泛应用于免疫组化、血清学反应和病理技术中。笔者将微波就用于诊断日本血吸虫病的间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)中，发现明显缩短了ELISA反应时间，并获得良好效果(另文)。本文就微波ELISA诊断血吸虫病的实验条件进步初步研究。现报告如下。
1 材料和方法
1.1 仪器与试剂：2D-Ⅱ型医用微波炉系上海中达医学应用研究所产品；血吸虫病抗体快速测定试验盒(ELISA法)由中国医学科学院寄生虫研究所提供。
, http://www.100md.com
1.2 血清标本：江西波阳县粪孵阳性急性血吸虫病(以下简称急血)患者血清43份，嘉兴晚期血吸虫病(以下简称晚血)患者血清31份，杭州市区正常人血清61份。
1.3 微波ELISA(Microwave irradiation ELISA)：将1∶50被检血清100ul加入血吸虫病抗体快速测定盒的抗原孔，置微波辐射后，取出，经水洗、拍干，滴加1∶1000酶标羊抗人IgG100ul。再次置微波炉进行微波辐射(辐射功率和时间均与第一次相同)，取出后经水洗、拍干，滴加底物显色。每块抗原板设阳性和阴性参考血清对照。在阳性参考血清孔显色的情况下，试验孔显色颜色并深于阴性参考对照者判为阳性。
2 结果与讨论
2.1 不同微波辐射时间对微波ELISA检测血吸虫病抗体敏感性的比较见表1。
表1 急血标本检测结果 微波辐射时间
, 百拇医药
(s/min)
急血患者血清
χ2
标本总数(份)
阳性数
阳性率(%)
15/0.5
41
15*
36.6
30/1
41
40
, 百拇医药
97.6
60/2
41
40
97.6
97.62
90/3
41
40
97.6
120/4
41
40
, 百拇医药
97.6
*与其它各组比较均为P<0.01。
在41份急血标本中随机抽取20份以快速ELISA法(按快速ELISA方法进行)测其抗体滴度后，按效价稀释标本再以不同的微波辐射时间进行微波ELISA检测，并对31份慢血标本进行检测，其结果见表2。
表2 不同微波辐射时间的微波ELISA对急血患者稀释血清及晚血患者血清的检测结果 微波辐射
时间(s/min)
急血患者稀释血清
晚血患者血清
标本总数
(份)
, 百拇医药
阳性数
阳性率
(%)
标本总数
(份)
阳性数
阳性率
(%)
15/0.5
20
6
30*
31
, 百拇医药
7
22.6
30/1
20
15
75
31
14
45.2
60/2
20
20
100
, http://www.100md.com 31
20
64.5
90/3
20
15
75
31
16
51.6
120/4
20
9
45
, http://www.100md.com
31
8
25.5
χ2
26.81
15.90
与60s/2min组和120s/4min组比：*P<0.05
上述结果表明，在微波ELISA检测血吸虫病抗体的实验中，当功率为330W时，辐射时间以30s/1min～90s/3min为宜，笔者建议选用60s/2min。进一步延长或缩短时间，使实验敏感性降低。微波辐射时间过短，则抗原抗体不能充分作用；微波辐射时间太长，可能由于微波作用导致反应体系中温度升高而使抗原抗体变性而失去活性(或活性降低)。
, 百拇医药
41份急血标本与31份晚血标本的检测结果不一致，是由于急血患者血清中抗体滴度明显高于晚血患者所致。笔者用快速ELISA[3]对于30份急血标本和20份晚血标本和抗体滴度进行检测，结果有70%(21/30)急血患者血清抗体效价均在1∶400以上，而晚血患者血清抗体效价均≤1∶200。因此，将20份急血标本作适度稀释后，再以不同时间微波辐射进行微波ELISA检测，其结果与晚血标本的检测结果基本一致。经统计学处理后，结果显示相同。
2.2 不同酶结合物在微波ELISA测试中的比较
以功率330W，微波辐射时间性60s/2min对急血标本43份，晚血标本31份，以及健康人血清标本61份，分别用酶标羊抗人IgG和酶标金葡蛋白A作为酶蛋的结合物进行测试，其结果见表3。
表3 不同酶结合物在微波ELISA测试中的比较 血清标本来源
, http://www.100md.com
检测例数
酶结合蛋白(阳性率%)
羊抗人IgG
金葡菌蛋白A
急血
43
40(93.9)
41(95.3)
晚血
31
20(64.5)
22(68.2)
健康人
, 百拇医药
61
2(3.3)
1(1.6)
结果表明这两种酶结合蛋白对实验结果的影响差异均无显著性(P>0.05)，说明这两种酶结合蛋白均能用于微波ELISA中。
2.3 底物显色时间与结果观察时间的控制
在功率330W，微波辐射时间60s/2min的微波ELISA检测中，加入底物后，5min内阳性参考血清对照及阳性孔全部显色，而阴性参考不显色；在加入底物8min时，阴性参考血清开始显色，颜色并逐渐加深。根据这一结果，笔者认为在本实验系统中观察时间宜定在5min左右，不宜超过6min，以免误判结果。
抗体检测是血吸虫病诊断、流行病学调查和疫情监测的重要手段。环卵沉淀试验、间接血凝试验、间接法酶联免疫吸附试验(ELISA)已被广泛应用，特别是酶联免疫试验的敏感性、特异性已被国内外公认。严自助等[2]用快速ELISA检测血吸虫病抗体获得很好的结果，不但大大地缩短了试验的时间，而且试验的敏感性也达到94%、Youden指数达到0.9。我们将微波应用于诊断血吸虫病的快速ELISA中，并将微波ELISA与快速ELISA试验对血吸虫病检测进行比较，结果显示两法均有较好的敏感性和特异性，差异无显著性，微波ELISA的试验时间亦缩短(另文)。
3 参考文献
[1] Leong AS,Milios J,et al.Immunochmical staining by microwaveso J Pathol,1990,161(4)∶327
[2] 严自助，王文，吕再婴等.血吸虫病抗体的快速测定.中国寄生虫与寄生虫病杂志，1996，14(4)∶302
(收稿：1998-07-29，修回：1998-12-10), 百拇医药